JPH0264459A - 結合可能の物質を測定する方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、試料溶液を少なくとも３種の受容体Ｒ１，Ｒ
２及びＲｔ（そのうちのＲ２及びＲ２は互いに結合可能
であり、Ｒ３は測定すべき物質と特異的に結合可能であ
る）と共に定温保持し、反応に際して生じる凝集を測定
することによって特異的に結合可能の物質を測定する方
法、並びにこの方法に適用される試薬に関する。

従来の技術 体液及び組織内には、特異的結合パートナ−と結合可能
でありまた特定の疾病又は人体の健康状態に関するパラ
メータとして利用される極めて多くの物質が存在する。

これには特に例えばホルモンのようなハプテン、腫瘍標
識のような蛋白質、蛋白質ホルモン及びウィルス蛋白質
並びに抗体が属する。また薬物による治療を監視するた
めにはしばしば布中の薬物を測定する必要がある。これ
らの物質はしばしば極めて僅少な量で存在するにすぎな
いことから、これを検出するためには免疫検定の原理に
基づく方法が使用される。これには多くの方決が存在す
る、種々の免疫的測定法は均−法と不均一法とに分類す
ることができる。不均一法では常に、標識成分の結合部
分を非結合部分から分離するための固相反応が関与する
。この方法様式の場合標識は良好に決定することができ
るが、不均一系反応が長時間に及ぶことは欠点である。

均−法では結合標識と非結合標識とは分離されず、従っ
て結合標識と非結合標識との鑑別は他の方法によって行
われなければならない。

これに対しては種々の可能性が存在する。すなわち例え
ば測定すべきハプテン又は抗原に結合されるか又は測定
すべき物質によって活性化されている場合にのみ、その
酵素活性を維持する複合酵素を標識として使用すること
ができる、別の可能性は、その蛍光が測定すべき物質へ
の結合によって他の波長領域に移るが又はその偏光を変
える蛍光物質を標識として使用することにある。

これらの公知方法の欠点は特に、試料がしばしばテスト
阻害成分を含み、従ってこれらの物質を除去するための
試料前処理が必要であるという点にある。また各パラメ
ータに対する費用の嵩む最適化処理が必要であり、例え
ば酵素をパラメータに応じて改変しなければならない。

更に欧州特許出頭公開第７９９６２号明ｍｓがらは、測
定すべきハブテンを含む溶液をハブテンｍｌラテックス
粒子又はハプテン被覆アルブミンと接触させる方法が公
知である。ハブテンと結合可能の抗体を加えることによ
って凝集反応が生じる。ラテックス粒子又はアルブミン
に結合したハブテンは試料中に含まれるハプテンと競合
することから、試料中に含まれるハプテン埴が多いほど
、凝集反応は小さくなる。この方法の欠点は、測定すべ
き各物質に対して特定の粒子を使用しなければならずま
た各パラメータを個々に最適化する必要のあることであ
る。

凝集反応を分析評価することによって行う蛋白質の検出
法は西ドイツ国特許出願公開第２７４９９５６号明細書
から公知である。この場合測定すべき物質に対する抗体
は凝集可能の粒子に直接結合される。しかしこの結合に
よって抗体の反応性は損なわれる可能性がある。更にこ
の種の測定法はりウマチ因子による障害に対して敏感で
ある。

これらの公知のすべての拮抗的均一凝集免疫検定法の欠
点は、原料に対して著しく費用の嵩むパラメータ特異性
に基づく最適化処理をしなければならないことである。

これらのすべてのテストに際しては最も好ましい鑑別及
び最適感度に関して互いに対立する要件が存在する。そ
れというのも一方では粒状試薬の濃度を制限することに
よって、試料との競合反応を可能としなければならない
が、他方ではまた単位時間当たりに十分な信号変化を得
るために粒状試料は高濃度化及び高標識化されていなけ
ればならないからである。これらの要求の調整は限定さ
れた感度及び障害感受性をもたらし、これは特殊な試料
前処理によってのみ除去し得るにすぎない 発明が解決しようとする課題 従って本発明の課題は、物質の検出を高感度でかつ正確
に実施することを可能としまた上記の諸欠点を有さない
、均一測定法を提供することにある。

課題を解決するための手段 この課題は、受容体Ｒ１として特異的に結合する対物質
の一方のパートナ−Ｐと、測定すべき物質に相当するか
又はその誘導体でかつ測定すべき物質のエピトープを少
なくとも１個有する物質Ｓとからなる接合体を、またＲ
２としてＰに対する少なくとも２個の結合部位を有する
受容体を、更にＲ５として少なくとも２個の結合部位を
有しかつそのうちの少なくとも一方が測定すべき物質又
はＳのエピトープと特異的に結合する受容体をそれぞれ
使用することを特徴とする形式の、試料溶液を少なくと
も３種の受容体Ｒ。

、Ｒ２及びＲ３（そのうちのＲ，及びＲ２は互いに結合
可能であり、Ｒ５は測定すべき物質と特異的に結合可能
である）と共に定温保持し、反応に際して生じる凝集を
測定することによって特異的に結合可能の物質を測定す
る方法によって解決される。

本発明方法は体液又は組織抽出物中の、特異的に結合す
ることのできる実際にすべての検出すべき物質を測定す
るのに適しており、この場合低濃度の物質も高濃度の物
質と同様良好に検出することができる。この方法の感度
及び精度は従来公知の方法に比べて改良されている０本
発明は簡単な試薬で迅速かつ正確な測定を実施する可能
性を提供する。

本方法は特に−価の特異的に結合可能の物質を測定する
のに適している。この場合−僅の物質としては特異的に
結合可能のパートナ−に対して唯一の結合部位を有する
物質を意味する。

この例としてはハプテン例えば薬物を挙げることができ
る。同様に特異的に結合可能のパートナ−に対する数個
の結合部位を有する物質、例えばＨＣＧ又はＴＳＨのよ
うな蛋白質ホルモン、抗原及び蛋白質、ＣＥＡのような
腫瘍標識、ウィルス蛋白質及び抗体を測定することもで
きる。

本明細書においてエピトープとは、他の物質との特異的
結合をもたらすことのできる結合部位を意味する。エピ
トープの例は抗原及びハプテン上の抗原決定基又は蛋白
質上の特異的結合部（ｌである。

このため試料溶液を３種の受容体Ｒ０、Ｒ２及びＲ３と
共に定温保持する。この場合受容体Ｒ１及びＲ２は互い
に結合可能であり−Ｒ，は測定すべき物質と特Ｗ的に結
合可能である６本発明による方法てて実施することので
きる種々の反応原理は第１図に示されている。優れた一
方法は第１ａ図で示した実施態様であるにの場合試料溶
液に互いに特異的に結合する対物質の一方のパートナ−
Ｐと測定すべき物質Ｓとからなる接合体である受容体Ｒ
＋Ｉびに測定すべき物質と特異的に結合可能の受容体で
あるＲ１を加える。この場合この溶液中でＲ１の部分Ｓ
及び測定すべき物質はＲＳへの結合に関して競合する。

Ｒ３が例えば二価の抗体である場合には次の複合体が生
じる：Ｒ３：その双方の抗体結合部位にそれぞれＲ，が
Ｓを介して結合している、 Ｒ３：その双方の抗体結合部位に測定すべき物質が結合
している、及び Ｒ３：その一方の抗体結合部位に測定すべき物質がまな
その他方の抗体結合部位にＲ３がＳを介して結合してい
る。

他の２つの受容体と同時にか又は一定の時間を置いた後
に、Ｐに対する結合部位を少なくとも２個、有利には多
数有する受容体Ｒ２を加える、これにより受容体Ｒ２に
Ｐを介して受容体Ｒ１が結合する。溶液中に存在する複
合体のうち、少なくとも１個の受容体Ｒ１を結合して有
する複合体はＲ２に結合可能であり、Ｒ２に２個の受容
体Ｒ２が結合している複合体は、再び光度計により検出
可能の混濁又は混濁変化を生ぜしぬる凝集を生じる可能
性がある。溶液中に含まれる測定すべき物質の量が多い
ほど、Ｒ，の結合数は少なくなり、凝集発生率は低下し
、また混濁増加は僅かになる。従って凝集の規模は測定
すべき物質に対する間接的な尺度である。これは較正曲
線を介して分析評価することができる。

実施方法ｂ）は二価の物質例えば抗体を検出するのに利
用する。その原理は方法ａ）の場合と同じである。この
場合にもＲ３の２つの結合部位にそれぞれ１個のＲ，が
結合する複合体が凝集をもたらす。

方法Ｃ）ではＲ３として、測定すべき物質と特異的に結
合可能の受容体と特異的に結合可能の対物質の一方のパ
ートナ−とからなる接合体を使用する。試料溶液をＲ，
及びＲ３と共に定温保持した場合、測定すべき物質及び
Ｒ１はＲ３への結合に関して競合する。この場合受容体
Ｒ，又は測定すべき物質の分子のいずれか一方がＲ１に
結合可能である。Ｒ２との定温保持後に受容体Ｒ３の部
分ＰがＲ２に結合する。Ｒ１の他の結合部３位に測定す
べき物質が結合している場合には、Ｒ２を介しての網状
化は不可能である。しかしＲ５の他の結合部位に接合体
Ｒ１が結合している場合には、受容体Ｒ１はＲ２の第２
結合部位に結合し、これにより網状化する。この実施例
の場合にも溶液中に測定すべき物質が多数存在している
ほど、Ｒ，の結合数は少なく、従って７ａ！Ａ結合はそ
れに応じて少なくなる。

実施方法ｄ）は実施方法ａ）の変法であり、この場合受
容体Ｒ３としては測定すべき物質又はＳに対する２つの
結合部位以外にもう１つ別の結合部位をＰの形で有する
受容体を使用する。

試料溶液をＲ，及びＲ５と共に定温保持した場合、方法
ａ）におけると同様に同じ複合体を生じるしかし方法ａ
）とは異なり、その２つの抗体結合部位にＲ，が結合さ
れている受容体Ｒ５並びに１つの抗体結合部位にＲ１が
また他方の抗体結合部位に測定すべき物質が結合してい
る受容体Ｒ１ちまた凝集をもたらすことができる。従っ
てこの実施方法は、極めて高度に濃縮されている物質を
検出するのに特に適している。

本発明により定義される方法原理には多くの実施方法が
存在する。その各々の場合に少なくとも３個の受容体が
必要である。測定すべき物質は特異的に結合することの
できるすべての物質であり、特に先に定義したようにハ
プテン、−価、二価又は多価抗原、抗体又は蛋白質であ
ってよい。

第１受容体Ｒ０としては、特異的に結合可能の対物質の
パートナ−Ｐと、測定すべき物質と同じであるか又はそ
の誘導体でありかつ測定すべき物質のエピトープを少な
くとも１個有する物質Ｓとからなる接合体を使用する。

互いに特異的に結合する対物質はそれ自体公知である。

適当な結合対物質（Ｐ　　Ｒ２）は特にビオチン−スト
レプトアビジン又はアビジン；ハプテン−抗体：抗原−
抗体；コンカバリンー抗体：Ｗ−レクチン：ハプテン−
結合蛋白質例えばチロキシン結合性グロブリン及びチロ
キシン又はオリゴペプチド−抗体である。

結合対物質としてはストレプトアビジン又はアビジン−
ビオチンを使用するのが特に有利である。受容体Ｒ１は
ビオチンを含むことが特に好ましい。

受容体Ｒ１の部分Ｓは未変化の測定すべき物質と一致す
るものであるのが有利である。測定すべき物質の誘導体
又は測定すべき物質の１部、例えば蛋白質エピトープを
使用することもできる。実際には部分ＳがＲ３と結合可
能であることが重要であるにすぎず、この場合Ｓ及び測
定すべき物質が同じ結合力でＲ３に結合することは必ず
しも必要ではない。

接合体の製造はそれ自体公知の方法で行う（例えば「ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・ビオケミストリーＪ　
（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｖ、）、１３１（１９８０
）　、　３３３−３３１１１と同様にして）。

本発明方法にとって必要な第２受容体Ｒ２はＰに対する
少なくとも２個の結合部位を有しまた有利には特異的に
結合可能の対物質のＰに対する相補性パートナ−を多数
有する。受容体Ｒ２は反応に際して生じる複合体の凝集
を媒介する。

反応系中には特異的に結合可能の対物質の他のパートナ
−が多数存在することがら、試薬溶液中に元々存在する
偶少量の、上記パートナ−と結合可能の物質が障害をも
たらすことはない。

受容体Ｒ２はＰに対する数個の結合部位を元々有する物
質、例えばストレプトアビジン又は抗体であってよい、
受容体Ｒ２は多価でありかっＰに対する結合部位を多数
有するか、又は特異的に結合する対物質の、Ｐに対する
相補性パートナ−のポリマー例えばポリストレプトアビ
ジンであってもよい。この場合側々のパートナ−は互い
に直接結合されているか又は架橋を介して結び付けられ
ている。この種のポリマーを製造する方法は当業者の熟
知するところであり、従ってここでは詳述しない。

他の実施！ＦＡａ！では受容体Ｒ２は、Ｐに対して相補
性で特異的に結合するパートナ−が多数結合している担
体物質からなる。これらの担体物質としては通常５０〜
１ｏｏｏｎ嘗の大きさの粒子を使用することがきる。適
当な物質はポリスチロール、微粉砕二酸化珪素、赤血球
又は網状化アルブミンである。この粒子を特異的に結合
するパートナ−で被覆する処理は当業者にとって周知の
方法で行う、この方法は例えば欧州特許第７３６１１号
明細書及び米国特許第４７０３０１８号明細書に記載さ
れている。

こうして被覆又は重合された受容体Ｒ２は本発明方法に
おいて万能的に使用することができ、従ってパラメータ
特異性ではない。

本発明方法を実施するにあたって重要なことは、受容体
Ｒ１がＲ２に対する唯一の結合部位を有すること、すな
わち各受容体Ｒ１は１個のＲ２とのみ反応し得ることで
ある。これは本質的な前提条件である、それというのも
さもなければＲ２は単に受容体Ｒ１によって網状化し得
るにすぎず、その結果検出すべき物質Ｓに起因しない凝
集が起こる恐れがあるからである。

本発明の本質である第３の成分は、少なくとも２個の結
合部位を有しかつそのうちの少なくとも１つは測定すべ
き物質又はＳのエピトープと特異的に結合する受容体Ｒ
３である。この受容体はその都度測定すべき物質に応じ
て選択される。これには多数の受容体が適用される。ハ
ブテン、蛋白質、ＤＮＡ又は糖を測定するには特に、こ
れらの物質又はその断片に対する抗体又は他の受容体例
えば天然産の結合蛋白質例えばチロキシン結合グロブリ
ンを使用するのが有利である。同様にＤＮＡを測定する
には相補性ＤＮＡを受容体Ｒ３として使用することが有
利である。

測定すべき物質がＲ１に対する結合部位を１つしか有さ
ない場合、滑れた１実施態様では受容体Ｒ１は測定すべ
き物質又はＳのエピトープに対する１個の結合部位の他
に、特異的に結合する対物質のパートナ−に対する先の
ものとは異なる結合部位を、同様にＲ１に対して使用し
たパートナ−Ｐの形で有する。更にＲ５は特異的に結合
する対物質のパートナ−Ｐと、測定すべき物質又はＳの
エピトープと特異的に結合する唯一の結合部位を有する
物質とからなる接合体、特に有利には測定すべき物質又
はＳのエピトープと特異的に結合するＦａｂ−［ｉ片と
Ｐとからなる接合体であるか、又は特異的に結合する対
物質のパートナ−Ｐと測定すべき物質又はＳのエピトー
プに対する２個の結合部位を有する受容体とからなる接
合体が有利である。

同様に受容体Ｒ１は、測定すべき物質又はＳのエピトー
プと結合する２ＩＩＩの同じ結合部位を有していてもよ
い。受容体Ｒ３として適当なものは例えばモノクローナ
ル又はポリクローナル抗体Ｆ　ａ　ｂ　２−Ｕｒ片又は
、Ｆａｂ−断片と特異的に結合する対物質のパートナ−
とからなる接合体である。受容体Ｒ３が結合部位を２個
以上有する場合には、抗体、Ｆ（ａｂ）２−又はＦ（ａ
ｂ’）２−断片とパートナ−Ｐとの接合体を使用するこ
とができる。この場合には特にビオチン塞化した抗体及
び、測定すべき物質と特異的に結合可能の抗体断片が適
している。

他の実施態様では受容体Ｒ３は測定中に初めて、例えば
ＴＢＧに対する抗体及び２分子のＴＢＧからか又はＦａ
ｂ−［ｉ片に対する抗体及び２個のＦａｂ−断片から形
成される。

この方法は一工程又は数工程で実施することがきる。そ
の評価は凝集の規模を測定することによって行う。この
方法は公知である６例えば測光による混濁度の測定、比
濁分析法による散乱光の測定、粒子計数又は光子−柑関
一分光法（ＰＣ３）が適している。

受容体の各々及び測定すべき物質はそれぞれこれらに対
して特定された反応パートナ−と特異的に反応し得るに
すぎないことから、すべての受容体及び試料を一緒に定
温保持し、この方法を単一工程で実施することが可能で
ある。これは特に該方法を１つの自動分析装置で実施す
る際に有利である。

濃度が極めて低いか又は高い物質を検出するには、多工
程法が有利である。試料溶液中に高濃度で存在する物質
を検出する場合には次に記載する実施態様が好ましい、
この場合まず受容体Ｒ１を受容体Ｒ３と予め反応させる
。その際測定すべき物質に相応する受容体Ｒ１の部分Ｓ
及びＲ３が互いに反応する０次いで試料溶液を加える。

この時点で試料溶液中に存在する測定すべき物質が、す
でに結合している受容体Ｒ１をその結合状態から解除す
る。試料溶液中には測定すべき物質が多量に存在するこ
とから、このＷ換反応は十分な速度で進行する。引続き
受容体Ｒ２を加え、その後に混濁度の増加を測定する。

この形式のテストの感度は実際に鈍いが、高濃度の試料
に対しては極めて適している。

本発明方法のもう１つの優れた実施態様は極めて低濃度
の物質を検出するのに適している。

例としてはホルモン及び薬物を挙げることができる。こ
の場合まず受容体Ｒ２を受容体Ｒ３と予め混合し、次い
で試料を加える。その際試料中に存在する測定すべき物
質が受容体Ｒ１と反応する、Ｗ集はまだ起こらない、そ
れというのも受容体Ｒ２への結合を生ザしぬる受容体Ｒ
，がまだ存在しないからである０次いで受容体Ｒ１とま
た受容体Ｒ２と結合可能の受容体Ｒ７を加える。この時
点で一定の時間を置いた後に混濁度の増加を測定する。

この方法の感度は極めて高い。

同様に平均的な濃度のパラメータに対しては完全に、拮
抗性のテスト法が適している。この場合には同時に受容
体Ｒ１、受容体Ｒ５及び試料溶液を定温保持する。この
場合測定すべき物質及び受容体Ｒ１の接合体中に含まれ
る部分Ｓは受容体Ｒ１への結合に関して競合する。受容
体Ｒ２の添加後回びその凝集を測定する。

本発明方法のこの方法は、ハプテンに対して特異性の蛋
白質と結び付くことのできるハプテンを検出するのにも
適している。この場合結合蛋白質はハプテンに対する結
合部位を１個有するだけである。この例は、チロキシン
結合性蛋白質によって時宜的に結合されるチロキシンで
ある。

これらのすべての方法はＭｆｌｌ液中で実施するのが有
利である。この方法に対する緩衝剤系はそれ自体公知で
ある。特に適当なものはＧＯＯＤＭ街剤及び燐酸塩緩衝
剤である。

本発明により、簡単かつ迅速に実施することができまた
測定すべき物質の濃度との関連において測定信号を生じ
る方法が堤供される。免疫拮抗性に対して決定的な系及
び信号発生系は分けられていることから、本発明によれ
ば検出感度は高められる。その結果簡単な試薬で低濃度
のハプテンを迅速かつ正確に定量的に測定することがで
きる。

本発明の他の対象は、特異的に結合する対物質の一方の
パートナ−Ｐと、測定すべき物質に相当するか又はその
誘導体でかつ測定すべき物質のエビトー１を少なくも１
個有する物質Ｓとからなる接合体である受容体Ｒ１と、
Ｐに対する少なくとも２個の結合部位を有する受容体Ｒ
２と、少なくとも２個の結合部位を有し、そのうちの少
なくとも一方が測定すべき物質又はＳのエピトープと特
異的に結合する受容体Ｒ５とを含むことによって特徴づ
けられる、特異的に結合可能の物質を測定する試薬に関
する。

本発明によるこの試薬は優れた１実施態様では個々の受
容体Ｒ１、Ｒ２及びＲ３を物理的に互いに独立して含む
ことができる。他の実施態様では受容体Ｒ，及びＲ５を
予め混合することができ、この場合試薬はＲ１及びＲ３
の混合物と受容体Ｒ２とを物理的に互いに独立して含む
。同様に受容体Ｒ２及びＲ５を予め混合することもでき
、この場合には試薬はＲ２及びＲ１の混合物並びに物理
的にこの混合物から分離されているＲ１を含む。

この試薬は体液及び組織抽出物中の多数のパラメータを
測定するのに適している。

優れた１実施Ｒａ！では試薬は付加的にＭ街物質を含む
、特に有利にはこの試薬は燐酸塩緩衝剤及びＧＯＯＤ−
Ｗｉ街剤を含む。

実施例 次に本発明を図面及び実施例に基づき詳述する。

第１図は本発明方法の種々異なる優れた実施例の反応原
理を示す略示図である。

図示したすべての方法において受容体Ｒ２はＰに対する
２個の結合部位を有する。受容体Ｒ１としてはそれぞれ
測定すべき物質とパートナ−Ｐとからなる接合体を使用
する。

第１ａ図は受容体Ｒ３に対する結合部位を１個有する物
質を検出するのに適した方法を示すものである。

この場合受容体Ｒ３としては測定すべき物質に対して二
価の受容体を使用する。

方法１ｂ）は二価の物質（例えば抗体）を測定するのに
使用される。受容体Ｒ５としては測定すべき物質と特異
的に結合可能の二価の受容体を使用する。

方法１ｃ）は−価の物質を検出するのに適している。こ
の場合受容体Ｒ３としては、測定すべき物質に対して１
個の結合部位を有する受容体とパートナ−Ｐとからなる
接合体を使用する。

方法１ｄ）は−価の物質を検出するのに適している。受
容体Ｒ３としては、測定すべき物質に対して２個の結合
部位と１個のパートナ−Ｐとを有する接合体を使用する
。

例　１ ａ）　ストレプトアビジン−ラテックスの製造濃度２　
ｍｇ　／　Ｎ１のストレプトアビジンをイミダゾール緩
衝剤１５■モル／（１（ｐＨ７，５、ＮａＣ１１００＋
Ｅル／ｇ）中で、濃度２重量％のクロルメチルスチロー
ル粒子（ラテックス、ｄ　＝　７０μｍ、米国特許第４
７０３０１８号明細書に相応）と−緒に、５５℃で２４
時間定温保持し、攪拌する１反応混合物を２００００　
Ｕｐ■で６０分間遠心分離した後、上澄みを傾瀉し、沈
殿をグリシン−緩衡剤２００■モル／１（ｐＨ７，５、
牛の血清アルブミン０．５％）に収る。適当に希釈する
ことによって１重量％のストレプトアビジン−ラテック
ス試薬を製造する。

ｂ〉　ハプテン−ビオチン−接合体の製造このためｎ−
プチルオキシ力ルポニルーテトラヨードチロニン及び１
−メチル−３−（３゜カルボキシアロビル）−キサンチ
ン（西ドイツ国特許出願公告第２８０５９６１号明細書
）をペンタメチレンジアミンを介してビオチンと、Ｅｕ
ｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、”＋３１（１９８０）　、　
３３３−３３８に記載されているようにして結合させる
。その際Ｔ４ビオチンー接合体が得られる。同様にして
テオフィリンをビオチンに結合する。

例　　２ Ｔ４の測定 燐酸塩緩衝剤０．１モル／β、ＰＨ７，５、＋２％ポリ
エチレングリコール４００００　　　９００μρ試料（
水性Ｔ４−標準）　　　　　　　　２０μ（Ｔ４に対す
るポリクローナル抗体のＯ，１ｍｇ／耐溶液　　　　　
　　　　　　　　　２０μｍ１％ラテックス試薬（例１
）　　　　２０μρからなる試薬を３７℃で５分間定温
保持し、引続き濃度１０−６七ル／個のＴ４とビオチン
とからなる接合体２０μβを加える。

混濁度の増加動向を測定し、吸光度の変化を単位時間（
５分間）当たり　４０５ｎｍで測定した。

その際次の測定値が得られた： 第１表 試料（ｎｇ／　ｙｄ　　Ｔ　４　）　　　　　ｍＥ／　
５分例　　３ テオフィリンの測定 トリス−緩衝剤　１００■モル／β、ＰＨ７，５３００
μ１ １％ラテックス試薬（例１ ７μｍ テオフィリンに対するポリクローナル抗体（Ｆａｂ２濃
度５ｍｇ／Ｍ１）　　　　　　　−７μ、Ｒを混合する
ことによって試薬を製造し、３７℃で５分間定温保持す
る。引続きテオフィリンとビオチンとからなる接合体５
　Ｘ　１０−’モル／ＩＩを加え、吸光度変化を４．２
分の時間差で４５Ｏｎｍで測定する。結果は第■表に示
す。

第■表 試料（ｕＭ／ｆｆラオフィリン） ０．５ ２．５ １２．５ ｍＥ／　４．２分 例　　４ 公知技術水準との比較 本発明方法を欧州特許第７３６１１号明細書に相応する
方法と比較した。被覆した担体として、担体当たりＴ４
−４分子を含むストレプトアビジンを使用した。

この担体は、Ｔ４とビオチンとからなる接合体（濃度１
Ｏ−４モル／Ｊ）２０μｍをストレプトアビジン（ｆ４
度２．５Ｘ　１０−’モル／β）２０μｇと一緒にし、
３０分間定温保持することによって製造した、反応終了
後、この試薬はビオチンを介してストレプトアビジンに
結び付いたＴ４を含んでいた。

比較実験の実施 燐酸塩緩衝剤５０ｍモル（ｐＨ７，５、＋４％ポリエチ
レングリコール４００００）　８２０μｇを、上記のよ
うにして製造したストレプトアビジン試薬４０μｍと一
緒にし、試料（０モル／βＴ４）を加えた。同時にＴ４
に対するポリクローナル抗体に対し３ｍｇ／ｆ抗体の溶
液１００μｇを加え、吸光度変化を３分間当たり３４Ｏ
ｎｍで追跡した。

本発明による方法、方法Ａ： 燐酸塩緩衝剤５０ｍモル／β（ｐＨ７，５、＋４％ポリ
エチレングリコール４００００）　８２０μｇをＴ４と
ビオチンとからなる接合体（：ａ度１０−’モル／ｌ、
メタノール中）　２０μｇ及びＴ４に対するポリクロー
ナル抗体（３ｖｎｇ／　ＷＩＱ）　１００μ（と−緒に
し、５分間定温保持した。ストレプトアビジン（濃度２
．５Ｘ　１０−’七ル／ρ）　２０μｇを加えた後、吸
光度変化を３分間当たり　３４Ｏｎ−で追跡した。

本発明による方法、方法Ｂ： 燐酸塩緩衝剤５０騎モル／１．＜ＰＨ７，５、＋４％ポ
リエチレングリコール４００００）　８２０μρを、燐
酸塩緩衡剤Ｊ　２００厘モル　（ＰＨ７，５＞中のスト
レプトアビジン（２，５ＸｌＯづモル／ｆ）２０μｍ及
びＴ４に対するポリクローナル抗体＜３ｍｇ／ｒｄ＞　
　ｔｏ。

μβと一緒にし、３７℃で５分間定温保持した。

Ｔ４とビオチンとからなる接合体く濃度１０−’そル／
β）２０μｌを加えた後、吸光度変化を３分間当たり　
３４Ｏｎｍで追跡した。

比較実験の結果は次の通りである： 比較：３５謹Ｅ 本発明による方法、方法Ａ：　　　　６４６■Ｅ本発明
による方法、方法Ｂ：　　　４１４ｍε。

同じ条件下に本発明による方法では公知技術水準による
方法に比べて一層高い感度を得ることができることを示
す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の種々異なる実施例の反応原理を示
す略示図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料溶液を少なくとも３種の受容体Ｒ＿１、Ｒ＿２
   及びＲ＿３（そのうちのＲ＿１及びＲ＿２は互いに結合
   可能であり、Ｒ＿３は測定すべき物質と特異的に結合可
   能である）と共に定温保持し、反応に際して生じる凝集
   を測定することによって、特異的に結合可能の物質を測
   定する方法において、受容体Ｒ＿１として特異的に結合
   する対物質の一方のパートナーＰと、測定すべき物質に
   相当するか又はその誘導体でかつ測定すべき物質のエピ
   トープを少なくとも１個有する物質Ｓとからなる接合体
   を、またＲ＿２としてＰに対する少なくとも２個の結合
   部位を有する受容体を、更にＲ＿３として少なくとも２
   個の結合部位を有しかつそのうちの少なくとも一方が測
   定すべき物質又はＳのエピトープと特異的に結合する受
   容体をそれぞれ使用することを特徴とする、特異的に結
   合可能の物質の測定法。 ２、特異的に結合する対物質の一方のパートナーＰと、
   測定すべき物質に相当するか又はその誘導体でかつ測定
   すべき物質のエピトープを少なくも１個有する物質Ｓと
   からなる接合体である受容体Ｒ＿１と、Ｐに対する少な
   くとも２個の結合部位を有する受容体Ｒ＿２と、少なく
   とも２個の結合部位を有しかつそのうちの少なくとも一
   方が測定すべき物質又はＳのエピトープと特異的に結合
   する受容体Ｒ＿３とを含むことを特徴とする、請求項１
   記載の特異的に結合可能の物質を測定する試薬。