JPH0765997B2 - 結合可能の物質を測定する方法及び試薬 - Google Patents
結合可能の物質を測定する方法及び試薬Info
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- JPH0765997B2 JPH0765997B2 JP1172088A JP17208889A JPH0765997B2 JP H0765997 B2 JPH0765997 B2 JP H0765997B2 JP 1172088 A JP1172088 A JP 1172088A JP 17208889 A JP17208889 A JP 17208889A JP H0765997 B2 JPH0765997 B2 JP H0765997B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、試料溶液を少なくとも３種の受容体R1、R2及
びR3（そのうちのR1及びR2は互いに結合可能であり、R3
は測定すべき物質と特異的に結合可能である）と共に定
温保持し、反応に際して生じる凝集を測定することによ
って特異的に結合可能の物質を測定する方法、並びにこ
の方法に適用される試薬に関する。
びR3（そのうちのR1及びR2は互いに結合可能であり、R3
は測定すべき物質と特異的に結合可能である）と共に定
温保持し、反応に際して生じる凝集を測定することによ
って特異的に結合可能の物質を測定する方法、並びにこ
の方法に適用される試薬に関する。
従来の技術 体液及び組織内には、特異的結合パートナーと結合可能
でありまた特定の疾病又は人体の健康状態に関するパラ
メータとして利用される極めて多くの物質が存在する。
これには特に例えばホルモンのようなハプテン、腫瘍標
識のような蛋白質、蛋白質ホルモン及びウイルス蛋白質
並びに抗体が属する。また薬物による治療を監視するた
めにはしばしば血中の薬物を測定する必要がある。これ
らの物質はしばしば極めて僅少な量で存在するにすぎな
いことから、これを検出するためには免疫検定の原理に
基づく方法が使用される。これには多くの方法が存在す
る。種々の免疫的測定法は均一法と不均一法とに分類す
ることができる。不均一法では常に、標識成分の結合部
分を非結合部分から分離するための固相反応が関与す
る。この方法様式の場合標識は良好に決定することがで
きるが、不均一系反応が長時間に及ぶことは欠点であ
る。
でありまた特定の疾病又は人体の健康状態に関するパラ
メータとして利用される極めて多くの物質が存在する。
これには特に例えばホルモンのようなハプテン、腫瘍標
識のような蛋白質、蛋白質ホルモン及びウイルス蛋白質
並びに抗体が属する。また薬物による治療を監視するた
めにはしばしば血中の薬物を測定する必要がある。これ
らの物質はしばしば極めて僅少な量で存在するにすぎな
いことから、これを検出するためには免疫検定の原理に
基づく方法が使用される。これには多くの方法が存在す
る。種々の免疫的測定法は均一法と不均一法とに分類す
ることができる。不均一法では常に、標識成分の結合部
分を非結合部分から分離するための固相反応が関与す
る。この方法様式の場合標識は良好に決定することがで
きるが、不均一系反応が長時間に及ぶことは欠点であ
る。
均一法では結合標識と非結合標識とは分離されず、従っ
て結合標識と非結合標識との鑑別は他の方法によって行
われなければならない。
て結合標識と非結合標識との鑑別は他の方法によって行
われなければならない。
これに対しては種々の可能性が存在する。すなわち例え
ば測定すべきハプテン又は抗原に結合されるか又は測定
すべき物質によって活性化されている場合にのみ、その
酵素活性を維持する複合酵素を標識として使用すること
ができる。別の可能性は、その蛍光が測定すべき物質へ
の結合によって他の波長領域に移るか又はその偏光を変
える蛍光物質を標識として使用することにある。
ば測定すべきハプテン又は抗原に結合されるか又は測定
すべき物質によって活性化されている場合にのみ、その
酵素活性を維持する複合酵素を標識として使用すること
ができる。別の可能性は、その蛍光が測定すべき物質へ
の結合によって他の波長領域に移るか又はその偏光を変
える蛍光物質を標識として使用することにある。
これらの公知方法の欠点は特に、試料がしばしばテスト
阻害成分を含み、従ってこれらの物質を除去するための
試料前処理が必要であるという点にある。また各パラメ
ータに対する費用の嵩む最適化処理が必要であり、例え
ば酵素をパラメータに応じて改変しなければならない。
阻害成分を含み、従ってこれらの物質を除去するための
試料前処理が必要であるという点にある。また各パラメ
ータに対する費用の嵩む最適化処理が必要であり、例え
ば酵素をパラメータに応じて改変しなければならない。
更に欧州特許出願公開第79962号明細書からは、測定す
べきハプテンを含む溶液をハプテン被覆ラテックス粒子
又はハプテン被覆アルブミンと接触させる方法が公知で
ある。ハプテンと結合可能の抗体を加えることによって
凝集反応が生じる。ラテックス粒子又はアルブミンに結
合したハプテンは試料中に含まれるハプテンと競合する
ことから、試料中に含まれるハプテン量が多いほど、凝
集反応は小さくなる。この方法の欠点は、測定すべき各
物質に対して特定の粒子を使用しなければならずまた各
パラメータを個々に最適化する必要のあることである。
べきハプテンを含む溶液をハプテン被覆ラテックス粒子
又はハプテン被覆アルブミンと接触させる方法が公知で
ある。ハプテンと結合可能の抗体を加えることによって
凝集反応が生じる。ラテックス粒子又はアルブミンに結
合したハプテンは試料中に含まれるハプテンと競合する
ことから、試料中に含まれるハプテン量が多いほど、凝
集反応は小さくなる。この方法の欠点は、測定すべき各
物質に対して特定の粒子を使用しなければならずまた各
パラメータを個々に最適化する必要のあることである。
凝集反応を分析評価することによって行う蛋白質の検出
法は西ドイツ国特許出願公開第2749956号明細書から公
知である。この場合測定すべき物質に対する抗体は凝集
可能の粒子に直接結合される。しかしこの結合によって
抗体の反応性は損なわれる可能性がある。更にこの種の
測定法はリウマチ因子による障害に対して敏感である。
法は西ドイツ国特許出願公開第2749956号明細書から公
知である。この場合測定すべき物質に対する抗体は凝集
可能の粒子に直接結合される。しかしこの結合によって
抗体の反応性は損なわれる可能性がある。更にこの種の
測定法はリウマチ因子による障害に対して敏感である。
これらの公知のすべての拮抗的均一凝集免疫検定法の欠
点は、原料に対して著しく費用の嵩むパラメータ特異性
に基づく最適化処理をしなければならないことである。
これらのすべてのテストに際しては最も好ましい鑑別及
び最適感度に関して互いに対立する要件が存在する。そ
れというのも一方では粒状試薬の濃度を制限することに
よって、試料との競合反応を可能としなければならない
が、他方ではまた単位時間当たりに十分な信号変化を得
るために粒状試料は高濃度化及び高標識化されていなれ
ばならないからである。これらの要求の調整は限定され
た感度及び障害感受性をもたらし、これは特殊な試料前
処理によってのみ除去し得るにすぎない。
点は、原料に対して著しく費用の嵩むパラメータ特異性
に基づく最適化処理をしなければならないことである。
これらのすべてのテストに際しては最も好ましい鑑別及
び最適感度に関して互いに対立する要件が存在する。そ
れというのも一方では粒状試薬の濃度を制限することに
よって、試料との競合反応を可能としなければならない
が、他方ではまた単位時間当たりに十分な信号変化を得
るために粒状試料は高濃度化及び高標識化されていなれ
ばならないからである。これらの要求の調整は限定され
た感度及び障害感受性をもたらし、これは特殊な試料前
処理によってのみ除去し得るにすぎない。
発明が解決しようとする課題 従って本発明の課題は、物質の検出を高感度でかつ正確
に実施することを可能としまた上記の諸欠点を有さな
い、均一測定法を提供することにある。
に実施することを可能としまた上記の諸欠点を有さな
い、均一測定法を提供することにある。
課題を解決するための手段 この課題は、本発明により、試料溶液を少なくとも３種
の受容体R1,R2及びR3（そのうちのR1及びR2は互いに結
合可能であり、R3は測定すべき物質と特異的に結合可能
である）と共に定温保持し、反応に際して生じる凝集を
測定することによって、特異的に結合可能の物質を測定
する方法により、解決され、該方法は、受容体R1として
特異的に結合する対物質の一方のパートナーＰと、測定
すべき物質に相当するか又はその誘導体でかつ測定すべ
き物質のエピトロープを少なくとも１個有する物質Ｓと
からなる接合体を使用し、またR2としてＰに対する少な
くとも２個の結合部位を有する受容体を使用し、その際
R1はR2に対する唯一の結合部位を有し、更にR3として少
なくとも２個の結合部位を有しかつそのうちの少なくと
も一方が測定すべき物質又はＳのエピトロープと特異的
に結合する受容体を使用することを特徴とする。
の受容体R1,R2及びR3（そのうちのR1及びR2は互いに結
合可能であり、R3は測定すべき物質と特異的に結合可能
である）と共に定温保持し、反応に際して生じる凝集を
測定することによって、特異的に結合可能の物質を測定
する方法により、解決され、該方法は、受容体R1として
特異的に結合する対物質の一方のパートナーＰと、測定
すべき物質に相当するか又はその誘導体でかつ測定すべ
き物質のエピトロープを少なくとも１個有する物質Ｓと
からなる接合体を使用し、またR2としてＰに対する少な
くとも２個の結合部位を有する受容体を使用し、その際
R1はR2に対する唯一の結合部位を有し、更にR3として少
なくとも２個の結合部位を有しかつそのうちの少なくと
も一方が測定すべき物質又はＳのエピトロープと特異的
に結合する受容体を使用することを特徴とする。
本発明方法は体液又は組織抽出物中の、特異的に結合す
ることのできる実際にすべての検出すべき物質を測定す
るのに適しており、この場合低濃度の物質も高濃度の物
質と同様良好に検出することができる。この方法の感度
及び精度は従来公知の方法に比べて改良されている。本
発明は簡単な試薬で迅速かつ正確な測定を実施する可能
性を提供する。
ることのできる実際にすべての検出すべき物質を測定す
るのに適しており、この場合低濃度の物質も高濃度の物
質と同様良好に検出することができる。この方法の感度
及び精度は従来公知の方法に比べて改良されている。本
発明は簡単な試薬で迅速かつ正確な測定を実施する可能
性を提供する。
本方法は特に一価の特異的に結合可能の物質を測定する
のに適している。この場合一価の物質としては特異的に
結合可能のパートナーに対して唯一の結合部位を有する
物質を意味する。この例としてはハプテン例えば薬物を
挙げることができる。同様に特異的に結合可能のパート
ナーに対する数個の結合部位を有する物質、例えばHCG
又はTSHのような蛋白質ホルモン、抗原及び蛋白質、CEA
のような腫瘍標識、ウイルス蛋白質及び抗体を測定する
こともできる。
のに適している。この場合一価の物質としては特異的に
結合可能のパートナーに対して唯一の結合部位を有する
物質を意味する。この例としてはハプテン例えば薬物を
挙げることができる。同様に特異的に結合可能のパート
ナーに対する数個の結合部位を有する物質、例えばHCG
又はTSHのような蛋白質ホルモン、抗原及び蛋白質、CEA
のような腫瘍標識、ウイルス蛋白質及び抗体を測定する
こともできる。
本明細書においてエピトープとは、他の物質との特異的
結合をもたらすことのできる結合部位を意味する。エピ
トープの例は抗原及びハプテン上の抗原決定基又は蛋白
質上の特異的結合部位である。
結合をもたらすことのできる結合部位を意味する。エピ
トープの例は抗原及びハプテン上の抗原決定基又は蛋白
質上の特異的結合部位である。
このため試料溶液を３種の受容体R1、R2及びR3と共に定
温保持する。この場合受容体R1及びR2は互いに結合可能
であり、R3は測定すべき物質と特異的に結合可能であ
る。本発明による方法で実施することのできる種々の反
応原理は第１図に示されている。優れた一方法は第1a図
で示した実施態様である。この場合試料溶液に、互いに
特異的に結合する対物質の一方のパートナーＰと測定す
べき物質Ｓとからなる接合体である受容体R1並びに測定
すべき物質と特異的に結合可能の受容体であるR3を加え
る。この場合この溶液中でR1の部分Ｓ及び測定すべき物
質はR3への結合に関して競合する。R3が例えば二価の抗
体である場合には次の複合体が生じる： R3：その双方の抗体結合部位にそれぞれR1がＳを介して
結合している。
温保持する。この場合受容体R1及びR2は互いに結合可能
であり、R3は測定すべき物質と特異的に結合可能であ
る。本発明による方法で実施することのできる種々の反
応原理は第１図に示されている。優れた一方法は第1a図
で示した実施態様である。この場合試料溶液に、互いに
特異的に結合する対物質の一方のパートナーＰと測定す
べき物質Ｓとからなる接合体である受容体R1並びに測定
すべき物質と特異的に結合可能の受容体であるR3を加え
る。この場合この溶液中でR1の部分Ｓ及び測定すべき物
質はR3への結合に関して競合する。R3が例えば二価の抗
体である場合には次の複合体が生じる： R3：その双方の抗体結合部位にそれぞれR1がＳを介して
結合している。
R3：その双方の抗体結合部位に測定すべき物質が結合し
ている、及び R3：その一方の抗体結合部位に測定すべき物質がまたそ
の他方の抗体結合部位にR1がＳを介して結合している。
ている、及び R3：その一方の抗体結合部位に測定すべき物質がまたそ
の他方の抗体結合部位にR1がＳを介して結合している。
他の２つの受容体と同時にか又は一定の時間を置いた後
に、Ｐに対する結合部位を少なくとも２個、有利には多
数有する受容体R2を加える。これにより受容体R2にＰを
介して受容体R1が結合する。溶液中に存在する複合体の
うち、少なくとも１個の受容体R1を結合して有する複合
体はR2に結合可能であり、R2に２個の受容体R1が結合し
ている複合体は、再び光度計により検出可能の混濁又は
混濁変化を生ぜしめる凝集を生じる可能性がある。溶液
中に含まれる測定すべき物質の量が多いほど、R1の結合
数は少なくなり、凝集発生率は低下し、また混濁増加は
僅かになる。従って凝集の規模は測定すべき物質に対す
る間接的な尺度である。これは較正曲線を介して分析評
価することができる。
に、Ｐに対する結合部位を少なくとも２個、有利には多
数有する受容体R2を加える。これにより受容体R2にＰを
介して受容体R1が結合する。溶液中に存在する複合体の
うち、少なくとも１個の受容体R1を結合して有する複合
体はR2に結合可能であり、R2に２個の受容体R1が結合し
ている複合体は、再び光度計により検出可能の混濁又は
混濁変化を生ぜしめる凝集を生じる可能性がある。溶液
中に含まれる測定すべき物質の量が多いほど、R1の結合
数は少なくなり、凝集発生率は低下し、また混濁増加は
僅かになる。従って凝集の規模は測定すべき物質に対す
る間接的な尺度である。これは較正曲線を介して分析評
価することができる。
実施方法ｂ）は二価の物質例えば抗体を検出するのに利
用する。その原理は方法ａ）の場合と同じである。この
場合にもR3の２つの結合部位にそれぞれ１個のR1が結合
する複合体が凝集をもたらす。
用する。その原理は方法ａ）の場合と同じである。この
場合にもR3の２つの結合部位にそれぞれ１個のR1が結合
する複合体が凝集をもたらす。
方法ｃ）ではR3として、測定すべき物質と特異的に結合
可能の受容体と特異的に結合可能の対物質の一方のパー
トナーとからなる接合体を使用する。試料溶液をR1及び
R3と共に定温保持した場合、測定すべき物質及びR1はR3
への結合に関して競合する。この場合受容体R1又は測定
すべき物質の分子のいずれか一方がR3に結合可能であ
る。R2との定温保持後に受容体R3の部分ＰがR2に結合す
る。R3の他の結合部位に測定すべき物質が結合している
場合には、R2を介しての網状化は不可能である。しかし
R3の他の結合部位に接合体R1が結合している場合には、
受容体R1はR2の第２結合部位に結合し、これにより網状
化する。この実施例の場合にも溶液中に測定すべき物質
が多数存在しているほど、R1の結合数は少なく、従って
凝集結合はそれに応じて少なくなる。
可能の受容体と特異的に結合可能の対物質の一方のパー
トナーとからなる接合体を使用する。試料溶液をR1及び
R3と共に定温保持した場合、測定すべき物質及びR1はR3
への結合に関して競合する。この場合受容体R1又は測定
すべき物質の分子のいずれか一方がR3に結合可能であ
る。R2との定温保持後に受容体R3の部分ＰがR2に結合す
る。R3の他の結合部位に測定すべき物質が結合している
場合には、R2を介しての網状化は不可能である。しかし
R3の他の結合部位に接合体R1が結合している場合には、
受容体R1はR2の第２結合部位に結合し、これにより網状
化する。この実施例の場合にも溶液中に測定すべき物質
が多数存在しているほど、R1の結合数は少なく、従って
凝集結合はそれに応じて少なくなる。
実施方法ｄ）は実施方法ａ）の変法であり、この場合受
容体R3としては測定すべき物質又はＳに対する２つの結
合部位以外にもう１つ別の結合部位をＰの形で有する受
容体を使用する。試料溶液をR1及びR3と共に定温保持し
た場合、方法ａ）におけると同様に同じ複合体を生じ
る。しかし方法ａ）とは異なり、その２つの抗体結合部
位にR1が結合されている受容体R3並びに１つの抗体結合
部位にR1がまた他方の抗体結合部位に測定すべき物質が
結合している受容体R3もまた凝集をもたらすことができ
る。従ってこの実施方法は、極めて高度に濃縮されてい
る物質を検出するのに特に適している。
容体R3としては測定すべき物質又はＳに対する２つの結
合部位以外にもう１つ別の結合部位をＰの形で有する受
容体を使用する。試料溶液をR1及びR3と共に定温保持し
た場合、方法ａ）におけると同様に同じ複合体を生じ
る。しかし方法ａ）とは異なり、その２つの抗体結合部
位にR1が結合されている受容体R3並びに１つの抗体結合
部位にR1がまた他方の抗体結合部位に測定すべき物質が
結合している受容体R3もまた凝集をもたらすことができ
る。従ってこの実施方法は、極めて高度に濃縮されてい
る物質を検出するのに特に適している。
本発明により定義される方法原理には多くの実施方法が
存在する。その各々の場合に少なくとも３個の受容体が
必要である。測定すべき物質は特異的に結合することの
できるすべての物質であり、特に先に定義したようにハ
プテン、一価、二価又は多価抗原、抗体又は蛋白質であ
ってよい。
存在する。その各々の場合に少なくとも３個の受容体が
必要である。測定すべき物質は特異的に結合することの
できるすべての物質であり、特に先に定義したようにハ
プテン、一価、二価又は多価抗原、抗体又は蛋白質であ
ってよい。
第１受容体R1としては、特異的に結合可能の対物質のパ
ートナーＰと、測定すべき物質と同じであるか又はその
誘導体でありかつ測定すべき物質のエピトープを少なく
とも１個有する物質Ｓとからなる接合体を使用する。互
いに特異的に結合する対物質はそれ自体公知である。適
当な結合対物質（P-R2）は特にビオチン−スレトプトア
ビジン又はアビジン；ハプテン−抗体；抗原−抗体；コ
ンカバリン−抗体；糖−レクチン；ハプテン−結合蛋白
質例えばチロキシン結合性グロブリン及びチロキシン又
はオリゴペプチド−抗体である。
ートナーＰと、測定すべき物質と同じであるか又はその
誘導体でありかつ測定すべき物質のエピトープを少なく
とも１個有する物質Ｓとからなる接合体を使用する。互
いに特異的に結合する対物質はそれ自体公知である。適
当な結合対物質（P-R2）は特にビオチン−スレトプトア
ビジン又はアビジン；ハプテン−抗体；抗原−抗体；コ
ンカバリン−抗体；糖−レクチン；ハプテン−結合蛋白
質例えばチロキシン結合性グロブリン及びチロキシン又
はオリゴペプチド−抗体である。
結合対物質としてはストレプトアビジン又はアビジン−
ビオチンを使用するのが特に有利である。受容体R1はビ
オチンを含むことが特に好ましい。
ビオチンを使用するのが特に有利である。受容体R1はビ
オチンを含むことが特に好ましい。
受容体R1の部分Ｓは未変化の測定すべき物質と一致する
ものであるのが有利である。測定すべき物質の誘導体又
は測定すべき物質の１部、例えば蛋白質エピトープを使
用することもできる。実際には部分ＳがR3と結合可能で
あることが重要であるにすぎず、この場合Ｓ及び測定す
べき物質が同じ結合力でR3に結合することは必ずしも必
要ではない。
ものであるのが有利である。測定すべき物質の誘導体又
は測定すべき物質の１部、例えば蛋白質エピトープを使
用することもできる。実際には部分ＳがR3と結合可能で
あることが重要であるにすぎず、この場合Ｓ及び測定す
べき物質が同じ結合力でR3に結合することは必ずしも必
要ではない。
接合体の製造はそれ自体公知の方法で行う（例えば「ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・ビオケミストリー」
（Eur.J.Biochem.）、131（1980）、333-338と同様にし
て）。
ーロピアン・ジャーナル・オブ・ビオケミストリー」
（Eur.J.Biochem.）、131（1980）、333-338と同様にし
て）。
本発明方法にとって必要な第２受容体R2はＰに対する少
なくとも２個の結合部位を有しまた有利には特異的に結
合可能の対物質のＰに対する相補性パートナーを多数有
する。受容体R2は反応に際して生じる複合体の凝集を媒
介する。反応系中には特異的に結合可能の対物質の他の
パートナーが多数存在することから、試薬溶液中に元々
存在する僅少量の、上記パートナーと結合可能の物質が
障害をもたらすことはない。受容体R2はＰに対する数個
の結合部位を元々有する物質、例えばストレプトアビジ
ン又は抗体であってよい。受容体R2は多価でありかつＰ
に対する結合部位を多数有するか、又は特異的に結合す
る対物質の、Ｐに対する相補性パートナーのポリマー例
えばポリストレプトアビジンであってもよい。この場合
個々のパートナーは互いに直接結合されているか又は架
橋を介して結び付けられている。この種のポリマーを製
造する方法は当業者の熟知するところであり、従ってこ
こでは詳述しない。
なくとも２個の結合部位を有しまた有利には特異的に結
合可能の対物質のＰに対する相補性パートナーを多数有
する。受容体R2は反応に際して生じる複合体の凝集を媒
介する。反応系中には特異的に結合可能の対物質の他の
パートナーが多数存在することから、試薬溶液中に元々
存在する僅少量の、上記パートナーと結合可能の物質が
障害をもたらすことはない。受容体R2はＰに対する数個
の結合部位を元々有する物質、例えばストレプトアビジ
ン又は抗体であってよい。受容体R2は多価でありかつＰ
に対する結合部位を多数有するか、又は特異的に結合す
る対物質の、Ｐに対する相補性パートナーのポリマー例
えばポリストレプトアビジンであってもよい。この場合
個々のパートナーは互いに直接結合されているか又は架
橋を介して結び付けられている。この種のポリマーを製
造する方法は当業者の熟知するところであり、従ってこ
こでは詳述しない。
他の実施態様では受容体R2は、Ｐに対して相補性で特異
的に結合するパートナーが多数結合している担体物質か
らなる。これらの担体物質としては通常50〜1000nmの大
きさの粒子を使用することがきる。適当な物質はポリス
チロール、微粉砕二酸化珪素、赤血球又は網状化アルブ
ミンである。この粒子を特異的に結合するパートナーで
被覆する処理は当業者にとって周知の方法で行う。この
方法は例えば欧州特許第73611号明細書及び米国特許第4
703018号明細書に記載されている。
的に結合するパートナーが多数結合している担体物質か
らなる。これらの担体物質としては通常50〜1000nmの大
きさの粒子を使用することがきる。適当な物質はポリス
チロール、微粉砕二酸化珪素、赤血球又は網状化アルブ
ミンである。この粒子を特異的に結合するパートナーで
被覆する処理は当業者にとって周知の方法で行う。この
方法は例えば欧州特許第73611号明細書及び米国特許第4
703018号明細書に記載されている。
こうして被覆又は重合された受容体R2は本発明方法にお
いて万能的に使用することができ、従ってパラメータ特
異性ではない。
いて万能的に使用することができ、従ってパラメータ特
異性ではない。
本発明方法を実施するにあたって重要なことは、受容体
R1がR2に対する唯一の結合部位を有すること、すなわち
各受容体R1は１個のR2とのみ反応し得ることである。こ
れは本質的な前提条件である、それというのもさもなけ
ればR2は単に受容体R1によって網状化し得るにすぎず、
その結果検出すべき物質Ｓに起因しない凝集が起こる恐
れがあるからである。
R1がR2に対する唯一の結合部位を有すること、すなわち
各受容体R1は１個のR2とのみ反応し得ることである。こ
れは本質的な前提条件である、それというのもさもなけ
ればR2は単に受容体R1によって網状化し得るにすぎず、
その結果検出すべき物質Ｓに起因しない凝集が起こる恐
れがあるからである。
本発明の本質である第３の成分は、少なくとも２個の結
合部位を有しかつそのうちの少なくとも１つは測定すべ
き物質又はＳのエピトープと特異的に結合する受容体R3
である。この受容体はその都度測定すべき物質に応じて
選択される。これには多数の受容体が適用される。ハプ
テン、蛋白質、DNA又は糖を測定するには特に、これら
の物質又はその断片に対する抗体又は他の受容体例えば
天然産の結合蛋白質例えばチロキシン結合グロブリンを
使用するのが有利である。同様にDNAを測定するには相
補性DNAを受容体R3として使用することが有利である。
合部位を有しかつそのうちの少なくとも１つは測定すべ
き物質又はＳのエピトープと特異的に結合する受容体R3
である。この受容体はその都度測定すべき物質に応じて
選択される。これには多数の受容体が適用される。ハプ
テン、蛋白質、DNA又は糖を測定するには特に、これら
の物質又はその断片に対する抗体又は他の受容体例えば
天然産の結合蛋白質例えばチロキシン結合グロブリンを
使用するのが有利である。同様にDNAを測定するには相
補性DNAを受容体R3として使用することが有利である。
測定すべき物質がR3に対する結合部位を１つしか有さな
い場合、優れた１実施態様では受容体R3は測定すべき物
質又はＳのエピトープに対する１個の結合部位の他に、
特異的に結合する対物質のパートナーに対する先のもの
とは異なる結合部位を、同様にR1に対して使用したパー
トナーＰの形で有する。更にR3は特異的に結合する対物
質のパートナーＰと、測定すべき物質又はＳのエピトー
プと特異的に結合する唯一の結合部位を有する物質とか
らなる接合体、特に有利には測定すべき物質又はＳのエ
ピトープと特異的に結合するFab−断片とＰとからなる
接合体であるか、又は特異的に結合する対物質のパート
ナーＰと測定すべき物質又はＳのエピトープに対する２
個の結合部位を有する受容体とからなる接合体が有利で
ある。
い場合、優れた１実施態様では受容体R3は測定すべき物
質又はＳのエピトープに対する１個の結合部位の他に、
特異的に結合する対物質のパートナーに対する先のもの
とは異なる結合部位を、同様にR1に対して使用したパー
トナーＰの形で有する。更にR3は特異的に結合する対物
質のパートナーＰと、測定すべき物質又はＳのエピトー
プと特異的に結合する唯一の結合部位を有する物質とか
らなる接合体、特に有利には測定すべき物質又はＳのエ
ピトープと特異的に結合するFab−断片とＰとからなる
接合体であるか、又は特異的に結合する対物質のパート
ナーＰと測定すべき物質又はＳのエピトープに対する２
個の結合部位を有する受容体とからなる接合体が有利で
ある。
同様に受容体R3は、測定すべき物質又はＳのエピトープ
と結合する２個の同じ結合部位を有していてもよい。受
容体R3として適当なものは例えばモノクローナル又はポ
リクローナル抗体、Fab2 -断片又は、Fab−断片と特異的
に結合する対物質のパートナーとからなる接合体であ
る。受容体R3が結合部位を２個以上有する場合には、抗
体、F(ab)2 -又はＦ（ab′）2 -断片とパートナーＰとの
接合体を使用することができる。この場合には特にビオ
チン塩化した抗体及び、測定すべき物質と特異的に結合
可能の抗体断片が適している。
と結合する２個の同じ結合部位を有していてもよい。受
容体R3として適当なものは例えばモノクローナル又はポ
リクローナル抗体、Fab2 -断片又は、Fab−断片と特異的
に結合する対物質のパートナーとからなる接合体であ
る。受容体R3が結合部位を２個以上有する場合には、抗
体、F(ab)2 -又はＦ（ab′）2 -断片とパートナーＰとの
接合体を使用することができる。この場合には特にビオ
チン塩化した抗体及び、測定すべき物質と特異的に結合
可能の抗体断片が適している。
他の実施態様では受容体R3は測定中に初めて、例えばTB
Gに対する抗体及び２分子のTBGからか又はFab−断片に
対する抗体及び２個のFab−断片から形成される。
Gに対する抗体及び２分子のTBGからか又はFab−断片に
対する抗体及び２個のFab−断片から形成される。
この方法は一工程又は数工程で実施することができる。
その評価は凝集の規模を測定することによって行う。こ
の方法は公知である。例えば測光による混濁度の測定、
比濁分析法による散乱光の測定、粒子計数又は光子−相
関−分光法（PCS）が適している。
その評価は凝集の規模を測定することによって行う。こ
の方法は公知である。例えば測光による混濁度の測定、
比濁分析法による散乱光の測定、粒子計数又は光子−相
関−分光法（PCS）が適している。
受容体の各々及び測定すべき物質はそれぞれこれらに対
して特定された反応パートナーと特異的に反応し得るに
すぎないことから、すべての受容体及び試料を一緒に定
温保持し、この方法を単一工程で実施することが可能で
ある。これは特に該方法を１つの自動分析装置で実施す
る際に有利である。
して特定された反応パートナーと特異的に反応し得るに
すぎないことから、すべての受容体及び試料を一緒に定
温保持し、この方法を単一工程で実施することが可能で
ある。これは特に該方法を１つの自動分析装置で実施す
る際に有利である。
濃度が極めて低いか又は高い物質を検出するには、多工
程法が有利である。試料溶液中に高濃度で存在する物質
を検出する場合には次に記載する実施態様が好ましい。
この場合まず受容体R1を受容体R3と予め反応させる。そ
の際測定すべき物質に相応する受容体R1の部分Ｓ及びR3
が互いに反応する。次いで試料溶液を加える。この時点
で試料溶液中に存在する測定すべき物質が、すでに結合
している受容体R1をその結合状態から解除する。試料溶
液中には測定すべき物質が多量に存在することから、こ
の置換反応は十分な速度で進行する。引続き受容体R2を
加え、その後に混濁度の増加を測定する。この形式のテ
ストの感度は実際に鈍いが、高濃度の試料に対しては極
めて適している。
程法が有利である。試料溶液中に高濃度で存在する物質
を検出する場合には次に記載する実施態様が好ましい。
この場合まず受容体R1を受容体R3と予め反応させる。そ
の際測定すべき物質に相応する受容体R1の部分Ｓ及びR3
が互いに反応する。次いで試料溶液を加える。この時点
で試料溶液中に存在する測定すべき物質が、すでに結合
している受容体R1をその結合状態から解除する。試料溶
液中には測定すべき物質が多量に存在することから、こ
の置換反応は十分な速度で進行する。引続き受容体R2を
加え、その後に混濁度の増加を測定する。この形式のテ
ストの感度は実際に鈍いが、高濃度の試料に対しては極
めて適している。
本発明方法のもう１つの優れた実施態様は極めて低濃度
の物質を検出するのに適している。例としてはホルモン
及び薬物を挙げることができる。この場合まず受容体R2
を受容体R3と予め混合し、次いで試料を加える。その際
試料中に存在する測定すべき物質が受容体R3と反応す
る。凝集はまだ起こらない、それというのも受容体R2へ
の結合を生ぜしめる受容体R1がまだ存在しないからであ
る。次いで受容体R3とまた受容体R2と結合可能の受容体
R1を加える。この時点で一定の時間を置いた後に混濁度
の増加を測定する。この方法の感度は極めて高い。
の物質を検出するのに適している。例としてはホルモン
及び薬物を挙げることができる。この場合まず受容体R2
を受容体R3と予め混合し、次いで試料を加える。その際
試料中に存在する測定すべき物質が受容体R3と反応す
る。凝集はまだ起こらない、それというのも受容体R2へ
の結合を生ぜしめる受容体R1がまだ存在しないからであ
る。次いで受容体R3とまた受容体R2と結合可能の受容体
R1を加える。この時点で一定の時間を置いた後に混濁度
の増加を測定する。この方法の感度は極めて高い。
同様に平均的な濃度のパラメータに対しては完全に、拮
抗性のテスト法が適している。この場合には同時に受容
体R1、受容体R3及び試料溶液を定温保持する。この場合
測定すべき物質及び受容体R1の接合体中に含まれる部分
Ｓは受容体R3への結合に関して競合する。受容体R2の添
加後再びその凝集を測定する。
抗性のテスト法が適している。この場合には同時に受容
体R1、受容体R3及び試料溶液を定温保持する。この場合
測定すべき物質及び受容体R1の接合体中に含まれる部分
Ｓは受容体R3への結合に関して競合する。受容体R2の添
加後再びその凝集を測定する。
本発明方法のこの方法は、ハプテンに対して特異性の蛋
白質と結び付くことのできるハプテンを検出するのにも
適している。この場合結合蛋白質はハプテンに対する結
合部位を１個有するだけである。この例は、チロキシン
結合性蛋白質によって特異的に結合されるチロキシンで
ある。
白質と結び付くことのできるハプテンを検出するのにも
適している。この場合結合蛋白質はハプテンに対する結
合部位を１個有するだけである。この例は、チロキシン
結合性蛋白質によって特異的に結合されるチロキシンで
ある。
これらのすべての方法は緩衝液中で実施するのが有利で
ある。この方法に対する緩衝剤系はそれ自体公知であ
る。特に適当なものはGOOD−緩衝剤及び燐酸塩緩衝剤で
ある。
ある。この方法に対する緩衝剤系はそれ自体公知であ
る。特に適当なものはGOOD−緩衝剤及び燐酸塩緩衝剤で
ある。
本発明により、簡単かつ迅速に実施することができまた
測定すべき物質の濃度との関連において測定信号を生じ
る方法が提供される。免疫拮抗性に対して決定的な系及
び信号発生系は分けられていることから、本発明によれ
ば検出感度は高められる。その結果簡単な試薬で低濃度
のハプテンを迅速かつ正確に定量的に測定することがで
きる。
測定すべき物質の濃度との関連において測定信号を生じ
る方法が提供される。免疫拮抗性に対して決定的な系及
び信号発生系は分けられていることから、本発明によれ
ば検出感度は高められる。その結果簡単な試薬で低濃度
のハプテンを迅速かつ正確に定量的に測定することがで
きる。
本発明のもう１つの対象は、特異的に結合する対物質の
一方のパートナーＰと、測定すべき物質に相当するか又
はその誘導体でかつ測定すべき物質のエピトロープを少
なくとも１個有する物質Ｓとからなる接合体である受容
体R1、及びＰに対する少なくとも２個の結合部位を有す
る受容体R2を含有し、その際R1はR2に対する唯一の結合
部位を有し、更に少なくとも２個の結合部位を有しかつ
そのうちの少なくとも一方が測定すべき物質又はＳのエ
ピトロープと特異的に結合する受容体R3を含有すること
を特徴とする、特異的に結合可能の物質を測定する試薬
である。
一方のパートナーＰと、測定すべき物質に相当するか又
はその誘導体でかつ測定すべき物質のエピトロープを少
なくとも１個有する物質Ｓとからなる接合体である受容
体R1、及びＰに対する少なくとも２個の結合部位を有す
る受容体R2を含有し、その際R1はR2に対する唯一の結合
部位を有し、更に少なくとも２個の結合部位を有しかつ
そのうちの少なくとも一方が測定すべき物質又はＳのエ
ピトロープと特異的に結合する受容体R3を含有すること
を特徴とする、特異的に結合可能の物質を測定する試薬
である。
本発明によるこの試薬は優れた１実施態様では個々の受
容体R1、R2及びR3を物理的に互いに独立して含むことが
できる。他の実施態様では受容体R1及びR3を予め混合す
ることができ、この場合試薬はR1及びR3の混合物と受容
体R2とを物理的に互いに独立して含む。同様に受容体R2
及びR3を予め混合することもでき、この場合には試薬は
R2及びR3の混合物並びに物理的にこの混合物から分離さ
れているR1を含む。
容体R1、R2及びR3を物理的に互いに独立して含むことが
できる。他の実施態様では受容体R1及びR3を予め混合す
ることができ、この場合試薬はR1及びR3の混合物と受容
体R2とを物理的に互いに独立して含む。同様に受容体R2
及びR3を予め混合することもでき、この場合には試薬は
R2及びR3の混合物並びに物理的にこの混合物から分離さ
れているR1を含む。
この試薬は体液及び組織抽出物中の多数のパラメータを
測定するのに適している。
測定するのに適している。
優れた１実施態様では試薬は付加的に緩衝物質を含む。
特に有利にはこの試薬は燐酸塩緩衝剤及びGOOD−緩衝剤
を含む。
特に有利にはこの試薬は燐酸塩緩衝剤及びGOOD−緩衝剤
を含む。
実施例 次に本発明を図面及び実施例に基づき詳述する。
第１図は本発明方法の種々異なる優れた実施例の反応原
理を示す略示図である。
理を示す略示図である。
図示したすべての方法において受容体R2はＰに対する２
個の結合部位を有する。受容体R1としてはそれぞれ測定
すべき物質とパートナーＰとからなる接合体を使用す
る。
個の結合部位を有する。受容体R1としてはそれぞれ測定
すべき物質とパートナーＰとからなる接合体を使用す
る。
第1a図は受容体R3に対する結合部位を１個有する物質を
検出するのに適した方法を示すものである。
検出するのに適した方法を示すものである。
この場合受容体R3としては測定すべき物質に対して二価
の受容体を使用する。
の受容体を使用する。
方法1b）は二価の物質（例えば抗体）を測定するのに使
用される。受容体R3としては測定すべき物質と特異的に
結合可能の二価の受容体を使用する。
用される。受容体R3としては測定すべき物質と特異的に
結合可能の二価の受容体を使用する。
方法1c）は一価の物質を検出するのに適している。この
場合受容体R3としては、測定すべき物質に対して１個の
結合部位を有する受容体とパートナーＰとからなる接合
体を使用する。
場合受容体R3としては、測定すべき物質に対して１個の
結合部位を有する受容体とパートナーＰとからなる接合
体を使用する。
方法1d）は一価の物質を検出するのに適している。受容
体R3としては、測定すべき物質に対して２個の結合部位
と１個のパートナーＰとを有する接合体を使用する。
体R3としては、測定すべき物質に対して２個の結合部位
と１個のパートナーＰとを有する接合体を使用する。
例１ ａ）ストレプトアビジン−ラテックスの製造 濃度2mg/mlのストレプトアビジンをイミダゾール緩衝剤
15mモル/l（pH7.5、NaCl 100mモル/l）中で、濃度２重
量％のクロルメチルスチロール粒子（ラテックス、ｄ＝
70nm、米国特許第4703018号明細書に相応）と一緒に、5
5℃で24時間定温保持し、攪拌する。反応混合物を20000
Upmで60分間遠心分離した後、上澄みを傾瀉し、沈殿を
グリシン−緩衝剤200mモル/l（pH7.5、牛の血清アルブ
ミン0.5％）に取る。適当に希釈することによって１重
量％のストレプトアビジン−ラテックス試薬を製造す
る。
15mモル/l（pH7.5、NaCl 100mモル/l）中で、濃度２重
量％のクロルメチルスチロール粒子（ラテックス、ｄ＝
70nm、米国特許第4703018号明細書に相応）と一緒に、5
5℃で24時間定温保持し、攪拌する。反応混合物を20000
Upmで60分間遠心分離した後、上澄みを傾瀉し、沈殿を
グリシン−緩衝剤200mモル/l（pH7.5、牛の血清アルブ
ミン0.5％）に取る。適当に希釈することによって１重
量％のストレプトアビジン−ラテックス試薬を製造す
る。
ｂ）ハプテン−ビオチン−接合体の製造 このためｎ−ブチルオキシカルボニル−テトラヨードチ
ロニン及び１−メチル−３−（３′−カルボキシプロピ
ル）−キサンチン（西ドイツ国特許出願公告第2805961
号明細書）をペンタメチレンジアミンを介してビオチン
と、“Eur.J.Biochem."131（1980）、333-338に記載さ
れているようにして結合させる。その際T4 -ビオチン−
接合体が得られる。同様にしてテオフィリンをビオチン
に結合する。
ロニン及び１−メチル−３−（３′−カルボキシプロピ
ル）−キサンチン（西ドイツ国特許出願公告第2805961
号明細書）をペンタメチレンジアミンを介してビオチン
と、“Eur.J.Biochem."131（1980）、333-338に記載さ
れているようにして結合させる。その際T4 -ビオチン−
接合体が得られる。同様にしてテオフィリンをビオチン
に結合する。
例２ T4の測定 燐酸塩緩衝剤0.1モル/l、pH7.5、＋２％ポリエチレング
リコール40000 900μｌ 試料（水性T4 -標準） 20μｌ T4に対するポリクローナル抗体の0.1mg/ml溶液 20μｌ １％ラテックス試薬（例１） 20μｌ からなる試薬を37℃で５分間定温保持し、引続き濃度10
-6モル/lのT4とビオチンとからなる接合体20μｌを加え
る。
リコール40000 900μｌ 試料（水性T4 -標準） 20μｌ T4に対するポリクローナル抗体の0.1mg/ml溶液 20μｌ １％ラテックス試薬（例１） 20μｌ からなる試薬を37℃で５分間定温保持し、引続き濃度10
-6モル/lのT4とビオチンとからなる接合体20μｌを加え
る。
混濁度の増加動向を測定し、吸光度の変化を単位時間
（５分間）当たり、405nmで測定した。その際次の測定
値が得られた： 第Ｉ表 試料（ng/ml T4） mE/5分 ０ 620 50 500 100 410 200 230 500 60 例３ テオフィリンの測定 トリス−緩衝剤 100mモル/l、pH7.5 300μｌ １％ラテックス試薬（例１） ７μｌ テオフィリンに対するポリクローナル抗体 （Fab2濃度5mg/ml） ７μｌ を混合することによって試薬を製造し、37℃で５分間定
温保持する。引続きテオフィリンとビオチンとからなる
接合体５×10-6モル/lを加え、吸光度変化を4.2分の時
間差で450nmで測定する。結果は第II表に示す。
（５分間）当たり、405nmで測定した。その際次の測定
値が得られた： 第Ｉ表 試料（ng/ml T4） mE/5分 ０ 620 50 500 100 410 200 230 500 60 例３ テオフィリンの測定 トリス−緩衝剤 100mモル/l、pH7.5 300μｌ １％ラテックス試薬（例１） ７μｌ テオフィリンに対するポリクローナル抗体 （Fab2濃度5mg/ml） ７μｌ を混合することによって試薬を製造し、37℃で５分間定
温保持する。引続きテオフィリンとビオチンとからなる
接合体５×10-6モル/lを加え、吸光度変化を4.2分の時
間差で450nmで測定する。結果は第II表に示す。
第II表 試料（uM/lラオフィリン） mE/4.2分 ０ 1050 0.5 880 2.5 800 ５ 550 12.5 320 25 230 50 70 125 40 例４ 公知技術水準との比較 本発明方法を欧州特許第73611号明細書に相応する方法
と比較した。被覆した担体として、担体当たりT4 -4分子
を含むストレプアビジンを使用した。
と比較した。被覆した担体として、担体当たりT4 -4分子
を含むストレプアビジンを使用した。
この担体は、T4とビオチンとからなる接合体（濃度10-4
モル/l）20μｌをストレプトアビジン（濃度2.5×10-5
モル/l）20μｌと一緒にし、30分間定温保持することに
よって製造した。反応終了後、この試薬はビオチンを介
してストレプトアビジンに結び付いたT4を含んでいた。
モル/l）20μｌをストレプトアビジン（濃度2.5×10-5
モル/l）20μｌと一緒にし、30分間定温保持することに
よって製造した。反応終了後、この試薬はビオチンを介
してストレプトアビジンに結び付いたT4を含んでいた。
比較実験の実施 燐酸塩緩衝剤50mモル（pH7.5、＋４％ポリエチレングリ
コール40000）820μｌを、上記のようにして製造したス
トレプトアピジン試薬40μｌと一緒にし、試料（０モル
/lT4）を加えた。同時にT4に対するポリクローナル抗体
に対し3mg/l抗体の溶液100μｌを加え、吸光度変化を３
分間当たり340nmで追跡した。
コール40000）820μｌを、上記のようにして製造したス
トレプトアピジン試薬40μｌと一緒にし、試料（０モル
/lT4）を加えた。同時にT4に対するポリクローナル抗体
に対し3mg/l抗体の溶液100μｌを加え、吸光度変化を３
分間当たり340nmで追跡した。
本発明による方法、方法A: 燐酸塩緩衝剤50mモル/l（pH7.5、＋４ポリエチレングリ
コール40000）820μｌをT4とビオチンとからなる接合体
（濃度10-4モル/l、メタノール中）20μｌ及びT4に対す
るポリクローナル抗体（3mg/ml）100μｌと一緒にし、
５分間定温保持した。ストレプトアビジン（濃度2.5×1
0-5モル/l）20μｌを加えた後、吸光度変化を３分間当
たり340nmで追跡した。
コール40000）820μｌをT4とビオチンとからなる接合体
（濃度10-4モル/l、メタノール中）20μｌ及びT4に対す
るポリクローナル抗体（3mg/ml）100μｌと一緒にし、
５分間定温保持した。ストレプトアビジン（濃度2.5×1
0-5モル/l）20μｌを加えた後、吸光度変化を３分間当
たり340nmで追跡した。
本発明による方法、方法B: 燐酸塩緩衝剤50mモル/l（pH7.5、＋４％ポリエチレング
リコール40000）820μｌを、燐酸塩緩衝剤200mモル（pH
7.5）中のストレプトアビジン（2.5×10-5モル/l）20μ
ｌ及びT4に対するポリクローナル抗体（3mg/ml）100μ
ｌと一緒にし、37℃で５分間定温保持した。T4とビオチ
ンとからなる接合体（濃度10-4モル/l）20μｌを加えた
後、吸光度変化を３分間当たり340nmで追跡した。
リコール40000）820μｌを、燐酸塩緩衝剤200mモル（pH
7.5）中のストレプトアビジン（2.5×10-5モル/l）20μ
ｌ及びT4に対するポリクローナル抗体（3mg/ml）100μ
ｌと一緒にし、37℃で５分間定温保持した。T4とビオチ
ンとからなる接合体（濃度10-4モル/l）20μｌを加えた
後、吸光度変化を３分間当たり340nmで追跡した。
比較実験の結果は次の通りである： 比較:35mE 本発明による方法、方法A: 646mE 本発明による方法、方法B: 414mE 同じ条件下に本発明による方法では公知技術水準による
方法に比べて一層高い感度を得ることができることを示
す。
方法に比べて一層高い感度を得ることができることを示
す。
第１図は本発明方法の種々異なる実施例の反応原理を示
す略示図である。
す略示図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭55−10590（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−118672（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−501674（ＪＰ，Ａ) 欧州特許公開89806（ＥＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】試料溶液を少なくとも３種の受容体R1,R2
及びR3（そのうちのR1及びR2は互いに結合可能であり、
R3は測定すべき物質と特異的に結合可能である）と共に
定温保持し、反応に際して生じる凝集を測定することに
よって、特異的に結合可能の物質を測定する方法におい
て、受容体R1として特異的に結合する対物質の一方のパ
ートナーＰと、測定すべき物質に相当するか又はその誘
導体でかつ測定すべき物質のエピトロープを少なくとも
１個有する物質Ｓとからなる接合体を使用し、またR2と
してＰに対する少なくとも２個の結合部位を有する受容
体を使用し、その際R1はR2に対する唯一の結合部位を有
し、更にR3として少なくとも２個の結合部位を有しかつ
そのうちの少なくとも一方が測定すべき物質又はＳのエ
ピトロープと特異的に結合する受容体を使用することを
特徴とする、特異的に結合可能の物質を測定する方法。 - 【請求項２】特異的に結合する対物質の一方のパートナ
ーＰと、測定すべき物質に相当するか又はその誘導体で
かつ測定すべき物質のエピトロープを少なくとも１個有
する物質Ｓとからなる接合体である受容体R1、及びＰに
対する少なくとも２個の結合部位を有する受容体R2を含
有し、その際R1はR2に対する唯一の結合部位を有し、更
に少なくとも２個の結合部位を有しかつそのうちの少な
くとも一方が測定すべき物質又はＳのエピトープと特異
的に結合する受容体R3を含有することを特徴とする、特
異的に結合可能の物質を測定する試薬。
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