CN112391448A - 一种用于外泌体及表面蛋白分析的dna纳米分子机器及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于外泌体及表面蛋白分析的DNA纳米分子机器及应用。包含可对外泌体表面标志物产生响应的识别探针、包含两个Toehold区域的信号探针以及可驱动链置换反应循环进行的燃料探针。外泌体通过其表面标志物与识别探针中的特异适配体发生多价结合，释放识别探针中的引发链；引发链侵入信号探针，通过结合Toehold区域Ⅰ，驱动链的分支迁移释放出淬灭链，解放荧光报告基团，并暴露出隐藏的Toehold区域Ⅱ；燃料探针通过结合Toehold区域Ⅱ，启动Toehold介导的链置换循环反应，发生连续的分支迁移和多价回收。可实现外泌体的超灵敏定量检测；可实现外泌体表面两种或多种蛋白标志物的双色或多色分析；操作简单，耗时短，样品消耗量少，灵敏度高、特异性好。

Description

一种用于外泌体及表面蛋白分析的DNA纳米分子机器及应用
技术领域
本发明属于快速检测技术领域，具体涉及一种外泌体或外泌体表面蛋白驱动的DNA纳米分子机器，其可用于外泌体及表面蛋白的定性和定量分析。它具有多价循环扩增的信号响应机制，能用于对肿瘤外泌体和外泌体表型分子的超灵敏检测。
背景技术
近些年来，精准医学的液体活检技术被广泛用于肿瘤的早期筛查，辅助诊断，疗效监测和药效预测。与传统的组织活检相比，液体活检具有无创性，能实时动态检测、克服肿瘤异质性、提供全面检测信息等独特优势。
目前的临床研究中，液体活检技术主要包括游离循环肿瘤细胞(CTCs)检测、循环肿瘤DNA(ctDNA)检测、外泌体检测等。外泌体是一种直径范围为30-150nm的双层磷脂膜封装的微囊泡，可来源于各种类型的细胞，包括淋巴细胞，神经细胞，上皮细胞和各种肿瘤细胞等。细胞内多囊泡体与胞膜通过内吞、融合、外排等过程向胞外分泌外泌体，释放到各种体液中。外泌体膜表面及囊泡内存在有多种生物活性物质，包括蛋白质、脂质和DNA片段，还包括一些小分子RNA，如miRNA、lncRNA和mRMA等。藉由外泌体的转运，一些生物信息分子可以激活细胞表面受体，外泌体内容物可进入靶细胞内，对靶细胞起调节作用。因此，外泌体可参与免疫应答、抗原提呈和细胞间通讯等多种生理过程。肿瘤细胞来源的外泌体通过介导肿瘤细胞与周围及远端的组织或基质细胞之间的信息传递，可以实现对肿瘤细胞的增殖、转移以及肿瘤耐药等生物学行为的调控。由于外泌体的分子特征可以精确地反映其生物来源，从这些体液中分离提取外泌体，对其携带的肿瘤特异性表型蛋白和核酸分子进行鉴定和定量，有助于肿瘤的早期诊断，治疗监测和预后判断。
迄今为止，研究人员根据外泌体的生物学特征开发出多种外泌体的检测方法，常用的传统方法包括酶联免疫吸附技术(ELISA)和蛋白免疫印迹技术(Western blot)等，但是这些方法步骤繁琐，对操作者有较高的技能要求。近些年来，以流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)为代表的生物颗粒计数技术以及表面等离子体共振(SPR)、表面增强拉曼光谱技术(SERS)、场效应晶体管(FET)和电化学分析等生物传感平台也被广泛应用于外泌体的检测，并具有较好的检测性能。然而这些方法都依赖于昂贵的仪器设备，生物传感器件的制备还需要复杂的纳米制备工艺或者繁琐的界面工程，并且大多数生物传感技术需要昂贵的抗体来作为外泌体的识别元件，难以在临床实验室广泛开展。因此，我们急需开发出一种简单易行、价格低廉，适用于临床实验室的外泌体检测方法。荧光分析是临床上一种常规的检测平台，具有仪器成本低、操作简便等优点，近年来，已有报道采用荧光分析策略的外泌体的检测方案，并且取得了不同程度的成功。如刘映昕等采用上转换纳米材料(UCNPs)与金纳米棒(Au NRs)之间的荧光共振能量转移效应来检测外泌体。王慧等利用氧化石墨烯对单链荧光适配体的吸附和荧光淬灭效应来检测外泌体。这些方法虽然有效，但灵敏度相对较低，且不能实现同时对外泌体进行定量和表型分析。
因此，一种能够进行外泌体及其表面蛋白的定量和表型分析，灵敏度高的且成本低廉的快速检测系统亟待开发。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术的不足：现有外泌体或表面蛋白检测的分析步骤繁琐，仪器设备昂贵，灵敏度不高等问题，而提供一种均匀液相体系下进行外泌体及其表面蛋白分析的DNA纳米分子机器、基于DNA纳米分子机器的外泌体及其表面蛋白分析荧光生物传感系统。其用于外泌体或表面蛋白检测的分析灵敏度高，可同时实现定量和表型分析，并可用于多外泌体和/或表面蛋白的分析。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
提供一种均匀液相体系下进行外泌体及其表面蛋白分析的DNA纳米分子机器，包括识别探针、信号探针和燃料探针；
识别探针是由引发链a与核酸适配体序列部分杂交形成的双链DNA结构，所述核酸适配体是指可与外泌体表面蛋白标志物特异识别结合的单链DNA；
信号探针是由三条DNA单链通过杂交反应自组装而成的双链DNA结构，三条DNA单链分别是：中间修饰有荧光报告基团的信号链d、末端修饰有荧光淬灭基团的淬灭链b和保护链c，淬灭链b和保护链c分别与信号链d上相邻两个区域互补杂交，且淬灭链b和保护链c间无碱基间隔，淬灭链b末端修饰的荧光淬灭基团和信号链d中间修饰的荧光报告基团对应位于双链间互补的碱基对上，信号链d上靠近淬灭链b的一端有一段未杂交序列，形成一个粘性末端，作为第一Toehold区域，介导由引发链a侵入引起的链置换反应；在信号探针中部荧光基团修饰位点区域隐藏有第二Toehold区域，介导由燃料链驱动的循环链置换反应的发生；
燃料探针是一条与信号链d序列互补的DNA单链，即燃料链e，其与信号链d互补杂交区域涵盖了信号链d上的荧光报告基团修饰位点，其序列长度长于淬灭链b和保护链c。
按上述方案，引发链a和信号链d上粘性末端以及信号长链上杂交淬灭链b的一部分杂交，引发链a、保护链c和信号链d杂交形成的双链结构中的单链部分为隐藏的第二Toehold区域；所述的燃料链e与信号链d互补杂交区域涵盖了信号链d上隐藏的第二Toehold区域。
进一步地，所述的外泌体及其表面蛋白包括CD81、CD9、CD63、PD-L1、EpCAM、PTK-7、PSMA、PDGF、AFP、CEA、GPC-1等。
按上述方案，所述的外泌体表面蛋白为CD63,各探针序列如下表1所示，
表1CD63识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列
Figure BDA0002474101890000031
按上述方案，所述的外泌体表面蛋白为PD-L1,各探针序列如下表2所示：
表2PD-L1识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列
Figure BDA0002474101890000032
Figure BDA0002474101890000041
进一步地，荧光报告基团为FAM、Cy3、Cy5等，对应的荧光淬灭基团分别为BHQ1、BHQ2、BHQ2等。
进一步地，所述的DNA纳米分子机器含有多组分别与不同待检测外泌体表面蛋白标志物相对应的识别探针、信号探针和燃料探针，每组中的信号探针上修饰的荧光报告基团不同，用于多外泌体和/或外泌体表面蛋白的分析检测。所述荧光报告基团不同，主要指其该荧光报告基团对应的荧光激发波长和发射波长不同，互不干扰，避免多外泌体表面蛋白的分析检测中的干扰。
DNA纳米分子机器的制备方法，包括以下步骤：
(1)识别探针的制备：将核酸适配体和引发链a加入到一定体积连接反应缓冲液中，加热变性使DNA链打开局部二级结构，迅速降温至室温，使得两条寡核苷酸链杂交为识别探针，可4℃下保存备用；
(2))信号探针的制备：将淬灭链b、信号链d和保护链c加入到链置换反应缓冲液中，混匀，使三条寡核苷酸链发生等温杂交形成一端为粘性末端的信号探针，可4℃下保存备用。
按上述方案，优选地，核酸适配体和引发链a溶液按照终浓度为等比左右使用；淬灭链b、信号链d和保护链c按照终浓度为等比左右使用。
按上述方案，步骤(1)的加热变性为：95℃条件下变性5min。
按上述方案，步骤(2)中的杂交为：放置在37℃恒温箱中至少30min。
包括DNA纳米分子机器的荧光生物传感系统，包括荧光分析系统和DNA纳米分子机器。
一种进行外泌体及其表面蛋白分析的方法，包括以下步骤：将待测外泌体样品配成溶液，然后与识别探针溶液加入反应缓冲液体系中混合均匀，孵育反应；
将上述反应液和燃料探针溶液一起加入到含有信号探针的反应缓冲液中，室温反应，观察荧光发光情况，记录荧光强度变化，根据荧光发光情况及荧光强度变化进行外泌体分析。
按上述方案，所述的定量分析为：基于荧光强度变化值-外泌体浓度标准曲线，根据荧光强度变化值，进行外泌体浓度的定量分析，所述的荧光强度变化值△F为外泌体表面蛋白引起的荧光信号强度(FCD63)与背景信号(F0)之间的差值。
按上述方案，所述的荧光报告基团为Cy3，荧光检测条件：激发波长为550nm，发射波长为567nm；
所述的荧光报告基团为FAM时，荧光检测条件：激发波长为490nm，发射波长为522nm；
所述的荧光报告基团为Cy5时，荧光检测条件：激发波长为650nm，发射波长为670nm。
按上述方案，所述的荧光测定条件荧光光谱收集范围设置为500nm-700nm。
按上述方案，所述的孵育反应为在37℃温箱中孵育30min。
该分子机器包含三个核心部件：可对外泌体表面标志物产生响应的识别探针、包含两个Toehold区域的信号探针以及可驱动链置换反应循环进行的燃料探针。外泌体通过其表面标志物与识别探针中的特异适配体发生多价结合，释放识别探针中的引发链；引发链侵入信号探针，通过结合Toehold区域Ⅰ，驱动链的分支迁移释放出淬灭链，解放荧光报告基团，并暴露出隐藏的Toehold区域Ⅱ；燃料探针通过结合Toehold区域Ⅱ，启动Toehold介导的链置换循环反应，发生连续的分支迁移和多价回收。基于信号探针中的荧光信号转导机制，由外泌体表面标志物与其核酸适配体之间的分子识别事件可引发DNA纳米分子机器连续释放大量荧光报告基团，实现信号放大，为外泌体分析提供了一个高灵敏、高特异的无酶催化生物传感平台。
以CD63为例(CD63是存在外泌体膜上的四跨膜蛋白家族(包括CD63,CD81,CD9等)中的一员，作为外泌体表面特征标志物，CD63表达水平常被广泛用于外泌体的定量)，由外泌体CD63驱动的DNA纳米分子机器包括三个核心部件：识别探针、信号探针和燃料探针，见图1。
识别探针是由引发链a与CD63的核酸适配体(AptCD63)序列的部分杂交形成的双链DNA结构。
信号探针是由两条DNA短链(BHQ2末端修饰的淬灭链b和保护链c)和一条DNA长链(Cy3中间修饰的报告链，信号链d)杂交形成的双链DNA结构。信号探针自组装成功后，其内部修饰的Cy3和BHQ2基团由于位置临近可发生荧光能量共振转移(FRET)，使报告基团的荧光发生淬灭。此外，在信号探针的一端有一个粘性末端，作为Toehold区域Ⅰ，信号探针的中段隐藏着Toehold区域Ⅱ。
燃料探针是一条与信号链d部分序列互补的DNA单链，命名为燃料链e。
以CD63外泌体为例，该DNA纳米分子机器运行原理说明如下，见图1：由于外泌体CD63和其适配体之间的结合在特异性和热力学上更有优势，在靶外泌体存在的情况下，引发链a可以从亚稳态识别探针中释放出来。游离的引发链a通过与信号探针中的Toehold区域Ⅰ识别和杂交，通过竞争的动力学过程进行DNA的分支迁移，即由Toehold区域Ⅰ介导的链置换反应，使BHQ2修饰的淬灭链b被置换出来，形成热力学比较稳定的新信号探针。淬灭链b的离开导致FRET(荧光共振能量转移)效应减弱，信号链上标记的荧光报告基团Cy3的荧光信号得以释放。与此同时，在新的信号探针的中段暴露形成一段DNA单链缺口，即为Toehold区域Ⅱ。能够识别Toehold区域Ⅱ的燃料链e侵入，再次发生DNA分支迁移，即由Toehold区域Ⅱ介导的链置换反应，使新信号探针中的a链和保护链c均被置换出来，形成热力学更为稳定的由e链和d链组成的新双链DNA结构。再次被释放出来的a链可以进一步与体系中另一个Toehold区域Ⅰ杂交，开始下一轮由Toehold区域介导的链置换反应，从而开启链置换的循环反应。这意味着单个外泌体表面分子的识别事件可以引发荧光信号的连续释放，使外泌体CD63的响应信号实现了数个数量级的放大。通过记录Cy3荧光信号的快速变化，可以实现对外泌体CD63高灵敏的检测。
进一步，本发明的DNA纳米分子机器可用于多外泌体和或外泌体表面蛋白的检测，通过一步法实现多外泌体和/或表面蛋白的分析，满足外泌体双色表型分析的需求。
以一种双色外泌体表型分析为例：我们设计了两组采用不同荧光淬灭基团和报告基团组合进行标记的DNA纳米分子机器(以外泌体表面的CD63和PD-L1为例，外泌体PD-L1采用FAM-BHQ1组合，外泌体CD63采用Cy3-BHQ2组合)。在外泌体存在的情况下，外泌体表面CD63和PD-L1分别被其特异的适配体识别探针识别响应，触发两组独立的DNA纳米分子机器运行(图2)。然后采用双色激发(激发波长CD63为550nm，PD-L1为490nm)和双色荧光(发射波长CD63为567nm，PD-L1为522nm)检测来实现两种外泌体表面标志物的一步法检测。
本发明基于TOEHOLD链置换反应的DNA纳米技术作为外泌体检测的信号放大策略，以及DNA独特的组成多样性和可预测的互补碱基配对原理，可自组装成不同的纳米结构，成功构建了功能化的DNA纳米分子机器。其能利用核酸适配体对外泌体表面分子的特异性识别作用，来驱动无酶催化的Toehold介导的链置换循环反应，为一种外泌体激活的DNA纳米分子机器。具有多价循环扩增的信号响应机制以及无酶、恒温的反应特点，可以在短时间内实现目标物与信号输出1：N的转换，能用于对肿瘤外泌体和外泌体表型分子的超灵敏检测，实现在均相(液相)体系中高灵敏，高特异和快速的外泌体定量和表型分析。进而，通过将两种靶向不同外泌体表面标志物(如CD63和PD-L1)的DNA纳米分子机器协同运行，很容易实现针对外泌体表面标志物的双色分析。具有操作简便，成本低廉，检测快速的特点，为肿瘤的早期诊断和治疗监测提供了一种简单有效的方案，具有广阔的应用前景。
本发明相对现有技术具有的有益效果如下：
1)可实现外泌体的超灵敏定量检测；
2)可实现外泌体表面两种或多种蛋白标志物的双色或多色分析；
3)该系统操作简单，耗时短，样品消耗量少，灵敏度高、特异性好；
4)本系统所涉及的分析设备为临床实验室常规检测仪器——荧光分析仪，构建的DNA分子机器所需的试剂成分为DNA链，合成成本低，易于保存；
5)通过将核酸适配体技术、DNA纳米机器技术和荧光分析技术的结合实现了多种肿瘤来源的外泌体的准确定量和表型分析，对多种肿瘤的早期诊断、治疗监测以及预后判断具有重要指导意义；
6)本发明的信号响应和信号增强策略具有通用性，可协同外泌体多价、特异性分子识别的属性来实现外泌体表面各种标志物的高灵敏、高特异检测，而不涉及很多信号放大方法中需要用到的任何酶。
附图说明：
图1是根据本发明的一个优选实施例外泌体激活的的DNA分子纳米机器系统定量检测外泌体的流程示意图；
图2是采用双色多价策略同时检测外泌体双表面标志物的示意图；
图3DNA纳米分子机器检测外泌体的灵敏度和线性范围：A)ExoADM检测一系列不同浓度外泌体(0，4.5×104、4.5×105、4.5×106、4.5×107、4.5×108)的荧光光谱图；B)DNA纳米分子机器检测外泌体浓度的校准曲线；
图4双色DNA纳米分子机器检测PC-3外泌体CD63和PD-L1的可行性：A)双色激发下(490nm和550nm)外泌体PD-L1和CD63的响应荧光光谱；B)、C)外泌体PD-L1和CD63在单双色模式下的荧光光谱对比；D)、E)不同浓度外泌体在单双色模式下检测CD63和PD-L1的荧光信号对比；
表1是靶向CD63识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列
表2是靶向PD-L1识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列
具体实施方式
使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
用于肿瘤细胞培养上清中外泌体定量的DNA分子纳米机器，包括：
识别探针是由引发链a在与CD63的核酸适配体(Apt-CD63)序列部分杂交形成的双链DNA结构。识别探针的制备：将核酸适配体和引发链a按终浓度比为1：1加入到一定体积连接反应缓冲液中，在95℃条件下变性5min使DNA链打开局部二级结构，迅速降温至室温，使得两条寡核苷酸链杂交为识别探针，4℃下保存备用。
信号探针是由两条DNA短链(BHQ2末端修饰的淬灭链b和保护链c)和一条DNA长链(Cy3中间修饰的报告链)杂交形成的双链DNA结构。信号探针自组装成功后，其内部修饰的Cy3和BHQ2基团由于位置临近使得Cy3的荧光被BHQ2淬灭。此外，在信号探针的一端有一个粘性末端，作为Toehold区域Ⅰ，信号探针的中段隐藏着Toehold区域Ⅱ。信号探针的制备：将淬灭链b、信号链d和保护链c按照终浓度为1：1：1加入到链置换反应缓冲液中，混匀，并将此溶液放置在37℃恒温箱中至少30min，使三条寡核苷酸链发生等温杂交形成一端为粘性末端的信号探针，4℃下保存备用。
燃料探针即为一条与信号；与信号链d部分序列互补的DNA单链，命名为燃料链e。燃料探针的制备：配置一定浓度的燃料链E，4℃下保存，备用。
CD63识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列见表3。
表3CD63识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列
Figure BDA0002474101890000081
Figure BDA0002474101890000091
此实施例的外泌体为肝癌HepG2细胞培养上清中分离得到的外泌体。具体检测方法如下：从-80℃冰箱中取出外泌体样本，在冰上复溶。分别将一定体积不同浓度的外泌体溶液与一定体积识别探针溶液加入反应缓冲液体系中混合均匀，在37℃温箱中孵育30min。将上述反应液和一定体积燃料探针溶液一起加入到含有信号探针的反应缓冲液中，总体系为1mL，室温下反应30min。对外泌体表面CD63引起的荧光强度变化，选择在激发波长为550nm，发射波长为567nm下测量。测定条件为激发电压为600V，狭缝宽度均5nm，荧光光谱收集范围设置为500nm-600nm。
检测结果：外泌体CD63驱动的DNA纳米机器对外泌体的信号响应呈现明显的浓度依赖(图3A)。外泌体浓度从4.5×108particles/mL(颗粒/ml)到4.5×104particles/mL(颗粒/ml)，相应荧光信号逐渐减小。荧光信号(激发光550nm，发射光567nm)的变化(△F)与外泌体浓度对数呈现良好的线性关系(图3B)。回归方程为：ΔF＝114.96lgc-447.61，其中△F为外泌体CD63引起的荧光信号强度(FCD63)与背景信号(F0)之间的差值，c为外泌体浓度，R2为0.9312。用3σ法计算该检测体系的最低检测限为3.3×104particles/mL。
实施例2
用于肿瘤细胞培养上清中外泌体双色表型分析(CD63和PD-L1)的DNA纳米分子机器，包括：
识别探针：CD63识别探针是由引发链aCD63与CD63的核酸适配体(AptCD63)序列部分杂交形成的双链DNA结构。PD-L1识别探针是由引发链aPD-L1在与PD-L1的核酸适配体(AptPD-L1)序列部分杂交形成的双链DNA结构。识别探针的制备方式同实施例1。
信号探针：CD63信号探针是由两条DNA短链(BHQ2末端修饰的淬灭链bCD63和保护链cCD63)和一条DNA长链(Cy3中间修饰的报告链)杂交形成的双链DNA结构。信号探针自组装成功后，其内部修饰的Cy3和BHQ2基团由于位置临近使得Cy3的荧光被BHQ2淬灭。此外，在信号探针的一端有一个粘性末端，作为Toehold区域ⅠCD63，信号探针的中段隐藏着Toehold区域ⅡCD63。PD-L1信号探针是由两条DNA短链(BHQ1末端修饰的淬灭链bPD-L1和保护链cPD-L1)和一条DNA长链(FAM中间修饰的报告链)杂交形成的双链DNA结构。信号探针自组装成功后，其内部修饰的FAM和BHQ1基团由于位置临近使得FAM的荧光被BHQ1淬灭。此外，在信号探针的一端有一个粘性末端，作为Toehold区域ⅠPD-L1，信号探针的中段隐藏着Toehold区域ⅡPD-L1。信号探针的制备方式同实施例1。
燃料探针：CD63燃料探针即为一条与信号链dCD63部分序列互补的DNA单链，命名为燃料链eCD63。PD-L1燃料探针即为一条与信号链dPD-L1部分序列互补的DNA单链，命名为燃料链ePD-L1。燃料探针的制备方式同实施例1。
PD-L1识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列见表4。
表4PD-L1识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列
Figure BDA0002474101890000101
此实施例的外泌体样品为雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3培养上清中分离得到的外泌体。具体检测方法是直接将两组(CD63和PD-L1)DNA纳米分子机器的DNA探针与目标外泌体混合在一起。外泌体表面CD63和PD-L1分别被其特异的适配体识别探针识别响应，触发两组独立的DNA纳米分子机器运行。两组DNA纳米机器连续释放出各自的信号链d，相应荧光信号持续增大。利用不同的激发波长(CD63为550nm，PD-L1为490nm)，可观察到能明显区分的双色荧光信号(CD63为567nm，PD-L1为522nm，发射光谱扫描范围为500-600nm)。
检测结果：这种双色激发双色分析的策略，使得针对外泌体表面两种蛋白标志物的报告基团和淬灭基团组合之间避免了信号干扰(图4A)：即当我们分别采用双色分析和单色分析检测外泌体的一种标志物时，其双色信号变化与单色分析时的信号变化基本一致(图4B-C)。我们分别采用双色和单色分析策略测定了低、中、高浓度的外泌体CD63和PD-L1水平，可见随着外泌体浓度升高，外泌体CD63和PD-L1响应信号逐渐升高，且单色和双色检测信号之间无明显差异(图4D-E)。因此采用双色DNA纳米分子机器可同时准确、灵敏地检测CD63和PD-L1在外泌体表面的表达水平。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种均匀液相体系下进行外泌体及其表面蛋白分析的DNA纳米分子机器，其特征在于：包括识别探针、信号探针和燃料探针；
识别探针是由引发链a与核酸适配体序列部分杂交形成的双链DNA结构，所述核酸适配体是指可与外泌体表面蛋白标志物特异识别结合的单链DNA；
信号探针是由三条DNA单链通过杂交反应自组装而成的双链DNA结构，三条DNA单链分别是：中间修饰有荧光报告基团的信号链d、末端修饰有荧光淬灭基团的淬灭链b和保护链c，淬灭链b和保护链c分别与信号链d上相邻两个区域互补杂交，且淬灭链b和保护链c间无碱基间隔，淬灭链b末端修饰的淬灭基团和信号链d中间修饰的报告基团对应位于双链间互补的碱基对上，信号链d上靠近淬灭链b的一端有一段未杂交序列，形成一个粘性末端，作为第一Toehold区域，介导由引发链a侵入引起的链置换反应；在信号探针中部荧光基团修饰位点区域隐藏有第二Toehold区域，介导由燃料链驱动的循环链置换反应的发生；
燃料探针是一条与信号链d序列互补的DNA单链，即燃料链e，其与信号链d互补杂交区域涵盖信号链d上的荧光报告基团修饰位点，序列长度长于淬灭链b和保护链c。
2.根据权利要求1所述的DNA纳米分子机器，其特征在于：引发链a和信号链d上粘性末端以及信号长链上杂交淬灭链b的一部分杂交，引发链a、保护链c和信号链d杂交形成的双链结构中的单链部分为隐藏的第二Toehold区域；所述的燃料链e与信号链d互补杂交区域涵盖了信号链d上隐藏的第二Toehold区域。
3.根据权利要求1所述的DNA纳米分子机器，其特征在于：所述的外泌体及其表面蛋白包括CD81、CD9、CD63、PD-L1、EpCAM、PTK-7、PSMA、PDGF、AFP、CEA、GPC-1。
4.根据权利要求1所述的DNA纳米分子机器，其特征在于：所述的外泌体表面蛋白为CD63，各探针序列如下表1所示，
表1
Figure FDA0002474101880000011
Figure FDA0002474101880000021
所述的外泌体表面蛋白为PD-L1,各探针序列如下表2所示：
表2 PD-L1识别探针、信号探针和燃料探针的DNA序列
Figure FDA0002474101880000022
5.根据权利要求1所述的DNA纳米分子机器，其特征在于：荧光报告基团为FAM、Cy3、Cy5等，对应的荧光淬灭基团分别为BHQ1、BHQ2、BHQ2。
6.根据权利要求1所述的DNA纳米分子机器，其特征在于：所述的DNA纳米分子机器含有多组分别与不同待检测外泌体表面蛋白标志物相对应的识别探针、信号探针和燃料探针，每组中的信号探针上修饰的荧光报告基团不同，用于多外泌体和/或外泌体表面蛋白的分析检测。
7.权利要求1所述的DNA纳米分子机器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)识别探针的制备：将核酸适配体和引发链a加入到一定体积连接反应缓冲液中，加热变性使DNA链打开局部二级结构，迅速降温至室温，使得两条寡核苷酸链杂交为识别探针，可4℃下保存备用；
(2))信号探针的制备：将淬灭链b、信号链d和保护链c加入到链置换反应缓冲液中，混匀，使三条寡核苷酸链发生等温杂交形成一端为粘性末端的信号探针，可4℃下保存备用。
8.包括DNA纳米分子机器的荧光生物传感系统，其特征在于：包括荧光分析系统和权利要求1所述的DNA纳米分子机器。
9.一种利用权利要求1所述的DNA纳米分子机器进行外泌体及其表面蛋白分析的方法，其特征在于：包括以下步骤：将待测外泌体样品配成溶液，然后与识别探针溶液加入反应缓冲液体系中混合均匀，孵育反应；
将上述反应液和燃料探针溶液一起加入到含有信号探针的反应缓冲液中，室温反应，观察荧光发光情况，记录荧光强度变化，根据荧光发光情况及荧光强度变化进行外泌体分析，其中，所述的定量分析为：基于荧光强度变化值-外泌体浓度标准曲线，根据荧光强度变化值，进行外泌体浓度的定量分析，所述的荧光强度变化值△F为外泌体表面蛋白引起的荧光信号强度(FCD63)与背景信号(F0)之间的差值。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述的荧光测定条件荧光光谱收集范围设置为500nm-700nm；
所述的荧光报告基团为Cy3，荧光检测条件：激发波长为550nm，发射波长为567nm；
所述的荧光报告基团为FAM时，荧光检测条件：激发波长为490nm，发射波长为522nm；
所述的荧光报告基团为Cy5时，荧光检测条件：激发波长为650nm，发射波长为670nm。
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