CN113930482A - 三维dna步行器及其在肿瘤外泌体检测中的应用 - Google Patents

三维dna步行器及其在肿瘤外泌体检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种三维DNA步行器及其在肿瘤外泌体检测中的应用，三维DNA步行器包括裂开型探针a、裂开型探针b、发夹H1和发夹H2；裂开型探针a由裂开型Aptamer序列Apt‑a和裂开型触发序列Ta连接而成，裂开型探针b由裂开型Aptamer序列Apt‑b和裂开型触发序列Tb连接而成。本发明利用靶标外泌体作为三维轨道载体，通过胆固醇‑磷脂双分子层相互作用即可快速、方便地合成催化发夹组装的三维轨道，极大地简化实验操作过程。受益于Aptamer特异性识别性能和基于裂开型触发链策略的低背景优势，三维DNA步行器可用于检测肿瘤外泌体，在复杂体系、甚至临床血浆中也能实现靶标的直接检测。

Description

三维DNA步行器及其在肿瘤外泌体检测中的应用
技术领域
本发明属于生物化学领域中的检测方法，尤其涉及一种三维DNA步行器及其在肿瘤外泌体检测中的应用。
背景技术
糖基化作为生物体内最丰富的蛋白质翻译后修饰(PMT)形式之一，与肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关，因此有助于更好地了解外泌体在细胞间通讯中的信号传导特性。肿瘤来源外泌体(Exos)是纳米级细胞外囊泡，通过选择性包裹蛋白、核酸和脂质等生物活性分子，并将其转移到受体细胞，而在生理和病理过程中发挥重要作用。因此，监测外泌体表面糖蛋白的表达水平对生物学功能研究具有重要意义。然而，在肿瘤早期阶段，肿瘤外泌体的丰度很低，其信号通常被大量存在的异质性外泌体所掩盖。此外，外泌体糖蛋白在调节生物学功能方面的研究仍然很少。因此，通过分析外泌体糖蛋白来实现生物体液中低浓度肿瘤外泌体的高灵敏和高准确分析是非常可取，但具有极大挑战性。
三维DNA步行器作为最突出的分子机器之一，由于其大的比表面积和高的装载量而表现出更强的信号放大能力，因此在生物传感器的构建中显示出巨大的应用潜力。目前，已发展的以三维纳米材料为轨道载体的DNA步行器主要是基于金纳米颗粒、磁珠等。尽管这些传统DNA步行器的检测灵敏度得到了很大提升，但轨道组件的低效组装和通过化学键锚定的DNA行走链，会限制DNA步行器的自由行走，导致其行走效率降低。同时该轨道制备过程存在操作复杂、合成产率低、合成成本高等问题，这些都会极大地限制其临床诊断应用。因此，发展一种轨道制备简单且行走效率高的DNA步行器用于肿瘤外泌体的高灵敏、高特异性和高准确性检测有望为肿瘤早期诊断提供技术方法与重要信息。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种制备简单且行走效率高的轨道自助型三维DNA步行器及其在肿瘤外泌体检测中的应用，以解决传统DNA步行器存在的轨道制作复杂、合成产率低、合成成本高、耗时等问题。
为了实现上述目的，本发明提供了一种三维DNA步行器，所述三维DNA步行器包括裂开型探针a、裂开型探针b、发夹H1和发夹H2；所述裂开型探针a由裂开型Aptamer序列Apt-a和裂开型触发序列Ta连接而成，所述裂开型探针b由Apt-b和Tb连接而成；
所述裂开型Aptamer序列Apt-a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述裂开型Aptamer序列Apt-b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述裂开型触发序列Ta的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述裂开型触发序列Tb的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述发夹H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述发夹H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
上述的三维DNA步行器，进一步的，所述裂开型Aptamer序列Apt-a、裂开型触发序列Ta通过链接片段linker连接形成，
所述链接片段linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.5。
上述的三维DNA步行器，进一步的，荧光供体染料分子Cy3修饰在发夹H1的中间骨架上；荧光受体染料分子Cy5修饰在发夹H2的中间骨架上。
上述的三维DNA步行器，进一步的，胆固醇修饰在所述发夹H1的5’端和发夹H2的3’端。
上述的三维DNA步行器，进一步的，所述裂开型探针a的DNA序列如SEQ ID NO.8所示；所述裂开型探针b的DNA序列如SEQ ID NO.9所示。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了上述的三维DNA步行器在制备检测肿瘤外泌体检测试剂盒中的应用。进一步的，所述肿瘤为肝癌。
上述的应用，进一步的，所述三维DNA步行器的使用方法为：
(1)将发夹H1和发夹H2与肿瘤外泌体孵育，使发夹H1和H2锚定在肿瘤外泌体膜上；
(2)加入裂开型探针a和裂开型探针b，激活三维DNA步行器行走，记录荧光光谱。
上述的应用，进一步的，所述荧光光谱的激发波长530nm，发射波长550～750nm，激发和发射的狭缝宽度均为10nm。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本方法提供了一种三维DNA步行器，巧妙地利用靶标外泌体作为三维轨道载体，通过简单而高效的胆固醇-磷脂双分子层相互作用即可快速、方便地合成催化发夹组装的三维轨道，无需额外引入纳米载体和复杂化学修饰，极大地简化实验操作过程。
(2)本方法提供了一种三维DNA步行器在制备检测肿瘤外泌体检测试剂盒中的应用，由于空间局域效应，该DNA步行器的信号产生速度和扩增效率明显提高。基于裂开型核酸适配体探针能提高该方法对肿瘤外泌体的特异性识别性能，同时基于裂开型触发链策略能有效降低背景信号，因此该方法展示高灵敏性和特异性，在复杂体系、甚至临床血浆中能实现靶标的直接检测。
(3)本方法提供了一种三维DNA步行器在制备检测肿瘤外泌体检测试剂盒中的应用，基于FRET“Off”到“On”信号读出模式，该方法能有效地避免假阳性信号，这对于高准确度临床诊断非常重要。此外，由于裂开型Aptamer只有在靶蛋白表面发生识别重塑后才能触发反应，因此该方法适用于均相体系中靶标外泌体的免分离、免洗检测。
(4)本方法提供了一种三维DNA步行器在制备检测肝癌外泌体检测试剂盒中的应用，具有操作简单、快速、成本低、抗假阳性强、灵敏度高、特异性强、适用性好等优势，因此在临床诊断中具有巨大的应用潜力，有望为肿瘤早期诊断提供技术方法与重要信息，具有重要的科学价值和社会效益。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明灵敏检测肿瘤外泌体的方法检测原理示意图。
图2为本发明方法对缓冲液中肿瘤外泌体的灵敏度检测结果。
图3为本发明方法对缓冲液中肿瘤外泌体的特异性检测结果。
图4为本发明方法直接检测细胞培养上清液中肿瘤外泌体的灵敏度分析结果。
图5为本发明方法直接检测细胞培养上清液中肿瘤外泌体的特异性分析结果。
图6为本发明方法对临床血浆中肿瘤外泌体的直接检测结果。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的针对SMMC-7721肝癌外泌体的识别探针，包括裂开型探针a、裂开型探针b、发夹H1和发夹H2。
裂开型探针a包括裂开型Aptamer序列Apt-a、裂开型触发序列Ta以及链接片段linker。其中Apt-a和Ta通过链接片段linker连接裂开型探针a。
裂开型探针b包括Apt-b和Tb。Apt-b与Tb连接形成裂开型探针b。
本实施例中的裂开型核酸适配体Apt-a和Apt-b，是将一条完整Aptamer序列裂开成两部分形成，可在外泌体表面靶蛋白上发生特异性识别组装从而形成同完整Aptamer相似识别结构，对SMMC-7721肝癌外泌体具有特异性识别能力的DNA片段。
其中Apt-a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
5’-acggactacctgacg-3’；
Apt-b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-cgtcaggttgagctgaagatcgtaccgtgaagtccgt-3’。
裂开型触发序列是一段能触发催化发夹组装反应的DNA片段，是将一条完整CHA触发序列(T)裂开成两部分形成，包括Ta和Tb，其核苷酸序列为：
其中Ta的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为:5’-tagctcactgac-3’；
Tb的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为:5’-cgacatctaacc-3’。
链接片段linker的加入，可降低识别空间位阻，增加裂开型探针对SMMC-7721肝癌外泌体的识别灵活性。连接片段linker是由多个胸腺嘧啶脱氧核苷酸聚合而成的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：5’-ttt-3’。
将上述Apt-a、Ta和linker三个片段依次连接好后组成了裂开型探针a的全序列，如SEQ ID NO.8所示，具体为：
5’-acggactacctgacgtttagctcactgac-3’。
将上述Apt-b、Tb两个片段链接好后组成了裂开型探针b的全序列，如SEQ ID NO.9所示，具体为：
5’-cgacatctaacccgtcaggttgagctgaagatcgtaccgtgaagtccgt-3’。
发夹H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为:
Cholesterol-5’-ttttttttttgtcagtgagctaggttagatgtcgcca(cy3)tgtgtagacgacatctaacctagc-3’。荧光供体染料分子Cy3修饰在发夹H1的中间骨架上，胆固醇修饰在发夹H1的5’端。
发夹H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为:
H2:5’-agatgtcgtctacacat(cy5)ggcgacatctaacctagcccatgtgtagttttttttttt-3’-Cholesterol。荧光受体染料分子Cy5修饰在发夹H2的中间骨架上，胆固醇修饰在发夹H2的3’端。
胆固醇可以锚定在外泌体表面的磷脂双分子层上。
其检测原理如图1所示：首先设计两条裂开型探针a和b，其中每个探针包含裂开型Aptamer序列和裂开型触发序列。对于裂开型Aptamer序列(Apt-a和Apt-b)，是由完整的Aptamer裂开形成，可特异性识别靶蛋白并在外泌体表面发生聚集组装；而裂开型触发序列(Ta和Tb)，是由完整的CHA触发序列(T)裂开而成，只有当两段序列相互靠近才能形成完整触发序列。另外还设计H1和H2发夹链，并在其末端修饰胆固醇和中间标记FRET荧光对(Cy3和Cy5)，用于比率型信号输出。当靶标外泌体存在时，H1和H2发夹链通过胆固醇-磷脂双分子层相互作用锚定在外泌体膜表面上，从而形成催化发夹组装的轨道自助型三维DNA步行器。当加入探针a和b时，通过其裂开型Aptamer序列靶向外泌体表面蛋白时，使得这两条探针发生聚集重组，从而诱导裂开的CHA触发序列靠近形成完整触发序列(T)。通过Toehold介导的链置换反应，T序列就打开邻近的H1发夹链，暴露出新的Toehold区域。产生的新Toehold区域继续打开邻近H2发夹链，通过链迁移过程形成中间杂交产物(T-H1-H2)。随着DNA链置换反应不断进行，亚稳定的T-H1-H2产物最终生成热力学稳定的双链杂交体(H1-H2)，此时H1发夹链的Cy3基团和H2发夹链的Cy5基团相互靠近，产生荧光共振能量转移(FRET)信号。同时释放出来的触发链T参与下一轮循环，继续寻找邻近新的H1和H2发夹链，促使DNA步行器在磷脂双分子层轨道上持续行走，经过多轮的“结合-竞争”模式，生成大量的FRET信号，最终实现靶标外泌体的灵敏检测。
虽然本发明仅提供了用于识别SMMC-7721肝癌外泌体的两条裂开型探针a和b，但是基于本发明的技术构思，将裂开型探针替换成识别其他外泌体或细胞的探针，依然能产生相同或相似的技术效果。
实施例2：
一种实施例1的肝癌外泌体的识别探针在检测SMMC-7721肝癌外泌体中的应用。
其应用方法为：
向含有胆固醇修饰的Cy3-H1(200nM)和Cy5-H2(200nM)的Tris-HCl中加入不同浓度SMMC-7721外泌体，并在37℃下孵育0.5h，保证催化发夹探针通过胆固醇和磷脂双分子层间的相互作用充分锚定在外泌体膜上，制备催化发夹组装的三维轨道。之后再向上述反应体系中加入50nM裂开型探针(50nM的裂开型探针a和50nM的裂开型探针b)，37℃反应2.5h，待荧光稳定后用稳态近红外荧光光谱系统(QM40-NIR)记录荧光光谱，激发波长530nm，发射波长550～750nm，激发和发射的狭缝宽度均设置为10nm。
检测结果参见图2：随着靶标外泌体浓度从2.2particles/μL增加到1.1×107particles/μL，相应的荧光信号也逐渐增大，说明实施例1的识别探针对靶标外泌体响应呈浓度依赖性，本申请的识别探针能实现靶标的灵敏检测。
实施例3：
考察实施例1的肝癌外泌体的识别探针对SMMC-7721肝癌外泌体的检测特异性：
向含有Cy3-H1(200nM)和Cy5-H2(200nM)的100μL Tris-HCl缓冲溶液中加入肝癌SMMC-7721外泌体，37℃下孵育0.5h，待发夹探针充分锚定在外泌体磷脂双分子层膜上后，再向反应体系中加入50nM裂开型探针，并在37℃反应2.5h，待荧光稳定后用稳态近红外荧光光谱系统(QM40-NIR)记录荧光光谱。另外，分别对含有人肝癌HepG2外泌体、人宫颈癌HeLa外泌体和人正常肝细胞L02外泌体等对照外泌体的缓冲液进行检测，操作如前所述，其在缓冲液中的检测结果参见图3。
从图3可以看出，与SMCC-7721外泌体孵育后产生的荧光共振能量转移(FRET，FA/FD)信号明显高于对照外泌体，这显示出本实施例发展的方法对靶标外泌体检测的高度特异性。
实施例4：
考察实施例1的肝癌外泌体的识别探针直接检测细胞培养上清液中SMMC-7721肝癌外泌体的灵敏度和特异性：
细胞上清液预处理：将细胞上清液通过2000g，30min初级离心后去掉沉淀，留上清。随后，对分离后的细胞上清液进行BCA蛋白浓度测定，将检测目标换成细胞上清液。
(1)细胞培养上清液中SMMC-7721外泌体的灵敏度分析：
向含有Cy3-H1(200nM)和Cy5-H2(200nM)的100μL Tris-HCl缓冲溶液中加入含有不同浓度肝癌SMMC-7721外泌体的细胞培养上清液，37℃下孵育0.5h，待发夹探针充分锚定在外泌体磷脂双分子层膜上后，再向反应体系中加入50nM裂开型探针，并在37℃反应2.5h，待荧光稳定后用稳态近红外荧光光谱系统(QM40-NIR)记录荧光光谱。结果如图4所示，随着SMCC-7721外泌体的浓度不断增加(a-e)，荧光共振能量转移信号也随之增加，说明该方法也能很好地应用于细胞培养上清液中靶标外泌体的直接检测。
(2)细胞上清液中SMMC-7721外泌体的特异性分析：
选择人肝癌HepG2、人宫颈癌HeLa和人正常肝细胞L02的对照外泌体细胞培养上清液进行检测，操作如前所述，其在细胞培养上清液中的检测结果如图5所示，相对于对照组而言，SMCC-7721细胞培养上清液中的外泌体能产生较高的荧光信号，说明本实施例方法能特异性识别细胞上清液中靶标外泌体。
实施例5：
轨道自助型三维DNA步行器对临床血浆中肿瘤外泌体的直接检测：
首先从湖南省肿瘤医院/湘雅医学院附属肿瘤医院选取6名肝癌患者血浆样本作为靶标和20名健康人血浆作为对照。所有实验均按照《中南大学湘雅医院和湖南省肿瘤医院临床标本管理规定指南》进行，并通过伦理审查委员会批准，所有参与者均已签署知情同意书。将临床血浆样本首先在4℃静置至分层，随后通过2000rpm，30min离心获得上清血样，最后对其进行BCA蛋白浓度测定。以加入5μL血浆样本为标准，根据蛋白浓度得到各个临床样本所加体积。之后对实际血浆上清液中靶标进行检测，反应步骤同细胞培养上清液中SMMC-7721肝癌外泌体灵敏检测步骤，结果如图6所示。从图6中可见肝癌患者血浆样品中产生的荧光信号强度明显高于健康对照组，说明本实施例的方法确实能实现临床血浆样本的检测。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 三维DNA步行器及其在肿瘤外泌体检测中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acggactacc tgacg 15
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtcaggttg agctgaagat cgtaccgtga agtccgt 37
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagctcactg ac 12
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgacatctaa cc 12
<210> 5
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttt 3
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttttttttt gtcagtgagc taggttagat gtcgccatgt gtagacgaca tctaacctag 60
c 61
<210> 7
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agatgtcgtc tacacatggc gacatctaac ctagcccatg tgtagttttt tttttt 56
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acggactacc tgacgtttag ctcactgac 29
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgacatctaa cccgtcaggt tgagctgaag atcgtaccgt gaagtccgt 49

Claims (8)

1.一种三维DNA步行器，其特征在于，所述三维DNA步行器包括裂开型探针a、裂开型探针b、发夹H1和发夹H2；所述裂开型探针a由裂开型Aptamer序列Apt-a和裂开型触发序列Ta连接而成，所述裂开型探针b由Apt-b和Tb连接而成；
所述裂开型Aptamer序列Apt-a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述裂开型Aptamer序列Apt-b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述裂开型触发序列Ta的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述裂开型触发序列Tb的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述发夹H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述发夹H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.根据权利要求1所述的三维DNA步行器，其特征在于，所述裂开型Aptamer序列Apt-a、裂开型触发序列Ta通过链接片段linker连接形成，
所述链接片段linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.5。
3.根据权利要求1或2所述的三维DNA步行器，其特征在于，荧光供体染料分子Cy3修饰在所述发夹H1的中间骨架上；荧光受体染料分子Cy5修饰在发夹H2的中间骨架上。
4.根据权利要求1或2所述的三维DNA步行器，其特征在于，胆固醇修饰在所述发夹H1的5’端和发夹H2的3’端。
5.根据权利要求1或2所述的三维DNA步行器，其特征在于，所述裂开型探针a的DNA序列如SEQ ID NO.8所示；所述裂开型探针b的DNA序列如SEQ ID NO.9所示。
6.一种权利要求1至5中任一项所述的三维DNA步行器在制备检测肿瘤外泌体检测试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述三维DNA步行器的使用方法为：
(1)将发夹H1和发夹H2与肿瘤外泌体孵育，使发夹H1和H2锚定在肿瘤外泌体膜上；
(2)加入裂开型探针a和裂开型探针b，激活三维DNA步行器行走，记录荧光光谱。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述荧光光谱的激发波长530nm，发射波长550～750nm，激发和发射的狭缝宽度均为10nm。
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