CN110468190A

CN110468190A - 一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法

Info

Publication number: CN110468190A
Application number: CN201910784679.0A
Authority: CN
Inventors: 孟红敏; 陈娟; 李朝辉; 葛佳
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2019-08-23
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2019-11-19
Anticipated expiration: 2039-08-23
Also published as: CN110468190B

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是指一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法。当存在外泌体时，外泌体表面标志物，蛋白酪氨酸激酶‑7（PTK7）与核酸适体特异性结合，改变识别探针构型，释放出触发链，从而与G‑R DNA发生链置换反应，暴露出富G序列从而形成G四链体，NMM嵌入G四链体，产生较强的荧光信号，实现对外泌体的无标记灵敏检测。在优化的实验条件下，线性范围为5×10⁵到5×10⁷particles/μL，最低检测限为3.4×10⁵ particles/μL，该探针用于制备用于检测实际血液样品中外泌体的高灵敏和高选择性检测的试剂盒。

Description

一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是指一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法。

背景技术

外泌体是直径在30nm到150nm之间的膜结合纳米囊泡。它们携带大量蛋白质、脂类、DNA、RNA等生物分子，使得外泌体可作为一种非侵害的癌症标志物用于肿瘤的早期诊断试剂的制备。因此，准确定量和分类肿瘤外泌体对癌症诊断、预后评估试剂的制备具有重要意义。

现有的不同方法检测外泌体的性能分析总结见下表：

。

专利CN201811548979.0公开了一种基于适配体与滚环扩增的外泌体检测方法，应用电化学传感器的方法构建出基于外泌体特异性的适配体探针，利用G-四联体-Hemin模拟过氧化酶催化H₂O₂反应产生信号；该专利通过滚环扩增合成大量G-四联体进行信号放大，实现外泌体的定量检测；专利CN201811173676.5提供了一种检测外泌体的适配体组、侧流式适配体生物传感器及其制备方法，该专利检测外泌体的适配体组包括CD63适配体和EpCam适配体，CD63适配体能特异性与外泌体的CD63蛋白结合，EpCam适配体能特异性与外泌体的EPCAM蛋白结合，该发明还提供侧流式适配体生物传感器，主要基于层析试纸条原理将CD63适配体喷涂于结合垫上，将EpCam适配体喷涂形成检测线上，质控线上喷涂有能与纳米金标记的适配体的DNA探针通过碱基互补配对结合；通过侧流式适配体生物传感器实现对外泌体定性和定量检测；现有的关于外泌体的检测多是基于外泌体表面通用蛋白CD63的抗体或者核酸适配体直接与外泌体结合形成，这将会产生很高的背景干扰，另外他们大多需要标记信号分子，这无疑将影响识别的效率，所以发展一种可激活的，免标记的荧光传感平台对外泌体进行检测迫在眉睫。

发明内容

本发明提出一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法，当存在外泌体时，外泌体表面标志物，蛋白酪氨酸激酶-7（PTK7）与核酸适体特异性结合，改变识别探针构型，释放出触发链，从而与G-R DNA发生链置换反应，暴露出富G序列从而形成G四链体，NMM嵌入G四链体，产生较强的荧光信号，实现对外泌体的无标记灵敏检测。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种基于构型变化的自组装体探针，所述自组装体探针包括核酸适配体探针、G4 DNA和Blocker DNA。

所述核酸适配体探针序列如SEQ ID NO.1所示、G4 DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

所述Blocker DNA序列为如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中的任一项所示。

所述Blocker DNA序列如SEQ ID NO.5所示。

所述的自组装体探针用于外泌体的无标记检测方法，所述自组装体探针基于核酸适体探针对外泌体膜蛋白的特异性识别能力和DNA链置换反应，改变核酸适体探针构型，释放出触发链，触发链与G-R DNA发生链置换反应，暴露出富G序列从而形成G四链体，NMM再嵌入G四链体，产生较强的荧光信号，实现对外泌体的无标记灵敏检测。

步骤如下：

（1）外泌体的分离：首先用无外泌体的10%的胎牛血清对所需细胞进行培养，当细胞生长至80-90%，收集上清培养基。简单地对培养基上清在4℃下以3000 × g离心30min，随后通过0.22μm滤膜以去除细胞碎片。收集的滤液经100 KDa MWCO在5000 × g、4℃条件下离心30min，如需纯净的外泌体，可再将过滤后的滤液在4℃下以160,000 × g超速离心2小时，弃上清、将沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中，获得外泌体样品溶液；

（2）将G-4 DNA和blocker-DNA在磷酸盐缓冲液中进行预杂交，得到具有粘性末端的G-RDNA溶液；

（3）步骤（1）的外泌体样品溶液在4℃下与核酸适配体探针DNA溶液一起温育1.5h，得到待激活的DNA溶液；

（4）将步骤（2）的G-R DNA溶液与NMM溶液混合后加入到步骤（3）的待激活的DNA溶液中，在0-25℃下反应60-120min，然后进行荧光检测。

所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2-7.4。

所述步骤（2）中G-4 DNA和blocker-DNA在磷酸盐缓冲液中的浓度均为1μM；预杂交的条件为：以1℃min^-1的速率从95℃冷却至4℃。

所述步骤（3）中核酸适配体探针DNA溶液的物质的量浓度为150nM。

所述步骤（4）中G-R DNA溶液、NMM溶液以及步骤（3）的待激活的DNA溶液的终体积为100 μL，其中G-R DNA溶液的反应浓度为100nM，NMM溶液的反应浓度为1μM。

本发明的有益效果在于：

1. 本发明构建了一种自组装体探针用于外泌体的无标记检测。在优化的实验条件下，线性范围为5×10⁵到5×10⁷particles/μL，最低检测限为3.4×10⁵ particles/μL。最后，该探针成功用于实际血液样品中外泌体的高灵敏和高选择性检测。

2. 本申请的核酸适配体可与外泌体表面标志物-蛋白酪氨酸激酶-7（PTK7）特异性结合，核酸适配体构型变化，释放出触发链，从而与G-R DNA发生链置换反应，暴露出富G序列从而形成G四链体，NMM嵌入G四链体，产生较强的荧光信号（检测原理见图1），实现对待测样品中外泌体的无标记高灵敏和高选择性检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明自组装体探针无标记检测外泌体的原理示意图。

图2为研究G4-DNA与不同blocker-DNA的杂交结合能力图；A图和B图是分别优化G4-DNA的3'-末端和5'-末端的blocker-DNA的封闭碱基。

图3为在390nm激发下的荧光发射光谱图；分别为 NMM（黑线），MB + G-R+NMM（红线），Ramos exosome + MB + G-R + NMM（蓝线），CEM exosome + MB + G-R+NMM（绿线），的荧光发射光谱。

图4为外泌体与核酸适配体的反应温度、反应时间关系柱状图；A图是外泌体与MB之间的反应温度的优化，B图是外泌体和MB之间的结合反应的温育时间，F和F0分别是存在和不存在外泌体时的荧光信号。

图5为实验条件的优化，其中A图是优化MB浓度、B图是优化NMM与G4-DNA的反应时间、C图是优化NMM浓度。

图6为外泌体浓度与荧光的关系图；其中A图是添加不同浓度外泌体的荧光发射光谱：（a）0，（b）0.5×10⁶，（c）1×10⁶，（d）5×10⁶，（ e）1.0×10⁷，（f）2.0×10⁷，（g）5.0×10⁷，（h）7.5×10⁷颗粒/ uL；B图是荧光强度与外泌体浓度的散点图；插图：外泌体浓度为0.5×10⁶-5.0×10⁷颗粒/ uL的线性关系。

图7为对外泌体的选择性图，其中A图是在固定数目的外泌体下，CEM细胞，B16F1细胞，Ramos细胞，Hela细胞和HL-7702细胞的外泌体的荧光光谱图，B图是特异性的直方图。

图8为在PBS和不同复杂样品中检测CEM外泌体。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例基于构型变化的自组装体探针用于外泌体的无标记检测方法，步骤如下：

（1）细胞的培养：将CCRF-CEM，Ramos，Hela，B16F1和HL-7702细胞在补充有10％外泌体（去除胎牛血清）和100IU / mL青霉素或链霉素的RPMI 1640培养基中培养，并在37℃下含有5％wt / vol CO ₂的潮湿培养箱中孵育48小时，当细胞生长至80-90％时，收集细胞上清液；

（2）外泌体的分离：将步骤（1）得到的细胞上清液在4℃下以3,000g离心30分钟，并通过注射器驱动的过滤单元过滤以除去完整的细胞和细胞碎片，收集过滤的液体并使用100KDaMWCO以5,000g在4℃下浓缩30分钟，然后将过滤的培养基在4℃下以160,000g超速离心2小时，弃去上清液，将外来体沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.2-7.4）中，在-80℃下保存备用；

（3）将浓度为1μM的G-4 DNA和1μM blocker-DNA在PBS中进行预杂交，以1℃min^-1的速率从95℃冷却至4℃，以形成具有粘性末端的G-R DNA，以为溶剂制备浓度为1μMMB DNA；将不同浓度的外泌体样品（a）0，（b）0.5×10⁶，（c）1×10⁶，（d）5×10⁶，（ e）1.0×10⁷，（f）2.0×10⁷，（g）5.0×10⁷，（h）7.5×10⁷个/μL溶液在4℃下与150nM MB DNA溶液一起温育1.5小时以产生可激活的DNA；将100nM封闭的G-R DNA和1μM NMM加入上述溶液中，引发可激活的DNA和blocker-DNA之间的置换反应；随后，暴露的G-4 DNA与NMM相互作用并折叠成四链体结构，再产生30分钟的荧光信号，然后进行荧光测量。通过在390nm的激发下的荧光测量记录溶液的荧光信号，结果如图6所示，由图6A可知荧光强度随着外泌体浓度的增加而增大。图6B为外泌体浓度与荧光强度的线性关系图。插图6B表明，在5×10⁵ ~ 5.0×10⁷particles /μL浓度范围内，荧光强度呈良好的线性关系。相关方程为荧光强度=12.7[外泌体]+ 318 (R²= 0.990)。基于3σ/斜率规则，检测限(LOD)大约估计为3.4×10⁵ particles /μL。

其中所述自组装体探针包括核酸适配体探针、G4 DNA和Blocker DNA；所述核酸适配体探针序列如SEQ ID NO.1所示、G4 DNA序列如SEQ ID NO.2所示、所述Blocker DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2

本实施例为进一步研究研究G4-DNA与不同blocker-DNA的杂交结合能力，设计了八组Blocker DNA序列为如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10中所示；参照实施例1的步骤进行荧光检测。首先，设计了一条Bare DNA链，该链包含完整的引发区域碱基，以模拟探针识别外泌体后，能够用于引发链位移反应，释放G4。检测结果如图2所示，由图2可知通过使用BlockerDNA-2，当存在Bare DNA时，可以获得最大的荧光增强，明显高于blocker DNA-1、blockerDNA-3、blocker DNA-4、Blocker DNA-5、Blocker DNA-6和Blocker DNA-7。因此，选择了blocker DNA-2作为后续实验的最佳blocker DNA，且命名为R-DNA。

实施例3

本实施例为证明本实验原理的可行性，研究了不同条件下体系的荧光强度。检测结果见如图3所示，由图3可知在没有靶外泌体(红色曲线)和对照外泌体(蓝色曲线)的存在情况下，没有明显的荧光信号，说明本发明具有较低的荧光背景。而将靶外泌体引入到上述混合溶液后，在615 nm左右处(绿色曲线)可以观察到明显的荧光增强，这表明G-rich序列被暴露并折叠成四重结构。这些结果表明，该实验平台可用于白血病相关外泌体的特异性检测。

实施例4

本实施例为研究外泌体与核酸适配体的反应温度、反应时间，参照实施例1的步骤，与实施例1不同之处，在于外泌体与核酸适配体的结合温度从0-45℃，结合时间从15-120min，产生的荧光强度作为信号，以无外泌体时产生的荧光信号作为背景，检测结果见如图4所示，由图4可知在4℃条件下，结合90 min可以获得该实验的最佳信背比。

实施例5

本实施例为研究外泌体与核酸适配体的反应浓度、NMM与G4的反应时间，NMM浓度，参照实施例1的步骤，与实施例1不同之处，在于外泌体与核酸适配体的反应浓度从0-500 nM，NMM与G4的结合时间从5-60 min，NMM浓度从0-2000 nM，产生的荧光强度作为信号，以无外泌体时产生的荧光信号作为背景，检测结果见如图5所示，由图5可知外泌体与核酸适配体的反应浓度为200 nM，NMM与G4的结合时间为30 min，NMM浓度为1000 nM时，可以获得该实验的最佳信背比。

实施例6

本实施例针对不同细胞培养基中的外泌体进行无标记检测，不同细胞培养基指：B16F1细胞，Ramos细胞，Hela细胞和HL-7702细胞的培养基；具体检测步骤与实施例1相同，其中外泌体样品溶液的浓度为5.0×10⁷ particles /μL，检测结果如图7所示，由图7可知在相同浓度下，CEM细胞产生的外泌体产生的荧光强度远高于阴性细胞的外泌体（Ramos和HL-7702细胞），略高于同族细胞外泌体（B16F1细胞和Hela细胞）。这些结果表明，由于适配体具有较高的特异性，这种无标记、可激活的适配体策略具有良好的选择性。

实施例7

本实施例针对实际待检测样本中的外泌体进行检测，步骤为：

将稀释至10％的胎牛血清（FBS）在DMEM培养基中培养，然后在4℃下以100000g超速离心120分钟除去外泌体和细胞外囊泡，获得超速离心的UC FBS，为了检测基质效应中的外泌体，将5.0×10⁷ particles /μL 的CCRF-CEM细胞的外泌体分别加入10％，20％或30％UCFBS中，得模拟实际样品溶液；然后按照实施例1的步骤检测上述外泌体样品中的外泌体，检测结果如图8所示，由图8可知，这种无标记、可激活的aptassensor在实际样品中具有良好的性能，具有很大的临床应用潜力。

上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 郑州大学

<120> 一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法

<160> 10

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> misc_difference

<222> （1）…（69）

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ctaaccgtat cgtgcttttt ttttttttta tctaactgct gcgccgccgg gaaaatactg 60

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<222> （1）…（22）

<400> 10

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Claims

1.一种基于构型变化的自组装体探针，其特征在于：所述自组装体探针包括核酸适配体探针、G4 DNA和Blocker DNA。

2.根据权利要求1所述的基于构型变化的自组装体探针，其特征在于：所述核酸适配体探针序列如SEQ ID NO.1所示、G4 DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的基于构型变化的自组装体探针，其特征在于：所述BlockerDNA序列为如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中的任一项所示。

4.根据权利要求2所述的基于构型变化的自组装体探针，其特征在于：所述BlockerDNA序列如SEQ ID NO.5所示。

5.权利要求1-4任一项所述的自组装体探针用于外泌体的无标记检测方法，其特征在于：所述自组装体探针基于核酸适体探针对外泌体膜蛋白的特异性识别能力和DNA链置换反应，改变核酸适体探针构型，释放出触发链，触发链与G-R DNA发生链置换反应，暴露出富G序列从而形成G四链体，NMM再嵌入G四链体，产生较强的荧光信号，实现对外泌体的无标记灵敏检测。

6.根据权利要求5所述的自组装体探针用于外泌体的无标记检测方法，其特征在于，步骤如下：

（1）外泌体的分离：首先用无外泌体的10%的胎牛血清对所需细胞进行培养，当细胞生长至80-90%，收集上清培养基，在4℃下以3000 × g离心30min，随后过0.22 μm滤膜以去除细胞碎片，收集的滤液经100 KDa MWCO在5000 × g、4℃条件下离心30min，弃上清、将沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中，获得外泌体样品溶液；

7.根据权利要求6所述的自组装体探针用于外泌体的无标记检测方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为溶剂，磷酸盐缓冲液的pH为7.2-7.4。

8.根据权利要求6所述的自组装体探针用于外泌体的无标记检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中G-4 DNA和blocker-DNA在磷酸盐缓冲液中的浓度均为1μM；预杂交的条件为：以1℃min^-1的速率从95℃冷却至4℃。

9.根据权利要求6所述的自组装体探针用于外泌体的无标记检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中核酸适配体探针DNA溶液的物质的量浓度为150nM。

10.根据权利要求6所述的自组装体探针用于外泌体的无标记检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中G-R DNA溶液、NMM溶液以及步骤（3）的待激活的DNA溶液的终体积为100 μL，其中G-R DNA溶液的反应浓度为100nM，NMM溶液的反应浓度为1μM。