CN1285737C

CN1285737C - 硅壳纳米颗粒检测sars病毒基因组片断的方法

Info

Publication number: CN1285737C
Application number: CN 200410046626
Authority: CN
Inventors: 谭蔚泓; 王柯敏; 龚萍; 何晓晓
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2004-08-03
Filing date: 2004-08-03
Publication date: 2006-11-22
Anticipated expiration: 2024-08-03
Also published as: CN1597987A

Abstract

本发明公开了一种硅壳纳米颗粒检测SARS病毒基因组片断的方法，其特点是构建了用于SARS病毒检测的三明治模型，利用自制的修饰有与SARS病毒基因组特有序列互补的cDNA片断的硅壳磁性纳米探针对含有SARS病毒基因组的样本进行病毒基因组的提取与纯化，再在聚合酶链式反应(PCR扩增)对病毒基因片断进行扩增的基础上，用修饰有与SARS病毒基因片断特异序列互补的cDNA片断的硅壳荧光纳米探针及玻璃芯片对SARS病毒基因片断进行检测。本发明的检测方法具有快捷，灵敏度和特异性高，稳定性好的优点。

Description

硅壳纳米颗粒检测SARS病毒基因组片断的方法

技术领域：

本发明涉及一种SARS病毒的检测方法，具体涉及一种利用硅壳纳米探针对SARS病毒基因组进行纯化和检测的方法。

背景技术：

目前，一般检测SARS病毒的方法有三类：分子生物学检测方法(PCR检测)、免疫学方法(抗体检测)、细胞学方法(细胞培养)。单纯的PCR检测方法由于扩增产物有较强的非特异性，且容易发生污染，出现假阳性、假阴性现象，所以会出现无法确诊的情况。免疫学方法是基于病毒蛋白检测患者或疑似患者血液中的是否存在该病毒的抗体，而最早的血清抗体IgM出现要7天左右，抗体IgG的产生则在10后，20天左右才达到高峰。一般患者在刚发热时，血液中已经存在病毒，但抗体还没有发展起来，所以单纯用抗体检测方法会令医生难以判断SARS病毒的存在。细胞培养方法是最早发展的实验室检测手段，能够在电子显微镜下直接观察到病毒颗粒，因而十分准确。但技术难道高，操作复杂，所需时间长，对设备要求相当高，不适于临床检测。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是利用病毒检测的三明治模型和硅壳纳米颗粒高灵敏度以及杂交检测的高准确性对SARS病毒基因组片断进行检测，以克服一般分子生物学方法检测SARS病毒所存在的假阳性和假阴性问题。

本发明解决上述技术问题采用下述技术方案。一种硅壳纳米颗粒检测SARS病毒基因组片断的方法：一：构建三明治结构的检测模型，即构建由将待检测的SARS病毒基因组片断、标记有荧光纳米检测信号的硅壳荧光纳米探针、以及能与玻璃芯片相联的寡核苷酸探针组成的类似三明治结构的检测模型。二：设计对SARS病毒进行基因片断检测的各探针序列和检测序列以及PCR扩增的引物序列，根据SARS基因组序列，通过BLAST分析SARS病毒基因组，筛选出与人类及其它病毒基因组无同源性的2个探针序列，其中之一作为硅壳磁性纳米探针的序列和硅壳荧光纳米探针的序列，另一段作为与玻璃芯片基片相连接的探针的序列。而包含这2段序列的100bp的序列作为SARS病毒基因组的检测序列。再用primer express2.0引物设计软件设计1套PCR引物。三：合成与制备用于SARS病毒基因病毒组提取与纯化的硅壳磁性纳米探针和对特异SARS病毒基因组片断进行荧光检测的硅壳荧光纳米探针及玻璃芯片，将制备的磁性纳米颗粒和表面氨基化荧光纳米颗粒用生物素化的牛血清白蛋白以及链霉亲和素修饰好，然后联接上合成的cDNA，制备成修饰有与SARS病毒基因组具有35个碱基互补cDNA序列的硅壳磁性纳米探针和荧光纳米探针；在购买的醛基化玻璃芯片上修饰生物素化的牛血清白蛋白以及链霉亲和素制备成玻璃芯片基片。四：检测，其具体过程为：1)、杂交，硅壳磁性纳米探针与SARS病毒基因片断及其它非SARS病毒基因片断的样品进行杂交，2)、磁分离，利用硅壳磁性纳米颗粒的磁性分离作用将SARS病毒基因组从混合样品中分离和纯化出来。3)、PCR扩增，纯化的SARS病毒基因组通过一对特定的引物进行PCR扩增，得到100bp的扩增产物。4)、荧光检测，与扩增产物有35个碱基互补序列的荧光纳米探针再和扩增产物以及同样修饰有34个碱基互补序列的玻璃芯片以一种类似三明治结构的模型进行杂交，而后用激光共聚焦荧光显微镜对芯片进行扫描检测。

本发明硅壳纳米颗粒检测SARS病毒基因组片断的方法有如下优点：

本发明利用磁性纳米探针对SARS病毒的基因片断进行提取，从而将SARS病毒的基因片断从含有许多非SARS病毒的基因片断的样本中纯化出来，避免直接将此样本作为PCR扩增的模板将可能会导致的非特异性的扩增产物减少到最低，而在一定程度上控制假阳性的出现。

本发明优越于单纯PCR检测方法的特点在于，它利用了PCR检测方法的高敏感性，故有可能做到对SARS患者进行早期检测。同时，它又克服了单纯靠PCR检测技术所产生的扩增产物中存在的非特异性现象，通过利用三明治检测模型对PCR扩增产物的碱基序列进行杂交检测而对这些产物进行进一步确认。另外在三明治检测模型中，作为荧光检测标记的硅壳荧光纳米探针将大量联钌吡啶荧光染料包裹在具有光保护性硅壳当中，与常用的直接将探针序列标记在染料分子上的方法相比，具有信号放大和抗荧光信号的光漂白的效应。

附图说明：

图1为本发明的三明治检测模型图；

其中1-硅壳荧光纳米探针

2-能修饰于玻璃芯片的寡核苷酸探针

3-SARS病毒基因组片断

4-玻璃芯片基片

图2为本发明的检测方法的流程图；

图3为本发明的检测实施例的激光共聚焦荧光显微镜扫描结果图；

其中5-对照(其荧光强度值为：33)

6-样品1(SARS病毒cDNA含量6×10^-12mol，其荧光强度值为：307)

7-样品2(SARS病毒cDNA含量3×10^-12mol，其荧光强度值为：159)具体实施方式：

现结合附图对本发明作出进一步说明。

一、SARS病毒基因片断检测的三明治模型。

如图1所示，该模型由SARS病毒基因的cDNA片断、硅壳荧光纳米探针、玻璃芯片相联的另一段寡核苷酸序列组成。将SARS病毒基因的cDNA片断分别与硅壳荧光纳米探针上的一段寡核苷酸序列以及能与玻璃芯片相联的另一段寡核苷酸序列在适当的条件下杂交反映，形成类似三明治结构的杂交复合物。此杂交复合物能与特制的玻璃芯片偶联。偶联到玻璃芯片上的杂交复合物因为荧光纳米探针的荧光放大效应，而激发出能用激光共聚焦荧光显微镜检测出来的强烈荧光。

二、设计对SARS病毒进行基因片断检测的各探针序列和检测序列以及PCR扩增的引物序列。

根据NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站所提供的SARS冠状病毒(NCBI的NC_004718株及gi33115118株)全基因组序列，通过BLAST分析SARS病毒基因组，筛选出与人类及其它病毒基因组无同源性的2个探针序列，其中之一作为硅壳磁性纳米探针的序列和硅壳荧光纳米探针的序列，另一段作为与玻璃芯片基片相连接的探针的序列。而包含这2段序列的100bp的序列作为SARS病毒基因组的检测序列。再用primer express2.0引物设计软件设计1套PCR引物。它们的具体序列如下：

硅壳磁性纳米探针序列：

5’-TCATAGAGCC TGTGTTGTAG ATTGCGGACA TACTT-Biotin-3’

硅壳荧光纳米探针序列：

5’-TCATAGAGCC TGTGTTGTAG ATTGCGGACA TACTT-biotin-3’

与玻璃芯片基片相连接的探针序列：

5’-biotin-CATCCACGAA TTCATGATCA ACATCCCTAT TTCT-3’

SARS病毒检测序列(即PCR扩增区域)：

5’-GATGGTAATA AGATAGCTGA CAAGTATGTC CGCAATCTAC AACACAGGCT

CTATGAGTGT CTCTATAGAA ATAGGGATGT TGATCATGAA TTCGTGGATG-3’

PCR引物：

上游引物：

5’-GATGGTAATA AGATAGCTGA CAAGT-3’

下游引物：

5’-CATCCACGAA TTCATGATCA-3’

三、制备硅壳磁性纳米探针和硅壳荧光纳米探针以及玻璃芯片。

硅壳磁性纳米探针制备：将用反相微乳法制备的大小60-100纳米的表面氨基化四氧化三铁磁性纳米颗粒悬浮在0.1M醋酸溶液溶液中，超声波振荡10分钟后，加入用丙酮与水溶解的三嗪三唑溶液3毫升，室温下搅拌1小时。分别用丙酮和超纯水以及10nM的磷酸缓冲液洗涤后，用磷酸缓冲液分散，加入生物素化的牛血清白蛋白，4℃下连续搅拌24小时，磷酸缓冲液洗涤2-3次，再加入链霉亲和素，室温下搅拌4小时以上，磷酸缓冲液洗涤2-3次，加入合成的cDNA，4℃下连续搅拌24小时，磷酸缓冲液洗涤备用。

硅壳荧光纳米探针：将用反相微乳法制备的大小约60-100纳米的内核含有联钌吡啶荧光染料的荧光纳米颗粒超声，悬浮在20毫升1mM的醋酸溶液中，加入20微升氨基硅烷化试剂WD-52，连续搅拌1小时，用超纯水洗涤后悬浮在0.1M醋酸溶液中，超声波振荡10分钟后，加入用丙酮与水溶解的三嗪三唑溶液3毫升，室温下搅拌1小时。分别用丙酮和超纯水以及pH7.4的磷酸缓冲液洗涤后，用磷酸缓冲液分散，加入生物素化的牛血清白蛋白，4℃下连续搅拌24小时，磷酸缓冲液洗涤2-3次，再加入链霉亲和素，室温下搅拌4小时以上，PBS洗涤2-3次，加入合成的cDNA，4℃下连续搅拌24小时，磷酸缓冲液洗涤备用。

玻璃芯片制备：在购买的表面经醛基化修饰的玻片上滴加生物素化的牛血清白蛋白，置于4℃冰箱，使生物素化的牛血清白蛋白吸附在玻片上，24小时后取出玻片用磷酸缓冲液轻轻冲洗，再在被覆生物素化的牛血清白蛋白的位置滴加链霉亲和素，在4℃冰箱中放置24小时，用磷酸缓冲液轻轻冲洗备用。

四、检测。

见图2所示，其流程如下：1、杂交，将制备好的磁性纳米探针与含有SARS病毒基因片断及其它非SARS病毒基因片断的样品在55℃，6XSSC、0.1％SDS的杂交缓冲液中杂交30分钟。

2、磁分离，杂交完毕，将装有反应物的EP管置于磁分离器上，用磁分离器将与磁纳米颗粒上探针杂交上的目标片断吸附在管壁上，再用磷酸缓冲液洗涤2-3次。然后将磁纳米颗粒悬浮在少量无菌水中，95℃变性5分钟后立即置于冰水中10分钟左右使杂交于磁纳米探针上的目标从磁纳米颗粒上解离。快速振荡几秒后，再将EP管置于磁分离器上，磁纳米颗粒吸附于管壁而目标溶解于无菌水中。吸取含纯目标的上清溶液作PCR扩增反应所需模板备用。

3、PCR扩增，PCR扩增反应的条件：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 15s(每个退火温度重复3个循环，然后退后温度下降1℃)，72℃ 15s，共18循环；95℃ 30s，55℃ 15s，72℃15s，共20循环；72℃ 15min。

4、荧光检测，将用硅壳荧光纳米探针与PCR扩增产物及能连接到玻璃芯片上探针序列在55℃，6X SSC、0.1％SDS的杂交缓冲液中杂交30min。然后将反应混合液滴加在玻片上加链霉亲和素的位置。再将玻片放在湿盒中室温放置2个小时以上，再用磷酸缓冲液和无菌水轻轻冲洗，晾干备用。用FV500-IX70激光共聚焦荧光显微镜对芯片进行扫描。其检测结果如图3所示，其中5表示对照，6表示样品1，7表示样品2。根据多次统计的结果，阴性对照的荧光强度值为30±20，不同样品的荧光值都大于160。因此可以根据荧光值确定检测样品中SARS病毒的存在与否。

Claims

1、一种硅壳纳米颗粒检测SARS病毒基因组片断的方法，其特征在于检测的具体过程为：

1)、杂交：连接有5’-TCATAGAGCC TGTGTTGTAG ATTGCGGACA TACTT-Biotin-3’cDNA片断的硅壳磁性纳米探针与含有SARS病毒基因片断及其它非SARS病毒基因片断的样品进行杂交；

2)、磁分离：利用硅壳磁性纳米颗粒的磁性分离作用将SARS病毒基因组从混合样品中分离和纯化出来；

3)、PCR扩增：以纯化的SARS病毒基因组作为模板，通过一对特定的引物5’-GATGGTAATA AGATA GCTGA CAAGT-3’和5’-CATCC ACGAA TTCAT GATCA-3’进行PCR扩增，得到100bp的扩增产物；

4)、荧光检测，连接有5’-TCATAGAGCC TGTGTTGTAG ATTGCGGACA TACTT-Biotin-3’cDNA片断的硅壳荧光纳米探针和扩增产物以及修饰有5’-Biotin-CATCCACGAATTCATGATCA ACATCCCTAT TTCT-3’cDNA片断的玻璃芯片以一种类似三明治结构的模型进行杂交，而后用激光共聚焦荧光显微镜对芯片进行扫描检测。

2、根据权利要求1所述的硅壳纳米颗粒检测SARS病毒基因组片断的方法，其特征在于硅壳磁性纳米探针的制备为：将用反相微乳法制备的大小60-100纳米的表面氨基化四氧化三铁磁性纳米颗粒悬浮在0.1M醋酸溶液溶液中，超声波振荡10分钟后，加入用丙酮与水溶解的三嗪三唑溶液3毫升，室温下搅拌1小时；分别用丙酮和超纯水以及10nM的磷酸缓冲液洗涤后，用磷酸缓冲液分散，加入生物素化的牛血清白蛋白，2-6℃下连续搅拌24小时，磷酸缓冲液洗涤2-3次，再加入链霉亲和素，室温下搅拌4小时以上，磷酸缓冲液洗涤2-3次，加入合成的cDNA，2-6℃下连续搅拌24小时，磷酸缓冲液洗涤备用。

3、根据权利要求1所述的硅壳纳米颗粒检测SARS病毒基因组片断的方法，其特征在于硅壳荧光纳米探针的制备为：将用反相微乳法制备的大小为60-100纳米的内核含有联钌吡啶荧光染料的荧光纳米颗粒超声，悬浮在20毫升1mM的醋酸溶液中，加入20微升氨基硅烷化试剂WD-52，连续搅拌1小时，用超纯水洗涤后悬浮在0.1M醋酸溶液中，超声波振荡10分钟后，加入用丙酮与水溶解的三嗪三唑溶液3毫升，室温下搅拌1小时，分别用丙酮和超纯水以及pH7.4的磷酸缓冲液洗涤后，用磷酸缓冲液分散，加入生物素化的牛血清白蛋白，2-6℃下连续搅拌24小时，磷酸缓冲液洗涤2-3次，再加入链霉亲和素，室温下搅拌4小时以上，磷酸缓冲液洗涤2-3次，加入合成的cDNA，2-6℃下连续搅拌24小时，磷酸缓冲液洗涤备用。

4、根据权利要求1所述的硅壳纳米颗粒检测SARS病毒基因组片断的方法，其特征在于玻璃芯片的制备为：在表面经醛基化修饰的玻片上滴加生物素化的牛血清白蛋白，在2-6℃环境下，使生物素化的牛血清白蛋白吸附在玻片上，24小时后取出玻片用磷酸缓冲液轻轻冲洗，再在被覆生物素化的牛血清白蛋白的位置滴加链霉亲和素，在2-6℃的环境下中放置24小时，用磷酸缓冲液轻轻冲洗备用。