CN2909246Y - 五项肝炎集成基因检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种五项肝炎集成基因检测试剂盒，属于体外临床检验和生物芯片技术领域。本实用新型包括五项肝炎集成基因检测芯片，和配套的试剂盒。所述的基因检测芯片由固相载体和偶联在上面的五种肝炎(包括甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝)的特异性基因探针微阵列组成。所述的固相载体是玻片、硅片、膜、纳米材料、高分子材料，可以是不修饰也可以是经过特殊修饰的。所述的探针是与五种肝炎病毒基因组片段相同或互补的核酸序列，长度为20－200bp。所述的试剂盒由样本处理液，样本扩增液，杂交反应液，亲和反应液，洗涤液，发光液组成。本实用新型可简便，快速，准确地实现多人份血液样本中五种肝炎病毒疾病的同时诊断。

Description

五项肝炎集成基因检测试剂盒

技术领域

本实用新型属于体外临床检验和生物芯片技术领域，确切地说，是一种涉及待检测者血液样本处理和病毒检测的基因微阵列产品及试剂盒。

背景技术

肝炎是在世界范围内广泛流行的严重危害人体健康甚至生命的严重疾病，目前主要分为甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎，其中乙肝、丙肝的流行性和对人类的危害最为严重。我国是世界上乙肝病毒感染最严重的国家，约有1.2亿人为乙肝病毒携带者，占世界的三分之一，其中3000万为慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌，每年有30万人死于慢性肝病，其中约13万人为原发性肝癌患者。我国每年用于治疗乙肝引起的慢性肝炎、肝硬化、肝癌的直接医疗耗费高达300亿元人民币。丙型肝炎是一种主要经血液传播、由丙型肝炎病毒引起的严重肝脏疾病。全世界目前有1亿丙型肝炎病毒携带者，中国约占四千万人。80％的丙型肝炎病毒携带者会患上慢性肝炎，其中约10-30％的病人将发展为肝硬化，5-10％的肝硬化患者可发展成肝癌。每年用于丙肝的医疗费加上病人工作丧失的造成的损失超过6亿美元。预计，2010年到2019年治疗丙肝相关疾病的直接医疗费用将超过130亿美元。

一般讲甲型肝炎预后比较好。甲型肝炎虽然起病急，但是只要及时确诊，注意治疗，病情会很快好转，多数在起病后2周黄疸开始消退，消化道症状开始改善，大约经过一个半月左右休息、治疗，多数病人能恢复健康，不会像乙型肝炎那样容易演变成慢性肝炎，更不会发生肝硬化和原发性肝癌。愈后获得免疫力，不再会发生第二次甲型肝炎。丁型肝炎病毒是种缺陷病毒，只有在乙型肝炎病毒的辅佐下，才能感染人体而引起疾病。虽然我们国家丁型肝炎抗体阳性率仅为1.15％，但以全国1.2亿乙型肝炎病毒携带者为基数进行计算，我国丁型肝炎病人数也达140万人之多。乙型肝炎携带者重叠感染丁型肝炎病毒后，往往会出现严重的急性肝炎，甚至发展成重症肝炎。乙型肝炎病毒携带者孕妇，在分娩过程可将乙型肝炎病毒传染给新生儿。新生儿感染乙型肝炎病毒后，约有90％以上的人将成为乙型肝炎病毒持续携带者，其中一部分人进入成年后会发展成为慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌。戊型肝炎发病经过基本上与甲型肝炎差不多，但平均病情重于甲型肝炎，黄疸发生率高，病情恢复较甲型肝炎慢。容易发生淤胆，肝内细小胆管(称毛细胆管)出现管壁水肿，胆管内胆汁凝固，形成栓塞，致使黄疸不能顺利消退，使黄疸指数居高不下。部分病人可出现二次黄疸高峰。孕妇，特别是中晚期妊娠妇女罹患戊型肝炎时，后果较为严重，病死率可达20％-30％。

目前传统的肝炎检测法为血清检测方法(现在市场上占主流地位的是ELISA方法)，每次只能检测一个指标，在进行多指标检测上费时、费力、费钱，难以满足人数众多的体检市场，不利于体检的日常化、平民化普及。

在小面积上集成多个基因进行结果判断，是最近几年来新兴的高科技技术，在多指标并行快速检测方面有着无可比拟的优势，具有集成化、高通量、自动化、微型化、信息化等特点，是临床诊断的发展方向。

但现有报道的基因芯片检测偏重于单种肝炎病毒的检测，及单病毒基因分型的研究，没有不同核酸病毒和多种病毒的同时筛查。

发明内容

本实用新型克服了现有技术不能同时对五种肝炎进行检测的局限性，提供了一种五项肝炎集成基因检测试剂盒，可以通过检测血清或血浆中可能存在的HAV，HBV，HCV，HDV，HEV五种病毒核酸，进行五种肝炎的平行预测，诊断和预后判断。

为了解决上述技术问题，本实用新型采用下述技术方案：提供一种五项肝炎集成基因检测试剂盒，由五项肝炎集成检测基因微阵列和配套使用的试剂盒组成；五项肝炎集成检测基因微阵列由固相载体和固相载体上偶联的探针组成；配套使用的试剂盒包括对血清样本进行处理的处理液，对处理样本进行扩增标记的扩增液，与微阵列进行杂交反应的杂交液，洗涤液，酶标工作液，和检测液；在血清样本的检测过程中配套试剂盒与五项肝炎集成检测基因微阵列是联合使用的。

本实用新型的其它技术特征：所述的固相载体是NC膜，尼龙膜，硅胶片，或玻片，固相载体是经过化学修饰的，固相载体可以是经过醛基化修饰的玻片。

所述的固相载体上偶联的探针是可以检测出HAV，HBV，HCV，HDV，HEV五种肝炎的核酸序列，偶联的探针序列长度为20-200bp，所述的检测探针序列在每个微阵列中有2-5个重复点样，所述的检测探针序列还包括一个扩增的阳性对照探针序列，所述的阳性对照探针序列长度为20-200bp。所述的样本处理液是可以对DNA/RNA病毒样本进行平行处理的。

所述的配套使用的试剂盒可以扩增标记五种肝炎的核酸病毒，所述的样本扩增液由肝炎病互特异性扩增引物和聚合酶链式反应液组成，所述的引物有生物素标记，所述的引物长度为15-35bp。

所述的与微阵列进行杂交反应的杂交液，和用于洗涤的洗涤液主要成分是SSC和SDS。

所述的酶标工作液由辣根过氧化物酶标记的亲和素组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。

与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：可以在基因水平上进行肝炎类型的检测，可以对五种肝炎进行同时检测，节省时间和步骤。

附图说明

图1是本实用新型一种固相载体上五种肝炎病毒基因分类检测的15项指标和1个定位点的点样示意图。

图2是本实用新型的反应孔中进行的各探针——标靶扩增产物反应的示意图

具体实施方式

五种肝炎基因分类检测的关键是对于病毒感染检测的灵敏度和特异性均达到要求，以保证结果的准确可靠，而相应的难点是如何将不同病毒肝炎的代表性保守序列整合到一个反应区域里来检测。经过深入而广泛的研究，本实用新型通过各肝炎病毒保守序列的查找和比对分析，进行了保守序列专一性探针的设计，再结合DNA与RNA平行扩增的技术进行样本处理，经过杂交反应和亲和反应，再结合化学发光检测方法，达到对不同种类的五种病毒的同时检测。

具体而言，为提高五种肝炎的杂交检测效率，本实用新型应用微点阵检测技术，结合微阵列基因杂交技术和化学发光检测技术设计了一种五种肝炎平行检测的集成检测微阵列。微阵列包括载体和位于载体上的反应区域，所述的反应区域包括5个以上探针序列，1个以上标准对照，其特征是：每一反应区域上偶联着每种肝炎不同的检测相应病毒的保守基因序列。

在本实用新型中，反应区域为阵列型。

在本实用新型中，偶联五种肝炎特异性检测探针序列的固相载体可以选用本领域常用的各种固相载体，包括(但并不限于)：玻璃片、塑料、带正电尼龙膜，硅胶片等，较佳的固相载体包括玻片和硅胶片。

在固相载体上，各探针序列有2个以上重复点样点。此外，较佳地在固相载体上还包括一个定位点(见图1)。

在本实用新型中，各指标的检测采用基因杂交法，检测原理如图2所示。详细叙述如下：

1)将特异性探针与固相载体连接，形成固相探针。封闭，除去未结合的位点。

2)用DNA/RNA平行处理试剂盒，处理受检血清，进行BIOTIN标记的扩增。将扩增产物与反应孔内的探针进行杂交反应，与探针形成探针-目标核酸产物-BIOTIN的复合物

3)洗涤除去未结合的目标核酸产物，及反应杂质。

4)与HRP标记的亲和素进行亲和反应。使已经检测到的核酸产物间接标记上HRP。

5)加底物：固相上的酶催化底物，化学发光，CCD检测，光强度与标本中受检病毒的量呈正相关。

本实用新型巧妙地综合利用了基因微点阵检测技术，亲和反应，以及化学发光检测技术，实现了五种肝炎的同时检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

检测反应板的制备

取醛基化玻片，在每个反应区域上偶联每种肝炎保守区的3个基因序列探针，和1个定位点作为反应结果的阳性对照，组成基因序列微列阵(图1)。

实施例2

试剂盒制备

试剂盒一，用于血清中病毒核酸的抽提制备。

试剂盒二，用于样本处理获得核酸病毒的扩增和标记。

洗涤浓缩液、酶标工作液

实施例3

五种肝炎检测

按以下方法对各测试血请样品进行检测：

1.按照产品说明书对血清样本进行处理，提取病毒核酸。

2.加入PCR扩增液，对处理得到的核酸样品进行扩增标记，用带BIOTIN标记的引物给产物标记上生物素。

3.加入反应区域，10-20ul。

4.42℃保温保湿反应60分钟。

5.用洗液洗涤4-6次，每次2分钟，振动。

6.加入亲和反应液，10-20ul。

7.在42℃反应15-20min。

8.用洗液洗涤4-6次，每次2分钟，晃动。

9.加检测液20ul/孔，使检测液均匀分布于反应区域。

10.CCD检测，视发光信号强度曝光30-60秒。

反应原理如图2。

结果判定：

依据不同指标的CutOff值，参考标准品梯度曲线，判定样品血清的阴阳性。

与此同时，用常规方法对测试的血清样品进行常规检测。结果表明，用本实用新型的试剂盒得出的测试结果与常规方法相同。

在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种五项肝炎集成基因检测试剂盒，由五项肝炎集成检测基因微阵列和配套使用的试剂盒组成，其特征在于：五项肝炎集成检测基因微阵列由固相载体和探针组成，探针以物理或化学方式固定在固相载体上，呈微阵列形式分布；配套使用的试剂盒由处理液，扩增液，杂交液，洗涤液，酶标工作液，和检测液组成。

2.如权利要求1所述的五项肝炎集成基因检测试剂盒，其特征在于，固相载体为玻片、硅片、膜、纳米材料、高分子材料，所述的载体可以是不修饰也可以是经过特殊修饰的。

3.如权利要求1所述的五项肝炎集成基因检测试剂盒，其特征在于，所述的固相载体上偶联的探针是与HAV，HBV，HCV，HDV，HEV五种肝炎病毒基因组片段相同或互补的核酸序列，此外还包括一个长度为15bp以上的阳性对照探针序列。

4.如权利要求1或权利要求5所述的五项肝炎集成基因检测试剂盒，其特征在于，所述的扩增液由肝炎病毒特异性扩增引物和聚合酶链式反应液组成；其中引物长度在15bp以上，并具有生物素标记。

5.如权利要求1所述的五项肝炎集成基因检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标工作液由辣根过氧化物酶标记的亲和素组成。

6.如权利要求1所述的五项肝炎集成基因检测试剂盒，其特征在于，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，其中发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。