CN104031994B - 可视化病原检测芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可视化病原检测芯片及其制备方法和应用，采用特定的点片方法和探针序列，使得现有临床中常见的病原菌和耐药基因的检测更为便捷，无需如之前采用生物芯片检测时的仪器扫描分析，本发明提供的检测芯片经杂交后可直接显色表示检测结果，目测即可获得检测结果，更进一步节约检测时间，为感染性病患者的救治赢得宝贵时间，因此具有十分广阔的应用前景。

Description

可视化病原检测芯片及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及检测基因芯片，具体地说是涉及可视化病原检测芯片。
背景技术
当前，感染性疾病仍然是威胁人类健康和生命的重要疾病，据2003年世界卫生组织健康报告，2002年全球62.25亿人口中，感染性疾病占死亡原因的第二位(26.206)，仅次于心血管病(29.2％)，而在致残或劳动力丧失的原因中则高居榜首(30％)。感染性疾病治愈率低、病死率高的主要原因有以下两方面：一是病原诊断不及时，未能早期正确进行抗感染治疗，二是细菌耐药性严重，治疗困难。临床医疗工作中，在未能明确病原前，常予以经验治疗，然而即使是基于循证医学拟定的经验治疗方案亦有较高的主观性和盲目性。在欧洲一个大系列临床调查结果发现对感染者的经验治疗方案属不恰当占25％，属此种情况者由于抗感染治疗方案不正确导致42％～60％的病死率，而治疗方案正确者病死率仅17.7％。不恰当的治疗往往表现为滥用广谱抗菌药，其结果除疗效差外，尚导致耐药菌的明显增多，以致治疗更为困难，医疗费用亦大幅上升。
造成临床上抗感染治疗不恰当的根本原因在于目前病原诊断水平低、费时间。以细菌而言，细菌检出及细菌药敏测定需4～5日，至少3日，血培养常需5～7日。感染病原菌耐药，又缺乏病原和药敏的资料，不能及时正确针对性抗感染治疗，是导致耐药菌感染治疗失败的主因。近年来，日益增多的耐药菌感染出现在细菌中，多重耐药的非发酵菌、肠杆菌科细菌和葡萄球菌感染逐年增多，以假单细胞、不动杆菌等非发酵菌为例，已经自20世纪90年代的占革兰阴性杆菌的23％～25％至目前的约35％，且为重症监护室感染的第1、2位病原菌，常呈多重耐药，其所致肺部感染、血流感染的病死率可达20％～40％。此均给治疗带来了很大的困难。
传统的病原学诊断及其耐药性检测主要依赖于形态学、培养等方法，其成本相对较低，方法也不复杂。但最大的缺点在于耗时长，近年来虽然出现了快速培养的技术，但大大提高了成本，也难于在短时间内同时获取细菌鉴定与药敏试验数据，仍然不能满足临床需要。常用的耐药性检测方法有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、E-试验法等，这些方法均须在获得纯培养的细菌后才能进行，因此，耐药性检测在病原学检测基础上至少还需要增加一天的时间以获取结果。鉴于此，耐药菌的快速诊断成为临床微生物学的一个重要发展方向。
近年发展起来的DNA芯片检测技术，利用或借助微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，可以快速、高效地获取或处理大量的生命信息(包括基因的识别、基因突变检测、基因表达谱检测和对外来分子的识别等)，在生物学研究如，生命科学、医学诊断、新药筛选和司法鉴定等研究中发挥了重要作用。
生物芯片技术作为一种新型技术，具有快速、准确、灵敏和通量高的优点，我国已有千余项芯片技术和检验技术的发明专利，表明我国在生物芯片的研究应用中已具有初步的技术基础。但从技术基础和水平上来看，虽已有成功的产品应用，但其还有很多研究方向，正等待我们去探索。相对现场和临床面临的许多问题，制约生物芯片发展的最大因素是研究成本高，从生物芯片或探针的制备，到病原体的检测，都需要及其昂贵的设备，一般实验室难以承担其高昂的费用。
申请人在前专利中CN200410067356.3-耐药菌检测芯片及其制备方法成功的提出了用于检测耐药菌的检测芯片，经多年临床应用以证实了其检测的准确性和精密性，但鉴于检测芯片的点样成矩阵状，读取数据的时候需要精密的仪器分析检测才能获得结果，相对费时，且无法通过目测样本获得直接结果，较为不便。就此，申请人预在原有专利的基础上研发出一种新型可视化病院检测芯片及其制备方法和应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种新型可视化病原检测芯片，使该检测芯片的结果目测可知，无需昂贵的基因芯片扫描仪等分析仪器。
本发明在原有专利基础上利用DNA芯片的方法，将已经合成的用于检测常见病原体的寡核苷酸探针固定于载玻片表面形成特有的相应病原体名称再配以相应的阴或阳性标记，通过将待测样本的DNA片段与芯片杂交显色，可直接通过特有的点样使检测结果可视化，简单快捷，为感染病的治疗提供更为便捷的检测方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
可视化病原检测芯片，在一张经修饰的载玻片上，固定有一系列寡核苷酸点阵探针，其特征在于：点阵探针的点样形状成所需检测的病原名称以及其主要耐药基因名称，此外，
针对不同病原及耐药基因各自特异序列设计的探针如表1所示：
表1病原及耐药基因的探针序列
优选地，上述检测芯片的检测结果中，如待测样品中有上述病原和/或耐药基因，该检测芯片的显色直接显色该病原和/或耐药基因。
优选地，上述细菌通用探针显示有无细菌；葡萄球菌探针可显示有无葡萄球菌属细菌；肠球菌探针显示有无肠球菌属细菌；mecA探针显示耐药基因mecA是否为阳性；vanA、vanB或vanM分别显示不同的万古霉素耐药基因是否为阳性。
优选地，针对PCR-DNA芯片检测用引物及内参序列如下表2所示：
表2 PCR-DNA芯片检测用引物及内参序列
更优选地，上述*标记为含有有BIOTIN(生物素)标记的引物，**内参添加人杂交试剂与定位探针杂交，作为显色系统质控。
上述可视化病原检测芯片的制作方法包括如下步骤：
(1)根据所设计的寡核苷酸探针进行探针的合成；
(2)用去离子水将合成的探针稀释，并与点样溶液(spotting solution)等体积混合，使终浓度为75pmoL/u L；
(3)载玻片表面使用醛基修饰；
(4)利用生物芯片点样仪将探针点阵在经醛基修饰的载玻片表面；
(5)置于相对湿度70％，室温条件下经48～72小时进行固定；
(6)室温下将载玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入双蒸水中振荡数分钟，再浸入100℃双蒸水30秒，晾干，备用；
核苷酸探针的5`末端需附加一定长度15mer的连接臂(Poly T)，该连接臂的5`末端需进行氨基修饰；
上述耐药细菌检测的应用方法包括以下步骤：
(一)标本处理：
(1)取1～1.5mL临床标本1，500rpm离心5分钟，吸取上清，弃沉淀；
(2)12,000rpm离心5分钟，弃上清，加入1.5mL ddH20重悬沉淀；
(3)12,000rpm离心5分钟，弃上清，再加入1.5mL ddH20重悬沉淀；
(4)12,000rpm离心5分钟，弃上清，加入100lil STET、2pLI溶葡萄球菌酶(1mg/mL)振荡混匀，经37℃10分钟，95℃10分钟处理；
(5)5,000rpm离心1分钟，留取上清作为扩增模板，获得待测标本的DNA，置4℃保存备用。
(二)生物素标记：
获得待测标本的DNA后，进行荧光标记处理：
(1)取制备好的标本DNA溶液5uL与45uL PCR扩增体系混匀(PCR扩增体系包括5×PCR缓冲液(含Mg2+)5μL、dNTP(2.5mM)4μL、Taq酶(5U/μL)0.25μL、23s F(5μM)1μL、23s R(20μM)1μL、mecA F(20μM)1μL、mecAR(5μM)1μL、van F(5μM)1μL、van R(20μM)1μL、ddH2O 29.75μL)，通过以下热循环过程制备生物素标记的标本DNA目的片段：
(2)芯片杂交；
(3)直接目测显色，获得检测结果。
其中，芯片杂交是：
取含生物素标记标本DNA目的片段样品2uL，马13uL Easy Hyb杂交液(罗氏公司)混匀，98℃变性7min，冰浴后取15uL滴于芯片表面，覆盖盖玻片，置于40℃湿盒中杂交60min，然后采用上海百傲科技有限公司“芯片显色试剂盒”显色，晾干。
上游和下游引物如表3所示：
表3 PCR-DNA芯片检测用引物及内参序列
本发明具有如下优点：
本发明的耐药菌检测芯片可将甲氧西林耐药葡萄球菌及万古霉素耐药肠球菌这两类临床革兰阳性耐药菌的鉴定与耐药谱测定同步完成，采用特定的点片方法和探针序列，使得现有临床中常见的病原菌和耐药基因的检测更为便捷，无需如之前采用生物芯片检测时的仪器扫描分析，本发明提供的检测芯片经杂交后可直接显色表示检测结果，目测即可获得检测结果，更进一步节约检测时间，为感染性疾病患者的救治赢得宝贵时间，检测过程简便、快速。
附图说明
图1为本发明提供的可视化病原检测芯片的点样示意图；
图2为本发明提供的可视化病原检测芯片与实施例1的可视化检测结果照片；
图3为本发明提供的可视化病原检测芯片与实施例1的可视化检测结果照片；
图4为本发明提供的可视化病原检测芯片与实施例1的可视化检测结果照片；
图5为本发明提供的可视化病原检测芯片与实施例1的可视化检测结果照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。
实施例1
1、探针设计和芯片制作
根据不同细菌已知的23S rRNA基因序列以及耐药基因序列，设计长度相近的探针，约20mer。如表1和表2所示。
将合成的寡核苷酸探针溶于离子水中，并与点样溶液(spotting solution)等体积混合，使终浓度为75pmoL/uL；利用上海聚阵生物科技有限公司生产的生物芯片点样仪将探针点阵在经醛基修饰的载玻片表面；置于相对湿度70％，室温条件下经48～72小时进行固定；然后，室温下将载玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入双蒸水中振荡数分钟，再浸入100℃双蒸水30秒，晾干，备用。
其中芯片点片如图1所示进行，具体为：
1)用定位探针点边框做显色质控(1)；
2)用葡萄球菌探针点“葡萄球菌”(2)，显色即表示葡萄球菌阳性，用金黄色葡萄球菌探针点“金黄色”，显色表示金黄色葡萄球菌阳性；
3)在点有“葡萄球菌”于芯片的相同高度用定位探针点“mecA”(3)和“-”(4)；
4)在4相同高度处用mecA探针点和“|”(5)，此时如耐药基因mecA为阳性结果，显示“mecA+”，为阴性显示“mecA-”；
5)在低于“葡萄球菌”的位置处分别用粪肠球菌探针及屎肠球菌探针点“粪”或“屎”(6)再用肠球菌探针继续点“肠球菌”(7)，显色即表示粪肠球菌或屎肠球菌阳性；
6)于“肠球菌”相同高度用定位探针继续点“van”(8)和“-”(9)，以及于后续分别采用vanA探针、vanB探针和vanM探针在同一位置点“A”、“B”或“M”(10)，并将vanA探针、vanB探针和vanM探针3种探针混合点“|”(9)，用于表示不同的万古霉素耐药基因阳性；
7)用细菌通用探针在低于“肠球菌”(7)的位置处点“革兰”(11)和“-”(12)，用革兰阳性菌通用探针点“|”(12)，此时如革兰阳性菌阳性，显色“革兰+”，革兰阴性菌阳性，显示“革兰-”；
值得说明的是，上述点片方法并非绝对，可根据所需检测病原不同和耐药基因不同进行调整，上述点片方法和布局仅表示一种可行，而非穷尽的所有；且点片的方法和布局可根据现有技术中的生物芯片点样仪进行调整改进，在此不作赘述。
2、标本DNA目的片段的生物素标记
设计3对引物，并将每对引物中一条的5’端标记生物素，利用PCR扩增产生生物素标记的标本DNA目的片段，其中模板为细菌基因组DNA，23s RNA基因引物序列及耐药基因引物序列见表2。扩增体系如下：标本DNA溶液5uL与45uLPCR扩增体系混匀(PCR扩增体系包括5×PCR缓冲液(含Mg2+)5μL、dNTP(2.5mM)4μL、Taq酶(5U/μL)0.25μL、23s F(5μM)1μL、23s R(20μM)1μL、mecA F(20μM)1μL、mecAR(5μM)1μL、van F(5μM)1μL、van R(20μM)1μL、ddH2O29.75μL)。此体系在95℃保温5min，然后以95℃30S，55℃30S，72℃30S循环40次，最后72℃保温5min。
3、标记的目的片段与芯片杂交
取含荧光标记标本DNA目的片段样品2uL，采用杂交显色试剂盒，取扩增产物按试剂盒说明书操作。
4、结果读取
杂交后DNA芯片的芯片结果可目测，即将直接显色相应的病原名称和耐药基因名称，如图2-5所示的结果。图2所示，该样品中VanB型万古霉素耐药粪肠球菌阳性，无葡萄球菌；图3所示，该样品中VanM型万古霉素耐药屎肠球菌阳性，无葡萄球菌；图4所示，该样品中金黄色葡萄球菌及mecA均阳性，即甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)阳性，无肠球菌；图5所示，该样品中葡萄球菌阳性，mecA阴性，即甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌(MSCNS，除金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌通常称为凝固酶阴性葡萄球菌)阳性，无肠球菌。

Claims (4)

1.可视化病原检测芯片，在一张经修饰的载玻片上，固定有一系列寡核苷酸点阵探针，其特征在于：点阵探针的点样形状成所需检测的病原名称以及其主要耐药基因名称，此外，针对不同病原及耐药基因各自特异序列设计的探针如表1所示(SEQ ID:1-12)：
表1 病原及耐药基因的探针序列
上述检测芯片的检测结果中，如待测样品中有上述病原和/或耐药基因，该检测芯片的显色直接显示目测可知的相应病原和/或耐药基因的名称；
针对PCR-DNA芯片检测用引物及内参序列如下表2所示：
表2 PCR-DNA芯片检测用引物及内参序列
其中，*标记为含有BIOTIN(生物素)标记的引物，**内参添加人杂交试剂与定位探针杂交，作为显色系统质控。
2.根据权利要求1所述可视化病原检测芯片，其特征在于：所述细菌通用探针显示有无细菌。
3.制备权利要求1-2任一所述的可视化病原检测芯片的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据所设计的寡核苷酸探针进行探针的合成；
(2)用去离子水将合成的探针稀释，并与点样溶液(spotting solution)等体积混合，使终浓度为75pmoL/u L；
(3)载玻片表面使用醛基修饰；
(4)利用生物芯片点样仪将探针点阵在经醛基修饰的载玻片表面；
(5)置于相对湿度70％，室温条件下经48～72小时进行固定；
(6)室温下将载玻片浸入0.2％SDS中振荡数分钟，再浸入双蒸水中振荡数分钟，再浸入100℃双蒸水30秒，晾干，备用。
4.权利要求1-2任一所述的可视化病原检测芯片的应用，其特征在于：用于制备快速检测感染性病原体的检测芯片。
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