WO2018018707A1 - 一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法 - Google Patents

一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法 Download PDF

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Definitions

  • the incubation buffer is adjusted to pH with hydrochloric acid or NaOH.
  • the filter membrane has a pore diameter of not more than 1 ⁇ m.
  • A is the result of exosomes extracted from commercial reagents
  • B is the result of exosomes extracted by the present invention.
  • the results in Figure 2 indicate that the extracted exosomes of the present invention are of comparable purity to commercial reagents. At the same time, the present invention is shorter in operation than commercial reagents and has a cost advantage.

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Abstract

一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法，用于分子生物学及临床检验技术领域。该方法使用由分离提取外泌体的叠层离心过滤装置、孵育缓冲液和蛋白酶K组成的分离提取外泌体试剂盒，利用试剂盒中的孵育缓冲液以及适量蛋白酶K在室温下孵育待测样品，然后利用叠层离心过滤装置在配套的离心机中离心，混匀，收集超滤管(2)中的截留液即可得到外泌体。该方法无需离心机以外的大型实验设备，价格低廉、操作便捷，时间短且能平行进行大量样本操作，所获高纯度外泌体能够满足临床大规模推广应用的需求。

Description

一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法
技术领域
本发明属于分子生物学及临床检验领域，具体涉及一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法。
背景技术
外泌体(exosomes)是一种由真核细胞的多泡内涵体(multivesicular bodies，MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，具脂双层膜结构，大小约为30–150 nm，广泛分布于体液中；可由多种类型细胞分泌，其内含有不同种类的蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAs及信号分子等具生物学活性的物质；具较强靶向性，易与靶细胞的细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地递送至靶细胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能。
目前外泌体的提取方法主要可归纳为以下几种：超速离心法、多聚物沉淀法、磁珠法和超滤法。
一、超速离心法是目前应用最广的外泌体提取方法[1-4]，文献中具体离心速度有些许差异，大体包含4个步骤：(1) 低速离心（约300 ×g）去除残留细胞；(2) 高速离心（约16,500 ×g）去除细胞碎片；(3) 0.22 μm滤膜过滤去除大直径囊泡；(4) 超速离心（约120,000 ×g）沉淀外泌体，为提高纯度可选用蔗糖密度梯度离心。
超速离心提取法主要有以下缺点：
1）操作耗时长：从处理完成的生物体液至收集到外泌体全过程耗时约8-24 h；
2）分离效率低：目前学界已证明该方法对外泌体的回收率仅为约10%[5]，要获得足够分析的样品需要较大样本量；
3）需要特定仪器：提取所用的超速离心机不属于常规实验室配置设备；
4）平行处理样本数有限：根据不同离心机转子，能够同时平行操作的样本数量一般不大于6个。
二、多聚物沉淀法是一种较新型的外泌体提取方法，由于其克服了超速离心法的不少缺陷，目前已被广泛应用于科研领域[6-8]，并已有相关商品试剂销售[9,10]。其实现主要是通过将样品与多聚物原液按照一定比例混合，孵育一段时间（约30 min）后用低速（约10,000 ×g）离心收集沉淀物，加入等渗缓冲液溶解沉淀后即为外泌体。
多聚物沉淀法的主要缺点如下：
1）实验成本高：以主流商业试剂，如System Biosciences (SBI)公司的产品ExoQuick-TC为例，每次提取的试剂消耗超过180元人民币，不利于大规模推广作临床应用；
2）后续处理受限：由于提取过程需要在样品中添加额外成分，收集到的外泌体后续不能直接用作细胞培养或回输等用途；
3）不适用于大体积样品：由于其原理及较高的成本导致该方法并不适用于大体积样本的处理。
三、另一种主流的外泌体提取方法是磁珠法[1,11]。该方法依靠固定有特定抗体的磁珠与样品孵育，利用抗原抗体反应与样品中有对应膜表面抗原的外泌体结合，最终利用磁力将磁珠与外泌体一同吸附，实现外泌体的提取。
磁珠法同样具有明显的缺陷：
1）实验成本高：磁珠需特殊加工能力，同时提取所需的抗体及抗体与磁珠的交联更进一步增加了该方法的实现成本；
2）仅能提取样品中某一特定的外泌体亚群：由于该方法基于抗原抗体反应，故仅能从样品中特异性提取出具有某一已知膜表面抗原的外泌体亚群；
3）不适用于大体积样品：由于其原理及较高的成本导致该方法并不适用于大体积样本的处理。
四、部分研究中亦曾使用超滤法进行外泌体富集[12,13]，但其报道的方法需要超速离心进一步沉淀外泌体，操作过程冗长，并不适合临床使用。且尚无能应用于血清/血浆的超滤提取外泌体的方法。
综上所述，目前尚无价格低廉、操作便捷，时间短且能平行进行大量样本操作的外泌体提取方法能够满足临床大规模推广应用的需求。
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发明内容
本发明的目的在于提供一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，包括过滤管、套在过滤管外侧的超滤管和套在超滤管外侧的废液收集管，所述过滤管的底部设有滤膜，过滤管内部形成一级过滤管腔，超滤管的底部设有超滤膜，超滤管内部于过滤管的下方形成二级过滤管腔，废液收集管内于超滤管的下方形成废液收集管腔，所述过滤管的顶端管口设有一级托沿，超滤管的顶端管口设有二级托沿，一级托沿和二级托沿上均设有通气道，废液收集管的顶端管口设有盖帽，盖帽盖合时可将一级托沿压紧于二级托沿、将二级托沿压紧于废液收集管的顶端管口，一级过滤管腔和二级过滤管腔均通过通气道与外界连通。
优选的，所述滤膜的孔径不大于1μm。
优选的，所述滤膜的孔径不大于0.8 μm。
优选的，超滤膜为截留分子量为30-100 kDa颗粒的超滤膜。
优选的，超滤管于过滤管下方的左侧管壁和右侧管壁均为向中部倾斜的平面管壁，两平面管壁间形成截面呈V形的二级过滤管腔，至少一个平面管壁上开设超滤膜窗口，超滤膜窗口内嵌超滤膜组件，所述超滤膜组件包括超滤膜固定板和贴附于超滤膜固定板内侧的超滤膜，所述超滤膜固定板的下端设有若干流出孔。
优选的，盖帽与废液收集管的顶端管口采用螺纹连接或卡扣连接。
一种分离提取外泌体的试剂盒，包括上述任一项所述的叠层离心过滤装置、孵育缓冲液和蛋白酶K。
优选的，孵育缓冲液包括下列组分：DPBS、60-240 mM Tris、60-180 mM EDTA，pH为7-7.5。
DPBS，即杜氏磷酸盐缓冲液，是用于短期维持哺乳动物细胞活性的一种平衡盐溶液。它可以在有限时间内维持离体细胞结构和生理学上的完整性。优选的，DPBS包括下列组分：KCl 200 mg/L；KH2PO4 200 mg/L；NaCl 8 g/L；Na2HPO4•7H2O 2.16 g/L。
优选的，Tris可以直接添加固体，或者用其可溶性盐配制成溶液加入。
优选的，EDTA可以直接添加固体，或者用其可溶性盐配置成溶液加入。
优选的，孵育缓冲液利用盐酸或NaOH调节pH。
一种分离提取外泌体的方法，包括下列步骤：
1)在待测样品中加入0.1-5倍体积的孵育缓冲液，并加入适量蛋白酶K，充分混匀，室温孵育；
2)将步骤1）处理完的样品转移至上述所述的叠层离心过滤装置的过滤管中，将叠层离心过滤装置放入离心机中离心，混匀，收集超滤管中的截留液得到外泌体。
优选的，孵育缓冲液包括下列组分：DPBS、60-240 mM Tris、60-180 mM EDTA，pH为7-7.5。
优选的，孵育缓冲液包括下列组分：DPBS、80-220 mM Tris、80-160 mM EDTA，pH为7-7.5。
优选的，步骤1）中，加入适量蛋白酶K，使其终浓度为0.2 mg/mL-2.0 mg/mL。当蛋白酶K溶液的浓度为5-40 mg/mL，蛋白酶K的加入量为样品体积的0.005-0.4倍。
优选的，步骤1）中，加入蛋白酶K后，室温孵育时间为8-20 min。
优选的，DPBS包括下列组分：KCl 200 mg/L；KH2PO4 200 mg/L；NaCl 8 g/L；Na2HPO4•7H2O 2.16 g/L。
优选的，步骤2）中离心时，离心力不超过5,000×g，离心时间为10-30 min。
优选的，如果需要提高外泌体纯度，在步骤2）离心后，在过滤管中加入适量DBPS，再次离心，混匀，收集超滤管中的截留液得到外泌体。
本发明的有益效果是：
本发明方法与超速离心法相比：
a)本发明方法能够获得与超速离心法相当纯度的外泌体；
b)本发明方法全部操作能够在30 min内完成，大大缩短操作时间；
c)全部过程可室温操作，操作简便；
d)本发明方法能在任何配备有桌面小型离心机的实验室完成，基本无需其他实验设备；
e)根据离心机型号，本发明能同时处理多个样本，实验室常见小型桌面离心机配备的转子就能同时完成多达24个样本的提取。
与多聚物沉淀法相比：
a)本发明方法能够获得与多聚物沉淀法相当纯度的外泌体；
b)本发明方法耗材成本更为低廉；
c)获得的外泌体产物基本无需进一步处理即可为细胞培养或回输等用途。
与磁珠法相比：
a)本发明耗材成本更为低廉；
b)本发明可提取样本中外泌体的全部亚群，不依赖于特定的膜表面抗原。
附图说明
图1为本发明的叠层离心过滤装置；
图2为外泌体纯度检测结果；
图3为外泌体纯度检测结果；
图4为外泌体电镜图。
具体实施方式
本发明的试剂配方：
DPBS：KCl 200 mg/L；KH2PO4 200 mg/L；NaCl 8 g/L；Na2HPO4•7H2O 2.16 g/L；
孵育缓冲液：DPBS + 60-240 mM Tris•HCl + 60-180 mM EDTA，pH=7.2；
蛋白酶K储液：5-40 mg/mL 蛋白酶K水溶液。
实施例中所用的试剂均按照此配方去配制。
本发明方法，包括下列步骤：
1)在待测样品中加入0.1-5倍体积的孵育缓冲液，并加入0.005-0.4倍体积蛋白酶K储液，充分混匀，室温孵育8-15 min；
2)将步骤1）处理完的样品转移至叠层离心过滤装置的过滤管中，离心，混匀，收集超滤管中的截留液。
优选的，若需要提高外泌体纯度，可往超滤管中加入DBPS，3,000×g离心10 min，用于除去一些可溶性蛋白，弃滤出液并重复一次。
优选的，混匀并收集截留液即为外泌体溶液，可进行后续处理。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置
本发明提供了一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置（见图1），包括过滤管1、套在过滤管1外侧的超滤管2和套在超滤管2外侧的废液收集管3，所述过滤管1的底部设有滤膜11，过滤管1内部形成一级过滤管腔12，超滤管2的底部设有超滤膜21，超滤管2内部于过滤管1的下方形成二级过滤管腔22，废液收集管3内于超滤管2的下方形成废液收集管腔31，所述过滤管1的顶端管口设有一级托沿13，超滤管2的顶端管口设有二级托沿23，一级托沿13和二级托沿23上均设有通气道，废液收集管3为与离心设备配套使用的离心管，废液收集管3的顶端管口设有盖帽，盖帽与废液收集管3的顶端管口采用螺纹连接或卡扣连接。当盖帽盖合时可将一级托沿13压紧于二级托沿23、将二级托沿23压紧于废液收集管3的顶端管口，同时，一级过滤管腔12和二级过滤管腔22均通过通气道与外界连通。
超滤管2于过滤管1下方的左侧管壁和右侧管壁均为向中部倾斜的平面管壁，两平面管壁间形成截面呈V形的二级过滤管腔22，二级过滤管腔22的外壁上设有刻度。至少一平面管壁上开设超滤膜窗口，超滤膜窗口内嵌超滤膜组件，所述超滤膜组件包括超滤膜固定板和贴附于超滤膜固定板内侧的超滤膜21，所述超滤膜固定板的下端设有若干流出孔。
优选的，所述滤膜的孔径不大于1μm。
优选的，所述滤膜的孔径不大于0.8 μm。
优选的，所述滤膜的孔径为0.22 μm。
常用的滤膜孔径有0.1-100μm。血清中常见的干扰物是高丰度蛋白及微囊泡（microvesicles, MVs），经过本发明中缓冲液以及蛋白酶K条件下的预处理，大量高丰度蛋白可被蛋白酶K酶解成小片段。而微囊泡直径约为200-1,000 nm，此处用0.22 μm滤膜可去除绝大部分的微囊泡的干扰。
优选的，超滤膜为截留分子量为30-100 kDa颗粒的超滤膜。
微囊泡被滤膜截留于过滤管内，进入二级过滤管腔中的主要杂质为血清中高丰度蛋白被蛋白酶K酶切得到的多肽片段。本发明中，经过处理后的多肽片段多为分子量约为5-10 kDa的线性分子，故选用30 kDa以上的超滤膜能够将其滤过。同时，该范围内的超滤膜孔径大大小于外泌体直径，外泌体将被截留于二级过滤腔内。
使用本发明的分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，当待测血清样本加入到过滤管中，在离心作用下，血清样本通过过滤管1底部的滤膜11，常用的滤膜11为微孔滤膜，孔径不大于1μm，优选为0.22 μm。绝大部分微囊泡被截留在过滤管1中。而外泌体、可溶性蛋白、高丰度蛋白酶解片段等则通过了这层滤膜进入到超滤管2中。由于超滤管2管壁的下方是超滤膜21，而底部具二级过滤管腔22，在离心过程中，血清中可溶性部分、高丰度蛋白酶解片段及更微小的颗粒从侧壁的超滤膜21渗出，进入废液收集管3。由于超滤管2的底部具二级过滤管腔22，离心过程中将保留部分液体，外泌体即可在此溶液中保存。离心完后，取出超滤管2，用移液器吹打使保留腔中液体混匀，收集截留液即为终产物外泌体溶液。
实施例2一种分离提取外泌体的试剂盒
试剂盒包括下列组分：
1）叠层离心过滤装置，如实施例1所述。
2）孵育缓冲液，包括下列组分：DPBS、60-240 mM Tris•HCl缓冲液、60-180 mM EDTA，pH为7-7.5。
3）蛋白酶K储液，浓度为5-40 mg/mL。
4）DPBS：KCl 200 mg/L；KH2PO4 200 mg/L；NaCl 8 g/L；Na2HPO4•7H2O 2.16 g/L。
实施例3 一种分离提取外泌体的方法
利用实施例2的试剂盒分离提取外泌体。
包括下列步骤：
1)在待测样品中加入0.5倍体积的孵育缓冲液，并加入0.05倍体积蛋白酶K储液，充分混匀，室温孵育8-15 min；
2)将步骤1）处理完的样品转移至叠层离心过滤装置（见图1）的过滤管中，离心，混匀，收集超滤管中的截留液。
优选的，若需要提高外泌体纯度，可往超滤管中加入DBPS，3,000×g离心10 min，用于除去一些可溶性蛋白，弃滤出液并重复此步骤一次。
优选的，混匀并收集截留液即为外泌体溶液，可进行后续处理。
下面对本发明方法和现有技术或者市售商业试剂提取方法进行对比。
本发明方法与商业试剂提取方法的对比实验
目前市面上用于外泌体提取的试剂主要来自SBI公司的ExoQuick系列和ThermoFisher公司的Total Exosome Isolation Reagent系列，二者具相似的原理与相当的提取纯度。此处对比了ThermoFisher公司所产试剂适用于血清的产品与本发明（实施例3）在同一血清样品中的提取效果。
商业试剂提取方法，包括下列步骤：
(1)取血清200 μL，放入新的EP管中；
(2)加入40 μL Total Exosome Isolation Reagent (from Serum)，混匀；
(3)4℃孵育30 min；
(4)取出上述混合物，10,000×g离心10 min；
(5)去上清，加入20 μL DPBS重悬沉淀，得到外泌体溶液。
对上述得到的外泌体与实施例3得到的外泌体进行纯度检测，结果见图2。
图2中，A为商业试剂提取的外泌体结果，B为本发明提取的外泌体纯度结果。图2结果表明，本发明提取的外泌体纯度与商业试剂相当。同时，本发明在操作上较商业试剂耗时更短，且具成本优势。
提取体系的对比实验
对比外泌体的试剂盒中各组分在最低浓度、最高浓度及本发明浓度下的外泌体提取效果。
具体提取方法如下：
分别配制本发明的孵育缓冲液（DPBS + 90 mM Tris•HCl + 90 mM EDTA，pH=7.2）；高浓度孵育缓冲液（DPBS + 250 mM Tris•HCl + 200 mM EDTA, pH=7.2），低浓度孵育缓冲液（DPBS + 50 mM Tris•HCl + 50 mM EDTA, pH=7.2）。
配制蛋白酶K储液（20 mg/mL），低浓度蛋白酶K储液（5 mg/mL），高浓度蛋白酶K储液（40 mg/mL）。
取三个新的EP管，每管加入200 μL血清，根据所加入的试剂的浓度不同分为下列三个试验组进行对比。其中包括：高浓度组使用100 μL的高浓度孵育缓冲液和10 μL的高浓度蛋白酶K储液；低浓度组使用100 μL的低浓度孵育缓冲液和10 μL的低浓度蛋白酶K储液；本发明组使用100 μL的孵育缓冲液和10 μL的蛋白酶K储液。
将上述混合物在室温孵育10 min；将混合物转移至叠层离心过滤装置的过滤管内，3,000×g离心10 min；收集超滤管内截留液，进行外泌体纯度检测。纯度检测结果见图3。
外泌体纯度检测结果表明（图3），本发明组与低浓度组所得外泌体浓度相当，分别为2.73×108颗粒/mL与2.04×108颗粒/mL；但本发明所得外泌体颗粒直径主要（>80%）集中分布于200 nm以下区域内，而低浓度组所得产物仅有约60%处于200nm以下区域，存在较多大颗粒。
同时，本发明组与高浓度组相比，在颗粒直径分布上相当；而在提取的外泌体浓度上，高浓度组提取的总颗粒浓度（1.20×108颗粒/mL）仅为本发明提取的颗粒浓度（2.73×108颗粒/mL）的约50%。
综上，本发明缓冲液以及蛋白酶K工作浓度下所得到的外泌体最佳。
外泌体的透射电镜检测
对本发明实施例3从血浆样品中提取的外泌体，用2 mL DPBS洗涤截留物两次，离心，收集超滤管内截留液，固定于铜网上并染色，进行透射电镜检测。结果见图4。
图4结果显示：本发明从血浆提取的外泌体具完整包膜结构，同时直径在30-150 nm的范围以内，符合文献报道的特征。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

  1. 一种分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：包括过滤管、套在过滤管外侧的超滤管和套在超滤管外侧的废液收集管，所述过滤管的底部设有滤膜，过滤管内部形成一级过滤管腔，超滤管的底部设有超滤膜，超滤管内部于过滤管的下方形成二级过滤管腔，废液收集管内于超滤管的下方形成废液收集管腔，所述过滤管的顶端管口设有一级托沿，超滤管的顶端管口设有二级托沿，一级托沿和二级托沿上均设有通气道，废液收集管的顶端管口设有盖帽，盖帽盖合时可将一级托沿压紧于二级托沿、将二级托沿压紧于废液收集管的顶端管口，一级过滤管腔和二级过滤管腔均通过通气道与外界连通。
  2. 根据权利要求1所述的分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：所述滤膜的孔径不大于1μm。
  3. 根据权利要求1所述的分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：超滤膜为截留分子量为30-100 kDa颗粒的超滤膜。
  4. 根据权利要求1所述的分离提取外泌体的叠层离心过滤装置，其特征在于：超滤管于过滤管下方的左侧管壁和右侧管壁均为向中部倾斜的平面管壁，两平面管壁间形成截面呈V形的二级过滤管腔，至少一个平面管壁上开设超滤膜窗口，超滤膜窗口内嵌超滤膜组件，所述超滤膜组件包括超滤膜固定板和贴附于超滤膜固定板内侧的超滤膜，所述超滤膜固定板的下端设有若干流出孔。
  5. 一种分离提取外泌体的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-4任一项所述的叠层离心过滤装置、孵育缓冲液和蛋白酶K。
  6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，孵育缓冲液包括下列组分：DPBS、60-240 mM Tris、60-180 mM EDTA，pH为7-7.5。
  7. 一种分离提取外泌体的方法，其特征在于，包括下列步骤：
    1) 在待测样品中加入0.1-5倍体积的孵育缓冲液，并加入适量蛋白酶K，充分混匀，室温孵育；
    2) 将步骤1）处理完的样品转移至权利要求1-4任一项所述的叠层离心过滤装置的过滤管中，将叠层离心过滤装置放入离心机中离心，混匀，收集超滤管中的截留液得到外泌体。
  8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：孵育缓冲液包括下列组分：DPBS、60-240 mM Tris、60-180 mM EDTA，pH为7-7.5。
  9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤1）中，加入适量蛋白酶K，使其终浓度为0.2 mg/mL-2.0 mg/mL。
  10. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：步骤2）中离心时，离心力不超过5,000×g，离心时间为10-30 min。
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