CN113244173A - 一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡及其制备方法。通过对间充质干细胞外泌体进行人工脂质重组和整粒，本发明对间充质干细胞外泌体进行人工改性修饰，使其具有更强的靶向性和功能性。对间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡进行整粒，使其质量更加均一，有利于标准化使用。间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡可在不改变外泌体有效成分基础上增强其功能，并提高其质量均一性。
Description
技术领域
本发明属于生物材料改性修饰领域，具体涉及一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡及其制备方法。
背景技术
外泌体是由细胞分泌的一类细胞外囊泡，其粒径约60-150nm，通常携带蛋白质、mRNA、miRNA和脂质等生物活性分子，可将这些生物活性分子融入靶细胞而实现细胞交互，因此，在细胞信号传递中起重要作用。尤其是间充质干细胞外泌体，已在组织修复领域获得广泛研究，其生物活性分子的作用及机制相对明确。
脂质体是通过薄膜水化法、反相蒸发法、有机溶剂注射法、滤膜挤出法等方法人工制备的磷脂双分子层囊泡，其可以通过膜表面修饰、脂相包载、水相包载等方式进行人工设计。
目前对于间充质干细胞外泌体的利用主要停留于自然状态的提取，导致其靶细胞固定，无法实现人工靶向。申请号为CN201810977632.1的专利公布了一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法，使提取工艺得到改进，外泌体内容实质未发生改变。申请号为CN201910133482.0的专利公开了一项脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法及应用，通过挤出法获得类外泌体，其产量相对于一般提取方法大，并且未能实现人工改性，并且内如无法确定。诸如此类的专利基于天然间充质干细胞外泌体的提取，未能实现对间充质干细胞外泌体的人工改性修饰，无法改变其靶向性质，使得间充质干细胞外泌体应用受限。因此需要一种人工改性修饰的间充质干细胞外泌体囊泡，使其具有更强的可修饰性和质量均一性，充分实现间充质干细胞外泌体的应用价值。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡及其制备方法。对间充质干细胞外泌体进行人工脂质重组和整粒，使其具有更强的可修饰性和质量均一性，并保留间充质干细胞外泌体的内容物。
一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，将提取间充质干细胞外泌体与人工脂质重组，并进行整粒，实现间充质干细胞外泌体的改性修饰，即为间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，所述人工脂质为功能化磷脂。
作为优选，所述间充质干细胞外泌体提取方式为差速离心法、密度梯度离心法、超滤法、沉淀法、免疫分离法、筛分离法中的一种或多种。
作为优选，所述间充质干细胞外泌体提取方式为采用差速离心+超滤法。
作为优选，人工脂质为PC、PE、PS、PI、PG为基础的功能化磷脂。
作为优选，所述人工脂质采用DPPE功能化磷脂和DSPE功能化磷脂。
作为优选，所述人工脂质采用DSPE-PEG-NH2。
作为优选，所属人工脂质重组中外泌体蛋白与功能化磷脂质量比例为1-10：1。
作为优选，整粒方式为超声、滤器挤出及微流控芯片挤出中的一种。
作为优选，整粒方式采用滤器挤出。
一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡的制备方法，该方法具体包括以下步骤：
步骤一：当骨髓间充质干细胞融合度达到50-60％时，将其洗涤并在无血清培养基中再培养48小时；
步骤二：收集培养基，提取间充质干细胞外泌体；
步骤三：将外泌体蛋白与人工脂质以质量比例为1-10：1在20-37℃下共孵育2-4小时；
步骤四：将共孵育的重组后的囊泡进行整粒。
本发明的有益效果：
一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡及其制备方法，对间充质干细胞外泌体进行人工脂质重组和整粒，使其具有更强的可修饰性和质量均一性，并保留间充质干细胞外泌体的内容物。
相比现有间充质干细胞外泌体囊泡及其制备方法，本发明显著的进步在于：
1)对间充质干细胞外泌体进行人工改性修饰，使其具有更强的靶向性和功能性。
2)对间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡进行整粒，使其质量更加均一，有利于标准化使用。
因此，间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡可在不改变外泌体有效成分基础上增强其功能，并提高其质量均一性。
附图说明
图1间充质干细胞外泌体透射电镜表征，呈经典的碗状，粒径水平约100nm；
图2间充质干细胞外泌体粒径测定，平均粒径约150nm；
图3间充质干细胞外泌体蛋白印迹验证，含有TSG101、CD9、CD63等外泌体蛋白Marker；
图4间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡粒径测定，平均粒径约100nm；
图5囊泡FITC荧光测定，显示改性修饰囊泡具有人工脂质成分；
图6囊泡RFP荧光测定，显示改性修饰囊泡具有MSC外泌体成分。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明提供的一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下面结合实施例对本发明提供的一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明中的间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡的优选案例为采用差速离心+超滤法提取间充质干细胞外泌体后与DSGE-PEG-NHS按1：1比例重组后使用100nm滤器挤出方案，由以下方法制备，具体步骤如下：将间充质干细胞上清梯度离心后，采用超滤管浓缩，并与DSGE-PEG-NHS共孵育后采用滤器整粒。制得的材料形态及粒径分布如图1所示。
本发明还可以使用其他外泌体制备方案、其他的人工脂质、其他上述的共孵育比例及其他整粒方式，均可获得相同的技术效果。
实施例1、间充质外泌体与DSPE-PEG-NH2重组囊泡滤器整粒
1、当骨髓间充质干细胞(BMSC)融合度达到50％时，将其洗涤并在无血清培养基中再培养48小时。
2、收集培养基，梯度离心，200×g离心15min，2500×g离心15min。
3、取上清，使用0.22μm过滤器过滤上清液，以去除残留的细胞和碎片。
4、用超速离心过滤器装置转移溶液。将溶液以4,000×g离心，直到上层隔室中的体积浓缩至约200μL。
5、用磷酸盐缓冲液洗涤超滤溶液，并重复离心3次。
6、将洗涤后的含有外泌体的超滤液体超速离心1小时。将沉淀重悬于PBS中，并以4,000×g离心以将体积浓缩至约200μL。
7、将外泌体蛋白：DSPE-PEG-NH2按质量1：1比例，20摄氏度共孵育2小时。
8、将上述重组囊泡通过100nm滤器滤出。
实施例2、间充质外泌体与DSPE-PEG-SH重组囊泡滤器整粒
1、当骨髓间充质干细胞(BMSC)融合度达到55％时，将其洗涤并在无血清培养基中再培养48小时。
2、收集培养基，使用Percoll密度梯度离心液1000×g，20min离心。
3、吸取上层交界面的外泌体层液体，加入2倍体积PBS混匀。
4、使用0.22μm过滤器过滤，以去除残留的细胞和碎片，用超速离心过滤器装置转移溶液。将溶液以4,000×g离心，直到上层隔室中的体积浓缩至约200μL。
5、用磷酸盐缓冲液洗涤，并重复离心3次。
6、将沉淀用200μL PBS重悬。
7、将外泌体蛋白：DSPE-PEG-SH按质量5：1比例，30摄氏度共孵育2小时。
8、将上述重组囊泡通过100nm滤器滤出。
实施例3、间充质外泌体与DPPE-PEG-NHS重组囊泡超声整粒
1、当骨髓间充质干细胞(BMSC)融合度达到60％时，将其洗涤并在无血清培养基中再培养48小时。
2、收集培养基，梯度离心，以300×g离心10分钟，取上清。
3、以2000×g离心10分钟，取上清。
4、10，000×g离心30分钟，取上清。
5、100，000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100，000×g离心90分钟。
6、将沉淀用200μL PBS重悬。
7、将外泌体蛋白：DPPE-PEG-NHS按质量10：1比例，37摄氏度共孵育2小时。
8、将上述重组囊泡通过超声整粒，程序为40％功率，关2s，开3s，持续10min。
实施例1中间充质干细胞外泌体透射电镜表征
1、将提取的间充质干细胞外泌体进行浓缩，并进行透射电镜制样。
2、拍摄间充质干细胞外泌体透射电镜图，可见呈经典的碗状，粒径水平约100nm，如图1。
实施例1中间充质干细胞外泌体粒径测定
1、将提取的间充质干细胞外泌体稀释至合适浓度，使用马尔文粒径电位测定仪测定粒径。
2、测得间充质干细胞外泌体粒径分布相对较宽，平均粒径约150nm，如图2。
实施例1中间充质干细胞外泌体蛋白印迹验证
1、使用Lysis Buffer裂解间充质干细胞外泌体，并进行WB蛋白印迹实验。
2、根据相应蛋白分子量裁取条带，分别孵育一抗、二抗。
3、化学发光曝光后可见含有TSG101、CD9、CD63等外泌体蛋白Marker，如图3.
实施例1中间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡粒径测定
1、将制备的间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡稀释至合适浓度，使用马尔文粒径电位测定仪测定粒径。
2、测得间充质干细胞外泌体粒径分布相对较宽，平均粒径约100nm，如图4。
实施例1中间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡的组分验证
1、使用带RFP标记的MSC制备外泌体，则外泌体带有RFP荧光，使用FITC标记DSPE-PEG-NH2。
2、将外泌体、带DSPE-PEG-NH2的FITC标记的脂质体、间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡分别测定FITC及RFP荧光。
3、间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡分别带有FITC及RFP荧光，说明其含有MSC内容物及DSPE-PEG-NH2，重组成功，如图5、6。
对实施例2、3所得的间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡分别进行外泌体透射电镜、粒径、蛋白印迹与结果与改性修饰囊泡粒径、组分验证，与实施例1中间充质外泌体与DSPE-PEG-NH2重组囊泡滤器整粒结果相似，这表明可通过上述外泌体提取方式、修饰比例和整粒方式的调整，实现效果类似的间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡的制备。
由上述实施例可知，本发明提供的间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡及其制备方法，对间充质干细胞外泌体进行人工脂质重组和整粒，使其具有更强的可修饰性和质量均一性，并保留间充质干细胞外泌体的内容物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本技术领域的技术人员来应当理解，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围，不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，其特征在于：将提取间充质干细胞外泌体与人工脂质重组，并进行整粒，实现间充质干细胞外泌体的改性修饰，即为间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，所述人工脂质为功能化磷脂。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，其特征在于：所述间充质干细胞外泌体提取方式为差速离心法、密度梯度离心法、超滤法、沉淀法、免疫分离法、筛分离法中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，其特征在于：所述间充质干细胞外泌体提取方式为采用差速离心+超滤法。
4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，其特征在于：人工脂质为PC、PE、PS、PI、PG为基础的功能化磷脂。
5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，其特征在于：所述人工脂质采用DPPE功能化磷脂和DSPE功能化磷脂。
6.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，其特征在于：所述人工脂质采用DSPE-PEG-NH2。
7.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，其特征在于：所属人工脂质重组中外泌体蛋白与功能化磷脂质量比例为1-10：1。
8.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，其特征在于：整粒方式为超声、滤器挤出及微流控芯片挤出中的一种。
9.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡，其特征在于：整粒方式采用滤器挤出。
10.一种间充质干细胞外泌体改性修饰囊泡的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
步骤一：当骨髓间充质干细胞融合度达到50-60％时，将其洗涤并在无血清
培养基中再培养48小时；
步骤二：收集培养基，提取间充质干细胞外泌体；
步骤三：将外泌体蛋白与人工脂质以质量比例为1-10：1在20-37℃下共
孵育2-4小时；
步骤四：将共孵育的重组后的囊泡进行整粒。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114432341A (zh) * | 2022-02-18 | 2022-05-06 | 徐州医科大学 | 一种用于预防和治疗高原肺水肿的间充质干细胞杂化胞外囊泡的制备方法 |
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| CN112566626A (zh) * | 2018-08-10 | 2021-03-26 | 欧姆尼斯普兰特有限公司 | 用于吸入的细胞外囊泡 |
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