CN115932250B - 一种用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及化学发光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及化学发光检测试剂盒。该磁微粒化学发光试剂包括包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠和保护液，磁珠的制备方法为：（1）先采用磷脂酶A2对磷脂酰丝氨酸进行水解，然后与N‑羟基琥珀酰亚胺和N,Nʹ‑二异丙基碳二亚胺进行活化反应，再与3‑叠氮基‑1‑丙胺反应得到预处理的磷脂酰丝氨酸；（2）凝血酶原与戊炔酸STP酯反应得到预处理的凝血酶原；（3）预处理的磷脂酰丝氨酸和预处理的凝血酶原反应得到磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物；（4）磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物包被磁珠。本发明的磁微粒化学发光试剂稳定性好、灵敏度高、准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及磁微粒化学发光检测技术领域，具体涉及一种用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及化学发光检测试剂盒。
背景技术
自身免疫性疾病种类繁多，几乎可以影响身体的任何部位，包括心脏、大脑、神经、肌肉、皮肤、眼睛、关节、肺、肾脏、腺体、消化道和血管。
抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid syndrome，APS)是一种以反复发生的血栓形成、血小板减少、流产为主要临床特征，并伴有血清中抗磷脂抗体(antiphospholipidantibodies，aPL)存在的临床综合征。系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus，SLE)是一种多发于育龄期女性的累及全身多脏器的自身免疫性炎症性结缔组织病，可引起继发性APS。SLE患者体内B细胞过度活化，血浆中可检测到大量自身抗体，包括抗双链DNA(double strand DNA，dsDNA)抗体、抗核抗体(anti-nuclearantibody，ANA)、抗肾小球基底膜抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗磷脂抗体等。
抗磷脂抗体是一组针对各种带负电荷磷脂、磷脂结合蛋白、磷脂-蛋白复合物的自身抗体的总称。现有研究认为，抗磷脂抗体通过干扰各种依赖磷脂的凝血因子和抗凝因子而影响机体的凝血功能。实验研究发现抗磷脂抗体在系统性红斑狼疮发病和疾病进展过程中起着重要作用，与狼疮性肾炎、凝血功能、血栓、疾病活动度密切相关。APS的临床实验诊断标准包括：抗β2糖蛋白1(anti-β2-glycoprotein 1，aβ2GPI)IgG、IgM、抗心磷脂(anticardiolipin，aCL)IgG、IgM和狼疮抗凝物(lupus anticoagulant，LA)。研究显示：除以上临床诊断标准抗体外，尚有数十种非诊断标准抗体(non-criteria aPLs)，包括抗磷脂酰丝氨酸抗体(anti-phosphatidylserine antibodies，aPS)、抗凝血酶原抗体(antiprothrombin antibody，aPT)、抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物抗体(anti-phosphatidylserine/prothrombin complex antibodies，aPS/PT)，在自身免疫病的发生和发展中亦发挥重要的作用。凝血酶原通常与带负电荷的磷脂酰丝氨酸形成磷脂-磷脂结合蛋白复合物。aPS/PT作为临床检测指标，与血栓及产科并发症等相关性较强，主要用于诊断标准抗体阴性时的补充检测项目，或与多个抗磷脂抗体同时检测，提高检测的准确性。
aPS/PT已纳入国际APS评分（GAPSS）系统用于预测SLE和APS患者血栓再发风险，是APS“分类标准”的重要补充指标，推荐与aPS/PT IgM联合检测，可有效提高血清阴性抗磷脂综合征（SNAPS）的检出率，也可作为狼疮抗凝物的替代检测，有助于识别狼疮肾炎患者中血栓事件、神经精神狼疮、狼疮活动等风险。
目前应用较多的是来自沃芬公司的aPS/PT酶联免疫吸附法试剂盒，其采用板式酶促化学发光技术，存在样本检测时间长、操作复杂、样本检测通量低和应用场景窄等缺点。而常见的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物基本都是通过非共价结合形成aPS/PT，其稳定性不佳，与抗体结合效果有待提高，其包被磁微粒性能不佳，进而导致制备的化学发光检测试剂的检测灵敏度和检测结果准确定不好，这是抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒没有被广泛推广利用的主要原因。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性更好、灵敏度更高、检测结果准确度更高的用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂，所述的磁微粒化学发光试剂由包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠和保护液组成，所述的包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠通过以下方法制备得到：
（1）先采用磷脂酶A2对磷脂酰丝氨酸进行水解反应，然后将所述的水解反应的产物先与N-羟基琥珀酰亚胺和N,Nʹ-二异丙基碳二亚胺进行活化反应，再将所述的活化反应的产物与3-叠氮基-1-丙胺反应，得到预处理的磷脂酰丝氨酸；
（2）将凝血酶原与戊炔酸STP酯反应得到预处理的凝血酶原；
（3）步骤（1）的预处理的磷脂酰丝氨酸和步骤（2）的预处理的凝血酶原在抗坏血酸和Cu(II)-TBTA络合物存在的条件下反应得到磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物；
（4）将步骤（3）的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物包被到磁珠上，
所述的保护液为含有1.5wt%~2.5wt% BSA、0.4wt‰~0.6wt‰ 吐温-20、100mM~200mM NaCl、2wt%~5wt%蔗糖、0.4wt‰~0.6wt‰ Proclin 300的15mM~25mM Tris缓冲液，所述的保护液的pH值为7.0~7.4。
具体地，步骤（1）中，所述的水解反应在叔丁醇和水的混合液中进行，所述的叔丁醇和水的体积比为1：（4.5~5.5），使用碱性物质调节所述的混合液的pH值为7.5~8.5。
具体地，步骤（1）中，所述的水解反应在35℃~38℃恒温条件下进行。
具体地，步骤（1）中，所述的活化反应在室温条件下进行。
具体地，步骤（1）中，活化反应的产物与3-叠氮基-1-丙胺的反应在室温避光条件下进行。
具体地，步骤（2）中，凝血酶原与戊炔酸STP酯的反应在pH值为8.0~8.5且浓度为0.05M~0.15M的碳酸盐缓冲液中进行。
具体地，步骤（2）中，凝血酶原与戊炔酸STP酯的反应在2℃~6℃条件下进行。
具体地，步骤（2）中，采用脱盐柱对反应得到预处理的凝血酶原进行纯化处理。
具体地，步骤（3）中的反应在室温及无氧条件下进行。
具体地，步骤（3）中，采用离心取沉淀、冷丙酮清洗沉淀的方式对反应得到的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物进行纯化处理。
具体地，步骤（4）中，采用N-羟基琥珀酰亚胺和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐预激活磁珠，然后将预激活的磁珠与所述的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物反应，反应结束后，采用浓度为80mM~120mM的甘氨酸溶液封闭，过滤，取磁珠，与所述的保护液混合得到所述的磁微粒化学发光试剂。
具体地，所述的包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠在所述的保护液中的浓度为0.2mg/mL~0.5mg/mL。
本发明还提供一种抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒，所述的抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒包括所述的磁微粒化学发光试剂、碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体试剂、样本稀释液、存储有标定数据和/或标准曲线的ID卡或抗aPS/PT抗体标准品。
优选地，所述的抗aPS/PT抗体标准品包括浓度为150U/mL的标准品、浓度为75U/mL的标准品、浓度为37.5U/mL的标准品、浓度为18.75U/mL的标准品和浓度为9.4U/mL的标准品。
优选地，所述的样本稀释液为含有2.5wt%~3.5wt% 酪蛋白、100mM~200mM NaCl、3mM~5mM CaCl2、1.5wt%~2.5wt% 蔗糖、0.4wt‰~0.6wt‰ Proclin 300的40mM~60mM HEPES缓冲液，所述的样本稀释液的pH值为7.0~7.4。
本发明的抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒灵敏度和准确度高，所需临床样本用量极少，检测通量高且操作简单，仅需一台全自动化学发光免疫分析仪即可实现信号的检测及浓度值转换。本发明的抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒生产周期短，设备要求不高，易于实现量产化。本发明的抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒还具有检测时间短、操作简单、使用便捷、对人员技术水平要求低、应用场景广等优势。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明的磁微粒化学发光试剂中的包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠稳定性好，使用其制备的抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒重复性好、灵敏度高且准确性高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
以下实施例和对比例中，若无特殊说明，所使用的原料、试剂等均为常规市售产品。
以下实施例和对比例中，磷脂酰丝氨酸、NHS采购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)；磷脂酶A2采购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)；N,Nʹ-二异丙基碳二亚胺采购自梯希爱TCI；凝血酶原采购自HTI；戊炔酸STP酯（pentynoic STP ester）、Cu(II)-TBTA络合物采购自美国LUMIPROBE；脱盐柱采购自美国GE；磁珠采购自日本JSR。磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物简称aPS/PT。
实施例1
本实施例提供一种用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒，制备方法如下：
1. 将叔丁醇（t-BuOH）和纯化水按照体积比为1：5的比例混合制备反应溶液200mL，然后使用5M NaOH调节反应溶液的pH值为8.0。取200μL反应溶液然后加入1mg磷脂酰丝氨酸至其终浓度为5mg/mL，再加入2U磷脂酶A2，在37℃条件下恒温摇床振荡反应1h。反应结束后，加入0.5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1μL N,Nʹ-二异丙基碳二亚胺，在室温条件下反应过夜，再向反应液中加入0.07 mg 3-叠氮基-1-丙胺，在室温下避光反应12h，得到预处理的磷脂酰丝氨酸溶液。
2. 将0.2mg浓度为7.5mg/mL的凝血酶原于180µL 0.1 M pH为8.5的碳酸盐缓冲液混匀，然后加入1.5μL浓度为10mg/mL的戊炔酸STP酯，在4℃条件下过夜反应。反应结束后，将反应液加入经PBS清洗的脱盐柱的上室中，800×g 离心2分钟，收集下室中的液体，使用4℃的冷丙酮沉淀凝血酶原，在12000rpm的离心条件下离心10分钟，收集沉淀。使用1×PBS重悬沉淀，使凝血酶原的浓度为1mg/mL（使用NanoDrop超微量紫外/可见光和荧光分光光度计测定凝血酶原浓度），得到预处理的凝血酶原溶液。
3. 将步骤2的预处理的凝血酶原溶液转移至反应用EP管中，同时加入40μL步骤1的预处理的磷脂酰丝氨酸溶液、10μL 25mM的抗坏血酸、25μL 10mM Cu(II)-TBTA络合物，形成的混合物在无氧条件下（使用氩气充满EP管后紧密关闭EP管）轻轻混合，然后放置室温过夜反应。
4. 步骤3的反应结束后，使用4℃的冷丙酮沉淀复合物，在12000rpm的离心条件下离心10分钟，收集沉淀，使用4℃的冷丙酮清洗（将沉淀与冷丙酮混合，12000 rpm离心10分钟，再次收集沉淀），清洗两次后，采用1×PBS重悬，得到终浓度为1 mg/mL的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物aPS/PT（使用NanoDrop超微量紫外/可见光和荧光分光光度计测定aPS/PT浓度）。
5. 取2mg磁珠，加入终浓度分别为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）预激活磁珠，与磁珠的质量比为1：20，然后加入5μg步骤4中得到的aPS/PT，室温条件下利用旋转混匀器振荡孵育3小时后加入20μL浓度为100mM的甘氨酸溶液封闭，过滤，取反应后的磁珠，使用磁珠保存液将磁珠稀释至浓度为0.25mg/mL，即得到用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂。
保存液为含有2wt% BSA、0.5wt‰吐温-20、150mM NaCl、3wt %蔗糖、0.5wt‰Proclin 300的20mM Tris缓冲液，使用浓盐酸调节保存液的pH至7.2±0.2。
6. 碱性磷酸酶（AP）标记的抗人IgG抗体试剂：将AP加入到含1.25wt%戊二醛的PB溶液中，混匀后4℃反应24小时。反应结束后在50mM PBS中4℃透析过夜，中途换液4次。将活化的AP加入配制好的抗人IgG溶液，4℃反应24小时。再加入200mM赖氨酸溶液，室温反应2小时。反应结束后在50mM PBS中4℃透析过夜，中途换液4次。最后离心取上清。
7. 样本稀释液为含有3% 酪蛋白、150Mm NaCl、4mM CaCl2、2% 蔗糖、0.5‰Proclin 300的50mM HEPES缓冲液，使用10M NaOH溶液调节样本稀释液的pH至7.2±0.2。
8. 将步骤5的用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂，步骤6的碱性磷酸酶（AP）标记的抗人IgG抗体试剂、步骤7的样本稀释液与5个浓度的抗aPS/PT抗体标准品组合成抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒。标准品的浓度为150U/mL、75U/mL、37.5U/mL、18.75U/mL、9.4U/mL。
对比例1
本对比例提供一种用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒，其基本同实施例1，区别在于磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物aPS/PT的制备方法不同，本对比例中，aPS/PT的制备方法如下：
1. 将叔丁醇（t-BuOH）和纯化水按照体积比为1：5的比例混合制备反应溶液200mL，然后使用5M NaOH调节反应溶液的pH值为8.0.取200µL反应溶液然后加入1mg磷脂酰丝氨酸至其终浓度为5mg/mL，再加入2U磷脂酶A2，在37℃条件下恒温摇床振荡反应1h，反应结束后，向反应液中加入0.07mg 3-叠氮基-1-丙胺，在室温下避光反应12h。
2. 将0.2mg浓度为7.5mg/mL的凝血酶原于180µL 0.1M pH为8.5的碳酸盐缓冲液混匀得到凝血酶原溶液。
3. 按照凝血酶原和磷脂酰丝氨酸的质量比为1：1，取步骤1制备的磷脂酰丝氨酸水解反应液和步骤2制备的凝血酶原溶液，轻轻混合，并放置室温过夜（凝血酶原和磷脂酰丝氨酸水解产物通过非共价结合形成aPS/PT）。
4. 将步骤3中过夜后的反应液在12000rpm的离心条件下离心10分钟，收集沉淀，使用4℃的冷丙酮清洗（将沉淀与冷丙酮混合，12000rpm离心10分钟，再次收集沉淀），清洗两次后，采用1×PBS重悬，得到终浓度为1mg/mL的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物aPS/PT（使用NanoDrop超微量紫外/可见光和荧光分光光度计测定aPS/PT浓度）。
5. 取2mg磁珠，加入终浓度分别为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）预激活磁珠，与磁珠的比例为1：20，然后加入5μg步骤4中得到的aPS/PT，室温条件下利用旋转混匀器振荡孵育3小时后加入20μL浓度为100mM的甘氨酸溶液封闭，过滤，取反应后的磁珠，使用保存液将磁珠稀释至浓度为0.25mg/mL，即得到用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂。保存液同实施例1的保存液。
对比例2
本对比例提供一种用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒，其基本同实施例1，区别在于磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物aPS/PT的制备方法不同，本对比例中，aPS/PT的制备方法如下：
1. 将叔丁醇（t-BuOH）和纯化水按照体积比为1：5的比例混合制备反应溶液，然后使用5M NaOH调节反应溶液的pH值为8.0。取160µL反应溶液然后加入1mg磷脂酰丝氨酸，再加入5µL 100 mg/mL NaHCO3，12µL 150 mg/mL NaIO4，20µL 37.5 mg/mL KMnO4，反应条件为37℃条件下恒温摇床振荡反应2小时，7.5mg NaSO3终止反应10分钟。反应结束后，加入0.5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1μL N,Nʹ-二异丙基碳二亚胺，在室温条件下反应过夜，再向反应液中加入0.07mg 3-叠氮基-1-丙胺，在室温下避光反应12h，得到预处理的磷脂酰丝氨酸溶液。
2. 将0.2mg浓度为7.5mg/mL的凝血酶原于180µL 0.1 M pH为8.5的碳酸盐缓冲液混匀，然后加入1.5μL浓度为10mg/mL的戊炔酸STP酯，在4℃条件下过夜反应，反应结束后，将反应液加入经PBS清洗的脱盐柱的上室中，800×g 离心2分钟，收集下室中的液体，在12000rpm的离心条件下离心10分钟，收集沉淀，使用1×PBS重悬沉淀，使凝血酶原的浓度为1mg/mL（使用NanoDrop超微量紫外/可见光和荧光分光光度计测定凝血酶原浓度）。
3. 将步骤2中制备的凝血酶原溶液转移至反应用EP管中，同时加入40μL步骤1中制备的预处理的磷脂酰丝氨酸溶液、10μL 25 mM的抗坏血酸、25μL 10 mM Cu(II)-TBTA络合物，形成的混合物在无氧条件下（使用氩气充满EP管后紧密关闭EP管）轻轻混合，然后放置室温过夜反应。
4. 步骤3的反应结束后，在12000rpm的离心条件下离心10分钟，收集沉淀，使用4℃的冷丙酮清洗（将沉淀与冷丙酮混合，12000rpm离心10分钟，再次收集沉淀），清洗两次后，采用1×PBS重悬，得到终浓度为1mg/mL的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物aPS/PT（使用NanoDrop超微量紫外/可见光和荧光分光光度计测定aPS/PT浓度）。
5. 取2mg磁珠，加入终浓度分别为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）预激活磁珠，与磁珠的比例为1：20，然后加入5μg步骤4中得到的aPS/PT，室温条件下利用旋转混匀器振荡孵育3小时后加入20μL浓度为100mM的甘氨酸溶液封闭，过滤，取反应后的磁珠，使用保存液将磁珠稀释至浓度为0.25mg/mL，即得到用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂。保存液同实施例1的保存液。
实施例1、对比例1和对比例2中磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物aPS/PT的产率比较，产率为实际产量与理论产量的比值，结果见表1。
表1显示，实施例1的产率最高，对比例2其次，对比例1产率最低。
性能测试：
1. 线性：将标准品与磁微粒化学发光试剂混合，等待30~40min，采用全自动免疫化学发光分析仪检测信号值（相对光单位RLU），每个标准品分别检测3次，取平均值，以标准品的浓度和RLU得到回归方程及R2值，结果见表2。
表2显示，实施例1的线性R2为0.9997，明显优于对比例1，对比例2的线性R2与对比例1相差不明显。
2. 重复性：采用上述方法对浓度为75.00U/mL、18.75U/mL的aPS/PT质控品各重复检测10次，将测得的RLU值带入对应的标准曲线中计算实测浓度，计算变异系数CV（%），结果见表3。
如表3所示，实施例1在两个浓度点的变异系数分别为2.30%和2.67%，明显低于对比例1和对比例2。
3. 空白限：采用上述方法，将空白稀释液作为样本重复检测20次，得出20次检测结果，计算其平均值（M）和标准差（SD），以空白均值加两倍标准差（M+2SD）报告空白限，结果见表4。
如表4所示，实施例1空白限小于1U/mL，对比例1和对比例2的空白限均明显大于实施例1。
4. 稳定性：将组装好的试剂盒分别置于37℃环境下1天、3天和7天，分别测定标准品，每个浓度点重复测定3次，取平均值，与4℃保存的试剂盒对比稳定性，结果见表5。
如表5所示，实施例1中37℃7天热稳定性平均为94.26%，对比例1中37℃7天热稳定性平均为59.66%，对比例2中37℃7天热稳定性平均为91.84%。实施例1的热稳定优于对比例1和对比例2。
5. 阴、阳性符合率：分别采用实施例1、对比例1和对比例2的试剂盒检测临床样本，将检测结果与沃芬抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原IgG抗体的酶联免疫吸附试剂盒进行对比，沃芬试剂盒的检测方法参考其说明书。共测试89个临床样本，沃芬试剂盒检出23例阳性样本和66例阴性样本，实施例1、对比例1及对比例2试剂盒检测结果对比沃芬试剂盒的阴、阳性符合率结果见表6。
表6显示，实施例1中阳性样本与沃芬试剂盒符合率为100%，阴性样本符合率为98.5%。与实施例1相比，对比例的阴、阳性符合率相对更低，对比例1中，阳性样本与沃芬试剂盒符合率为78.3%，阴性样本符合率为81.8%；对比例2中，阳性样本与沃芬试剂盒符合率为87.0%，阴性样本符合率为92.4%。实施例1的测试结果与沃芬公司的酶联免疫法试剂盒的测试结果的阴阳性符合率高度一致，明显优于对比例1和对比例2。
Claims (3)
1.一种用于抗aPS/PT抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂，其特征在于，所述的磁微粒化学发光试剂由包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠和保护液组成，所述的包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠通过以下方法制备得到：
（1）先采用磷脂酶A2对磷脂酰丝氨酸进行水解反应，然后将所述的水解反应的产物先与N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二异丙基碳二亚胺进行活化反应，再将所述的活化反应的产物与3-叠氮基-1-丙胺反应，得到预处理的磷脂酰丝氨酸；
（2）将凝血酶原与戊炔酸STP酯反应得到预处理的凝血酶原；
（3）步骤（1）的预处理的磷脂酰丝氨酸和步骤（2）的预处理的凝血酶原在抗坏血酸和Cu(II)-TBTA络合物存在的条件下反应得到磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物；
（4）将步骤（3）的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物包被到磁珠上，
所述的保护液为含有1.5wt%~2.5wt% BSA、0.4wt‰~0.6wt‰ 吐温-20、100mM~200mMNaCl、2wt%~5wt%蔗糖、0.4wt‰~0.6wt‰ Proclin 300的15mM~25mM Tris缓冲液，所述的保护液的pH值为7.0~7.4，
步骤（1）中，所述的水解反应在叔丁醇和水的混合液中进行，所述的叔丁醇和水的体积比为1：（4.5~5.5），使用碱性物质调节所述的混合液的pH值为7.5~8.5，
步骤（1）中，所述的水解反应在35℃~38℃恒温条件下进行，所述的活化反应在室温条件下进行，活化反应的产物与3-叠氮基-1-丙胺的反应在室温避光条件下进行，
步骤（2）中，凝血酶原与戊炔酸STP酯的反应在pH值为8.0~8.5且浓度为0.05M~0.15M的碳酸盐缓冲液中进行，凝血酶原与戊炔酸STP酯的反应在2℃~6℃条件下进行，
步骤（2）中，采用脱盐柱对反应得到预处理的凝血酶原进行纯化处理，
步骤（3）中的反应在室温及无氧条件下进行，
步骤（3）中，采用离心取沉淀、冷丙酮清洗沉淀的方式对反应得到的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物进行纯化处理，
步骤（4）中，采用N-羟基琥珀酰亚胺和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐预激活磁珠，然后将预激活的磁珠与所述的磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物反应，反应结束后，采用浓度为80mM~120mM的甘氨酸溶液封闭，过滤，取磁珠，与所述的保护液混合得到所述的磁微粒化学发光试剂，
所述的包被磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物的磁珠在所述的磁微粒化学发光试剂中的浓度为0.2mg/mL~0.5mg/mL。
2.一种抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒包括权利要求1所述的磁微粒化学发光试剂、碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体试剂、抗aPS/PT抗体质控品、样本稀释液、存储有标定数据和/或标准曲线的ID卡或抗aPS/PT抗体标准品。
3.根据权利要求2所述的抗aPS/PT抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的抗aPS/PT抗体标准品包括浓度为150U/mL的标准品、浓度为75U/mL的标准品、浓度为37.5U/mL的标准品、浓度为18.75U/mL的标准品和浓度为9.4U/mL的标准品；
和/或，所述的样本稀释液为含有2.5wt%~3.5wt% 酪蛋白、100mM~200mM NaCl、3mM~5mMCaCl2、1.5wt%~2.5wt% 蔗糖、0.4wt‰~0.6wt‰ Proclin 300的40mM~60mM HEPES缓冲液，所述的样本稀释液的pH值为7.0~7.4。
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