CN116068172B - 一种用于抗心磷脂抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于抗心磷脂抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及试剂盒。磁微粒化学发光试剂的制备方法为：（1）将心磷脂脂质体与β2糖蛋白I混合孵育，破坏心磷脂脂质体并进行透析，加入戊炔酸STP酯反应得到预处理的β2糖蛋白I；（2）先采用高锰酸钾和偏高碘酸钠对心磷脂进行氧化，然后与N‑羟基琥珀酰亚胺和N,N’‑二异丙基碳二亚胺进行活化反应，再与3‑叠氮基‑1‑丙胺反应得到预处理的心磷脂；（3）预处理的心磷脂和预处理的β2糖蛋白I反应得到心磷脂/β2糖蛋白I复合物；（4）心磷脂/β2糖蛋白I复合物包被磁珠。本发明的磁微粒化学发光试剂及试剂盒稳定性好，检测灵敏度和准确性高。
Description
技术领域
本发明属于磁微粒化学发光检测技术领域，具体涉及一种用于抗心磷脂抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及试剂盒。
背景技术
抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid syndrome，APS)是一种以反复发生的血栓形成、血小板减少、流产为主要临床特征，并伴有血清中抗磷脂抗体(antiphospholipidantibodies，aPL)存在的临床综合征。系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus，SLE)是一种多发于育龄期女性的累及全身多脏器的自身免疫性炎症性结缔组织病，可引起继发性APS。SLE患者体内B细胞过度活化，血浆中可检测到大量自身抗体，包括抗双链DNA(double strand DNA，dsDNA)抗体、抗核抗体(anti-nuclearantibody，ANA)、抗肾小球基底膜抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗磷脂抗体等。
抗磷脂抗体是一组针对各种带负电荷磷脂、磷脂结合蛋白、磷脂-蛋白复合物的自身抗体的总称。现有研究认为，抗磷脂抗体通过干扰各种依赖磷脂的凝血因子和抗凝因子而影响机体的凝血功能。实验研究发现抗磷脂抗体在系统性红斑狼疮发病和疾病进展过程中起着重要作用，与狼疮性肾炎、凝血功能、血栓、疾病活动度密切相关。APS的临床实验诊断标准包括：抗β2糖蛋白1(anti-β2-glycoprotein 1，aβ2GPI)IgG、IgM、抗心磷脂(anticardiolipin，aCL)IgG、IgM和狼疮抗凝物(lupus anticoagulant，LA)。目前大多使用ELISA试剂盒对抗心磷脂抗体进行检测，主要方法为先将带有负电荷的磷脂或心磷脂包被于ELISA板上进行4度过夜，再将β2糖蛋白I继续包被于板上，形成心磷脂/β2糖蛋白I复合物。ELISA试剂盒制备难度大，磷脂在包被过程中易脱落，β2糖蛋白I很难与心磷脂形成复合物。由于β2糖蛋白I的第五功能区（第Ⅴ结构域）是磷脂结合区域，未与心磷脂结合的β2糖蛋白I为第五功能区未打开的环状结构，抗体识别位点没有充分暴露，导致试剂盒检测灵敏度低，假阴性率高，出现漏检现象。因此，需要开发更多的具有高检测灵敏度和高准确度的抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体定量检测试剂，为抗心磷脂抗体定量检测提供更多的选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用于抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂，所述磁微粒化学发光试剂包括包被心磷脂/β2糖蛋白I复合物的磁珠和保护液，其中，所述包被心磷脂/β2糖蛋白I复合物的磁珠由以下方法制备得到：
（1）将磷脂酰丝氨酸脂质体或心磷脂脂质体与β2糖蛋白I混合孵育，使所述β2糖蛋白I与所述磷脂酰丝氨酸脂质体或心磷脂脂质体相连，随后破坏所述磷脂酰丝氨酸脂质体或心磷脂脂质体，经透析得到打开第Ⅴ结构域的β2糖蛋白I，所述打开第Ⅴ结构域的β2糖蛋白I与戊炔酸STP酯反应得到预处理的β2糖蛋白I；
（2）采用高锰酸钾和偏高碘酸钠对心磷脂进行氧化反应，然后将所述氧化反应的产物先与N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二异丙基碳二亚胺进行活化反应，再将所述活化反应的产物与3-叠氮基-1-丙胺反应，得到预处理的心磷脂；
（3）所述预处理的β2糖蛋白I和所述预处理的心磷脂在抗坏血酸和Cu(II)-TBTA络合物存在的条件下反应得到心磷脂/β2糖蛋白I复合物；
（4）将所述心磷脂/β2糖蛋白I复合物包被到磁珠上，即得到所述包被心磷脂/β2糖蛋白I复合物的磁珠，
所述保护液为含有1~3wt% BSA、0.2~0.8wt‰ 吐温-20、100~200mM NaCl、1~5wt%蔗糖、0.2~0.8wt‰ Proclin 300的10~30mM Tris缓冲液，所述保护液的pH值为7.0~7.4。
优选地，步骤（1）中，所述磷脂酰丝氨酸脂质体中的磷脂酰丝氨酸或所述心磷脂脂质体中的心磷脂与所述β2糖蛋白I的摩尔比为（5~15）：1，孵育温度为10℃~30℃，孵育时间为5~15分钟。
优选地，步骤（1）中，所述磷脂酰丝氨酸脂质体或心磷脂脂质体的制备方法为：将含有2~5mg/mL磷脂酰丝氨酸或心磷脂的50~150 mM KCl溶液在50℃~60℃恒温条件下超声处理5~15分钟。
根据一具体实施方式，所述超声处理采用每超声处理20~40秒后立即冰上冷却20~40秒的循环方式。
优选地，步骤（1）中，用于破坏所述磷脂酰丝氨酸脂质体或心磷脂脂质体的物质为Triton X-100、SDS或脱氧胆酸钠。
根据一些具体实施方式，所述磷脂酰丝氨酸脂质体或心磷脂脂质体的破坏是通过添加10% Triton X-100或1% SDS或5% 脱氧胆酸钠混合反应30分钟完成的。
优选地，所述透析采用的透析液为含有100~200mM NaCl的5~15 mM PBS缓冲液。
优选地，所述透析在2℃~8℃下进行，所述透析时间为18~36小时。
优选地，所述打开第Ⅴ结构域的β2糖蛋白I与戊炔酸STP酯反应在pH值为8~8.5的浓度为0.05 M~0.15 M的碳酸盐缓冲液中进行，反应温度为2℃~8℃。
优选地，采用脱盐柱对所述预处理的β2糖蛋白I进行纯化处理。
优选地，步骤（2）中，所述氧化反应在35℃~38℃恒温条件下进行；所述活化反应在室温条件下进行；所述活化反应的产物与3-叠氮基-1-丙胺的反应在室温避光条件下进行。
优选地，步骤（3）中的反应在室温及无氧条件下进行。
优选地，采用离心取沉淀、冷丙酮清洗沉淀的方式对反应得到的心磷脂/β2糖蛋白I复合物进行纯化处理。
优选地，步骤（4）中，采用N-羟基琥珀酰亚胺和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐预激活磁珠，然后将预激活的磁珠与所述心磷脂/β2糖蛋白I复合物反应，反应结束后，采用浓度为80~120 mM的甘氨酸溶液封闭，过滤，取磁珠，与所述保护液混合得到所述磁微粒化学发光试剂。
优选地，所述包被心磷脂/β2糖蛋白I复合物的磁珠在所述保护液中的浓度为0.2~0.5 mg/mL。
本发明还提供一种抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体化学发光检测试剂盒，其包括如上所述的磁微粒化学发光试剂、碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体试剂、抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体质控品、样本稀释液、存储有标定数据和/或标准曲线的ID卡或抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体标准品。
优选地，所述抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体标准品包括浓度为150 AU/mL的标准品、浓度为75 AU/mL的标准品、浓度为37.5 AU/mL的标准品、浓度为18.75 AU/mL的标准品和浓度为9.4 AU/mL的标准品；所述样本稀释液为含有2~4wt% 酪蛋白、100~200mM NaCl、2~5mMCaCl2、1~3wt% 蔗糖、0.2~0.6‰ Proclin 300的40~60mM HEPES缓冲液，所述样本稀释液的pH值为7.0~7.4。
本发明的抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体化学发光检测试剂盒灵敏度和准确度高，所需临床样本用量极少，检测通量高且操作简单，仅需一台全自动化学发光免疫分析仪即可实现信号的检测及浓度值转换。本发明的抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体化学发光检测试剂盒生产周期短，设备要求不高，易于实现量产化。本发明的抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体化学发光检测试剂盒还具有检测时间短、操作简单、使用便捷、对人员技术水平要求低、应用场景广等优势。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明的包被心磷脂/β2糖蛋白I复合物的磁珠抗体识别灵敏度高，稳定性好，能够提高抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体检测的准确性，降低漏检率，且重复性好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为了提高抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体定量检测的灵敏度和准确性，本申请发明人进行了大量的研究和实验验证，最终发现通过完全符合病理条件下识别的磷脂打开闭环结构的β2糖蛋白I结合点击化学反应方式形成的β2糖蛋白I第Ⅴ结构域打开的心磷脂/β2糖蛋白I复合物包被至磁珠后具有抗体识别灵敏度高、检测结果准确性高且稳定性好的优点。下面通过实施例和对比例进一步阐述本发明的技术方案和技术效果。
以下实施例和对比例中，若无特殊说明，所使用的原料、试剂等均为常规市售产品。
以下实施例和对比例中，心磷脂、NHS采购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)；N,N’-二异丙基碳二亚胺采购自梯希爱TCI；β2糖蛋白I采购自AROTEC；戊炔酸STP酯（pentynoic STP ester）、Cu(II)-TBTA络合物采购自美国LUMIPROBE；脱盐柱采购自美国GE；磁珠采购自日本JSR。抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体标准品和质控品购自上海费玛生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种用于抗心磷脂抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及试剂盒，制备方法如下：
1.称取3.8 mg心磷脂，加入到1 mL 100 mM KCl溶液中得到心磷脂溶液。将心磷脂溶液置于55℃水浴中超声10分钟得到心磷脂脂质体，为防止过热破坏结构，30s超声后置于冰上冷却30s，以此循环。将心磷脂脂质体与β2糖蛋白I按照心磷脂和β2糖蛋白I的摩尔比为10:1混合孵育，孵育温度为25℃，孵育时间为10分钟。孵育结束后，加入10wt% TritonX-100，混匀反应30分钟，破坏心磷脂脂质体结构。将TritonX-100处理后的溶液置于含150 mMNaCl的10 mM PBS溶液中2~8℃透析24小时，得到打开第Ⅴ结构域的β2糖蛋白I溶液。
2.将0.2 mg浓度为3.5 mg/mL的打开第Ⅴ结构域的β2糖蛋白I与180 µL 0.1 M pH为8.5的碳酸盐缓冲液混匀，然后加入1.5 μL浓度为10 mg/mL的戊炔酸STP酯，在4℃条件下过夜反应。反应结束后，将反应液加入经PBS清洗的脱盐柱的上室中，800×g 离心2分钟，收集下室中的液体，使用4℃的冷丙酮沉淀β2糖蛋白I，在12000 rpm的离心条件下离心10分钟，收集沉淀。使用1×PBS重悬沉淀，使β2糖蛋白I的浓度为1 mg/mL（使用NanoDrop超微量紫外/可见光和荧光分光光度计测定β2糖蛋白I浓度），得到预处理的β2糖蛋白I溶液。
3.将叔丁醇（t-BuOH）和纯化水按照体积比为1：5的比例混合制备反应溶液200mL，然后使用5M NaOH调节反应溶液的pH值为8.0。取160 μL反应溶液，向其中加入心磷脂至终浓度为5 mg/mL，再加入5 µL 100 mg/mL NaHCO3，12 µL 150 mg/mL NaIO4，20 µL 37.5mg/mL KMnO4，37℃条件下恒温摇床振荡反应2小时，7.5mg Na2SO3终止反应10分钟。反应结束后，加入0.5 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1 μL N,N’-二异丙基碳二亚胺，在室温条件下反应过夜，再向反应液中加入0.07 mg 3-叠氮基-1-丙胺，在室温下避光反应12h，得到预处理的心磷脂溶液。
4.将步骤2的预处理的β2糖蛋白I溶液转移至反应用EP管中，同时加入40 μL步骤3的预处理的心磷脂溶液、10 μL 25 mM的抗坏血酸、25 μL 10 mM Cu(II)-TBTA络合物，形成的混合物在无氧条件下（使用氩气充满EP管后紧密关闭EP管）轻轻混合，然后放置室温过夜反应。反应结束后，使用4℃的冷丙酮沉淀复合物，在12000 rpm的离心条件下离心10分钟，收集沉淀，使用4℃的冷丙酮清洗（将沉淀与冷丙酮混合，12000 rpm离心10分钟，再次收集沉淀），清洗两次后，采用1×PBS重悬，得到终浓度为1 mg/mL的心磷脂/β2糖蛋白I复合物（使用NanoDrop超微量紫外/可见光和荧光分光光度计测定心磷脂/β2糖蛋白I浓度）。
5.取2mg磁珠，加入终浓度分别为10 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）预激活磁珠，然后加入5μg步骤4中得到的心磷脂/β2糖蛋白I复合物，室温条件下利用旋转混匀器振荡孵育3小时后加入20μL浓度为100mM的甘氨酸溶液封闭，过滤，取反应后的磁珠，使用磁珠保存液将磁珠稀释至浓度为0.25mg/mL，即得到用于抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂。其中，磁珠保护液为含有2wt% BSA、0.5wt‰ 吐温-20、150Mm NaCl、3wt% 蔗糖、0.5wt‰ Proclin 300的20mM Tris缓冲液，并使用浓盐酸调节pH至7.20±0.20。
6.使用戊二醛两步法标记的抗人IgG抗体，将碱性磷酸酶（AP）加入到含1.25wt%戊二醛的PB溶液中，混匀后4℃反应24小时。反应结束后在50mM PBS中4℃透析过夜，中途换液4次。将活化的AP加入配制好的抗人IgG溶液，4℃反应24小时。加入200 mM赖氨酸溶液，室温反应2小时。反应结束后在50mM PBS中4℃透析过夜，中途换液4次。最后离心取上清。
7.将步骤5的用于抗心磷脂抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂，步骤6的碱性磷酸酶（AP）标记的抗人IgG抗体试剂与5个浓度的抗心磷脂抗体标准品、样本稀释液组合成抗心磷脂抗体化学发光检测试剂盒。标准品的浓度为150 AU/mL、75 AU/mL、37.5 AU/mL、18.75 AU/mL、9.4 AU/mL。样本稀释液为含有3wt% 酪蛋白、150mM NaCl、4mM CaCl2、2wt%蔗糖、0.5wt‰ Proclin 300的50mM HEPES缓冲液，使用10 M NaOH调节pH至7.20±0.20。
对比例1
本对比例提供另一种用于抗心磷脂抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及试剂盒，本对比例中的β2糖蛋白I的第Ⅴ结构域未打开，具体制备方法如下：
1.将0.2 mg浓度为7.5 mg/mL的β2糖蛋白I与180 µL 0.1 M pH为8.5的碳酸盐缓冲液混匀，然后加入1.5 μL浓度为10 mg/mL的戊炔酸STP酯，在4℃条件下过夜反应。反应结束后，将反应液加入经PBS清洗的脱盐柱的上室中，800×g离心2分钟，收集下室中的液体，使用4℃的冷丙酮沉淀β2糖蛋白I，在12000 rpm的离心条件下离心10分钟，收集沉淀。使用1×PBS重悬沉淀，使β2糖蛋白I的浓度为1 mg/mL（使用NanoDrop超微量紫外/可见光和荧光分光光度计测定β2糖蛋白I浓度），得到预处理的β2糖蛋白I溶液。
2.将叔丁醇（t-BuOH）和纯化水按照体积比为1：5的比例混合制备反应溶液200mL，然后使用5M NaOH调节反应溶液的pH值为8.0。取160 μL反应溶液，向其中加入心磷脂至终浓度为5 mg/mL，再加入5 µL 100 mg/mL NaHCO3，12 µL 150 mg/mL NaIO4，20 µL 37.5mg/mL KMnO4，37℃条件下恒温摇床振荡反应2小时，7.5mg Na2SO3终止反应10分钟。反应结束后，加入0.5 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1 μL N,N’-二异丙基碳二亚胺，在室温条件下反应过夜，再向反应液中加入0.07 mg 3-叠氮基-1-丙胺，在室温下避光反应12h，得到预处理的心磷脂溶液。
3.将步骤1的预处理的β2糖蛋白I溶液转移至反应用EP管中，同时加入40 μL步骤2的预处理的心磷脂溶液、10 μL 25 mM的抗坏血酸、25 μL 10 mM Cu(II)-TBTA络合物，形成的混合物在无氧条件下（使用氩气充满EP管后紧密关闭EP管）轻轻混合，然后放置室温过夜反应。反应结束后，使用4℃的冷丙酮沉淀复合物，在12000 rpm的离心条件下离心10分钟，收集沉淀，使用4℃的冷丙酮清洗（将沉淀与冷丙酮混合，12000 rpm离心10分钟，再次收集沉淀），清洗两次后，采用1×PBS重悬，得到终浓度为1 mg/mL的心磷脂/β2糖蛋白I复合物（使用NanoDrop超微量紫外/可见光和荧光分光光度计测定心磷脂/β2糖蛋白I浓度）。
4.取2mg磁珠，加入终浓度分别为10 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）预激活磁珠，然后加入5μg步骤3中得到的心磷脂/β2糖蛋白I复合物，室温条件下利用旋转混匀器振荡孵育3小时后加入20μL浓度为100mM的甘氨酸溶液封闭，过滤，取反应后的磁珠，使用磁珠保存液将磁珠稀释至浓度为0.25mg/mL，即得到用于抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂。其中，磁珠保护液为含有2wt% BSA、0.5wt‰吐温-20、150mM NaCl、3wt%蔗糖、0.5wt‰ Proclin 300的20mM Tris缓冲液，并使用浓盐酸调节pH至7.20±0.20。
5.使用戊二醛两步法标记的抗人IgG抗体，将碱性磷酸酶（AP）加入到含1.25wt%戊二醛的PB溶液中，混匀后4℃反应24小时。反应结束后在50mM PBS中4℃透析过夜，中途换液4次。将活化的AP加入配制好的抗人IgG溶液，4℃反应24小时。加入200 mM赖氨酸溶液，室温反应2小时。反应结束后在50mM PBS中4℃透析过夜，中途换液4次。最后离心取上清。
6.将步骤4的用于抗心磷脂抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂，步骤5的碱性磷酸酶（AP）标记的抗人IgG抗体试剂与5个浓度的抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体标准品、样本稀释液组合成抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体化学发光检测试剂盒。标准品的浓度为150 AU/mL、75AU/mL、37.5 AU/mL、18.75 AU/mL、9.4 AU/mL。样本稀释液为含有3wt%酪蛋白、150mM NaCl、4mM CaCl2、2wt%蔗糖、0.5wt‰ Proclin 300的50mM HEPES缓冲液，使用10 M NaOH调节pH至7.20±0.20。
对比例2
本对比例提供另一种用于抗心磷脂抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂及试剂盒，本对比例中采用另一种方法将β2糖蛋白I的第Ⅴ结构域打开并结合心磷脂，具体制备方法如下：
1.将β2糖蛋白I用含有1.15 M NaCl、pH为11.5的20mM HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲液，在4℃下透析48小时，在24小时的时候换液一次，将所得的β2糖蛋白I用含有0.15 M NaCl、pH为7.4的20mM HEPES缓冲液，在4℃下透析8小时，向所得的β2糖蛋白I中加入细菌类脂A，其中β2糖蛋白I与细菌类脂A的质量比为500:1，使用37℃，1000 rpm条件下混匀反应1小时，然后用HiTrap螯合柱子分离纯化，纯化后所得的β2糖蛋白I定量后，用含有0.15M NaCl、pH为7.0的20mM HEPES缓冲液，稀释至1mg/mL，得到打开第Ⅴ结构域的β2糖蛋白I溶液。
2.将0.2 mg浓度为3.5 mg/mL的打开第Ⅴ结构域的β2糖蛋白I与180 µL 0.1 M pH为8.5的碳酸盐缓冲液混匀，然后加入1.5 μL浓度为10 mg/mL的戊炔酸STP酯，在4℃条件下过夜反应。反应结束后，将反应液加入经PBS清洗的脱盐柱的上室中，800×g 离心2分钟，收集下室中的液体，使用4℃的冷丙酮沉淀β2糖蛋白I，在12000 rpm的离心条件下离心10分钟，收集沉淀。使用1×PBS重悬沉淀，使β2糖蛋白I的浓度为1 mg/mL（使用NanoDrop超微量紫外/可见光和荧光分光光度计测定β2糖蛋白I浓度），得到预处理的β2糖蛋白I溶液。
3.将叔丁醇（t-BuOH）和纯化水按照体积比为1：5的比例混合制备反应溶液200mL，然后使用5M NaOH调节反应溶液的pH值为8.0。取160 μL反应溶液，向其中加入心磷脂至终浓度为5 mg/mL，再加入5 µL 100 mg/mL NaHCO3，12 µL 150 mg/mL NaIO4，20 µL 37.5mg/mL KMnO4，37℃条件下恒温摇床振荡反应2小时，7.5mg Na2SO3终止反应10分钟。反应结束后，加入0.5 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1 μL N,N’-二异丙基碳二亚胺，在室温条件下反应过夜，再向反应液中加入0.07 mg 3-叠氮基-1-丙胺，在室温下避光反应12h，得到预处理的心磷脂溶液。
4.将步骤2的预处理的β2糖蛋白I溶液转移至反应用EP管中，同时加入40 μL步骤3的预处理的心磷脂溶液、10 μL 25 mM的抗坏血酸、25 μL 10 mM Cu(II)-TBTA络合物，形成的混合物在无氧条件下（使用氩气充满EP管后紧密关闭EP管）轻轻混合，然后放置室温过夜反应。反应结束后，使用4℃的冷丙酮沉淀复合物，在12000 rpm的离心条件下离心10分钟，收集沉淀，使用4℃的冷丙酮清洗（将沉淀与冷丙酮混合，12000 rpm离心10分钟，再次收集沉淀），清洗两次后，采用1×PBS重悬，得到终浓度为1 mg/mL的心磷脂/β2糖蛋白I复合物（使用NanoDrop超微量紫外/可见光和荧光分光光度计测定心磷脂/β2糖蛋白I浓度）。
5.取2mg磁珠，加入终浓度分别为10 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）预激活磁珠，然后加入5μg步骤4中得到的心磷脂/β2糖蛋白I复合物，室温条件下利用旋转混匀器振荡孵育3小时后加入20μL浓度为100mM的甘氨酸溶液封闭，过滤，取反应后的磁珠，使用磁珠保存液将磁珠稀释至浓度为0.25mg/mL，即得到用于抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂。其中，磁珠保护液为含有2wt% BSA、0.5wt‰吐温-20、150Mm NaCl、3wt%蔗糖、0.5wt‰ Proclin 300的20mM Tris缓冲液，并使用浓盐酸调节pH至7.20±0.20。
6.使用戊二醛两步法标记的抗人IgG抗体，将碱性磷酸酶（AP）加入到含1.25wt%戊二醛的PB溶液中，混匀后4℃反应24小时。反应结束后在50mM PBS中4℃透析过夜，中途换液4次。将活化的AP加入配制好的抗人IgG溶液，4℃反应24小时。加入200 mM赖氨酸溶液，室温反应2小时。反应结束后在50mM PBS中4℃透析过夜，中途换液4次。最后离心取上清。
7.将步骤5的用于抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂，步骤6的碱性磷酸酶（AP）标记的抗人IgG抗体试剂与5个浓度的抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体标准品、样本稀释液组合成抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体化学发光检测试剂盒。标准品的浓度为150AU/mL、75 AU/mL、37.5 AU/mL、18.75 AU/mL、9.4 AU/mL。样本稀释液为含有3wt%酪蛋白、150mM NaCl、4mM CaCl2、2wt%蔗糖、0.5wt‰ Proclin 300的50mM HEPES缓冲液，使用10 MNaOH调节pH至7.20±0.20。
对实施例1、对比例1和对比例2的试剂盒分别进行性能测试，具体如下：
(1)线性比较：分别采用实施例1、对比例1和对比例2的试剂盒测定5个标准品，采用全自动化学发光免疫分析仪读取不同浓度标准品的RLU值（相对光单位），每个标准品各检测3次，取平均值，绘制标准曲线得到线性回归方程及R2值，结果见表1。
表1
如表1所示，实施例1曲线R2值为0.9996，优于对比例1和对比例2。
（2）重复性：分别采用实施例1、对比例1和对比例2的试剂盒和全自动化学发光免疫分析仪对浓度为75.00 AU/mL、18.75 AU/mL的抗心磷脂/β2糖蛋白I抗体质控品，将测得的RLU值代入各试剂盒对应的线性回归方程，计算实测浓度，每个标准品分别重复检测10次，计算变异系数CV（%），结果如表2所示。
表2
如表2所示，实施例1重复性分别为1.77%和3.99%，高浓度标准品和低浓度标准品的CV值均明显低于对比例1和对比例2，说明重复性更好。
（3）空白限：按照上述方法，分别用空白稀释液作为样本重复检测20次，得出20次检测结果，计算其平均值（M）和标准差（SD），以空白均值加两倍标准差（M+2SD）报告空白限，结果如表3所示。
表3
如表3所示，实施例1空白限小于1 AU/mL，明显低于对比例1和对比例2。
（4）稳定性：将试剂盒置于37℃环境下1天、3天和7天，分别测定标准品，每个点重复测定3次，取平均值。并与4℃保存的试剂盒对比得到其稳定性，结果表4所示。
表4
如表4所示，实施例1中37℃ 7天热稳定性平均为92.3%，对比例1的37℃ 7天热稳定性平均为89.9%，对比例2的37℃ 7天热稳定性平均为90.7%。
阴、阳性符合率：分别检测42例抗磷脂综合征阳性样本和58例体检正常样本。分别采用实施例1、对比例1和对比例2的试剂盒对其进行检测，检测结果与临床结果进行对比，统计阴、阳性符合率，详见表5。
表5
表5显示，在抗磷脂综合征阳性样本中，实施例1与临床符合率为94.6%，对比例2的阳性符合率相比对比例1高，但不及实施例1。在体检正常样本（即阴性样本）中，实施例1与临床符合率为100%，对比例1和对比例2均出现假阳性。
以上结果显示，β2糖蛋白I第Ⅴ结构域打开的心磷脂/β2糖蛋白I复合物包被的磁珠的识别抗体灵敏度和检测结果准确性有所提高，而通过不同制备方法制备的磁珠在灵敏度和检测结果准确性上存在明显差异，实施例1的磁微粒化学发光试剂性能最佳。
Claims (3)
1.一种用于抗心磷脂抗体定量检测的磁微粒化学发光试剂，其特征在于，所述磁微粒化学发光试剂包括包被心磷脂/β2糖蛋白I复合物的磁珠和保护液，其中，所述包被心磷脂/β2糖蛋白I复合物的磁珠由以下方法制备得到：
（1）将磷脂酰丝氨酸脂质体或心磷脂脂质体与β2糖蛋白I混合孵育，使所述β2糖蛋白I与所述磷脂酰丝氨酸脂质体或心磷脂脂质体相连，随后破坏所述磷脂酰丝氨酸脂质体或心磷脂脂质体，经透析得到打开第Ⅴ结构域的β2糖蛋白I，所述打开第Ⅴ结构域的β2糖蛋白I与戊炔酸STP酯反应得到预处理的β2糖蛋白I；
（2）采用高锰酸钾和偏高碘酸钠对心磷脂进行氧化反应，然后将所述氧化反应的产物先与N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二异丙基碳二亚胺进行活化反应，再将所述活化反应的产物与3-叠氮基-1-丙胺反应，得到预处理的心磷脂；
（3）所述预处理的β2糖蛋白I和所述预处理的心磷脂在抗坏血酸和Cu(II)-TBTA络合物存在的条件下反应得到心磷脂/β2糖蛋白I复合物；
（4）将所述心磷脂/β2糖蛋白I复合物包被到磁珠上，即得到所述包被心磷脂/β2糖蛋白I复合物的磁珠，
所述保护液为含有1~3wt% BSA、0.2~0.8wt‰ 吐温-20、100~200mM NaCl、1~5wt% 蔗糖、0.2~0.8wt‰ Proclin 300的10~30mM Tris缓冲液，所述保护液的pH值为7.0~7.4，
步骤（1）中，所述磷脂酰丝氨酸脂质体中的磷脂酰丝氨酸或所述心磷脂脂质体中的心磷脂与所述β2糖蛋白I的摩尔质量比为（5~15）：1，孵育温度为10℃~30℃，孵育时间为5~15分钟，
步骤（1）中，所述磷脂酰丝氨酸脂质体或心磷脂脂质体的制备方法为：将含有2~5mg/mL磷脂酰丝氨酸或心磷脂的50~150 mM KCl溶液在50℃~60℃恒温条件下超声处理5~15分钟，所述超声处理采用每超声处理20~40秒后立即冰上冷却20~40秒的循环方式，
步骤（1）中，用于破坏所述磷脂酰丝氨酸脂质体或心磷脂脂质体的物质为Triton X-100、SDS或脱氧胆酸钠；所述透析采用的透析液为含有100~200mM NaCl的5~15 mM PBS缓冲液；所述透析在2℃~8℃下进行，所述透析时间为18~36小时；所述打开第Ⅴ结构域的β2糖蛋白I与戊炔酸STP酯反应在pH值为8~8.5的浓度为0.05 M~0.15 M的碳酸盐缓冲液中进行，反应温度为2℃~8℃；采用脱盐柱对所述预处理的β2糖蛋白I进行纯化处理，
步骤（2）中，所述氧化反应在35℃~38℃恒温条件下进行；所述活化反应在室温条件下进行；所述活化反应的产物与3-叠氮基-1-丙胺的反应在室温避光条件下进行，
步骤（3）中的反应在室温及无氧条件下进行；采用离心取沉淀、冷丙酮清洗沉淀的方式对反应得到的心磷脂/β2糖蛋白I复合物进行纯化处理，
步骤（4）中，采用N-羟基琥珀酰亚胺和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐预激活磁珠，然后将预激活的磁珠与所述心磷脂/β2糖蛋白I复合物反应，反应结束后，采用浓度为80~120 mM的甘氨酸溶液封闭，过滤，取磁珠，与所述保护液混合得到所述磁微粒化学发光试剂；所述包被心磷脂/β2糖蛋白I复合物的磁珠在所述保护液中的浓度为0.2~0.5mg/mL。
2.一种抗心磷脂抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述抗心磷脂抗体化学发光检测试剂盒包括权利要求1中所述的磁微粒化学发光试剂、碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体试剂、抗心磷脂抗体质控品、样本稀释液、存储有标定数据和/或标准曲线的ID卡或抗心磷脂抗体标准品。
3.根据权利要求2所述的抗心磷脂抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述抗心磷脂抗体标准品包括浓度为150 AU/mL的标准品、浓度为75 AU/mL的标准品、浓度为37.5 AU/mL的标准品、浓度为18.75 AU/mL的标准品和浓度为9.4 AU/mL的标准品；所述样本稀释液为含有2~4wt% 酪蛋白、100~200mM NaCl、2~5mM CaCl2、1~3wt% 蔗糖、0.2~0.6‰ Proclin300的40~60mM HEPES缓冲液，所述样本稀释液的pH值为7.0~7.4。
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