CN110755684A - 负载外泌体和生长因子的微球/纳米纱复合支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种负载外泌体和生长因子的微球/纳米纱复合支架及其制备方法，复合支架为微球粘合在纳米纱表面；其中纳米纱为核壳结构纳米纱；微球为内部负载成纤维细胞生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物微球。本发明的组织工程支架具有较好的拉伸力学性能和优良的生物相容性，纳米纱的结构具有较大的孔径，纤维芯层负载的外泌体能促进组织修复有利于尿路相关细胞的三维渗透，微球能缓释成纤维细胞生长因子，有望应用于组织工程尿道等领域。

Description

负载外泌体和生长因子的微球/纳米纱复合支架及其制备 方法
技术领域
本发明属于尿道支架及其制备领域，特别涉及一种负载外泌体和生长因子的微球/纳米纱复合支架及其制备方法。
背景技术
尿道狭窄和尿道下裂是泌尿外科临床上的常见疾病，严重影响患者的排尿功能和生活质量。由于缺乏理想的尿道替代移植物，临床中多使用患者自体组织进行尿道替代，然而该方法对患者造成取材部位的巨大创伤，而且移植术后容易发生尿道瘘口和再狭窄，因此尿道狭窄和尿道下裂的修复重建一直是泌尿外科临床治疗的难题。近年来，组织工程和再生医学的发展为尿道修复提供了新的方向。在种子细胞方面，虽然自体膀胱上皮细胞和平滑肌细胞等被用于组织工程尿道的构建，然而使用自体成体细胞涉及取材部位的创伤，体外分离培养的不确定性等问题，限制了成体细胞组织工程尿道的临床应用。干细胞的出现在一些方面弥补了成体细胞的缺点，多种干细胞经过了生物学潜能验证，包括骨髓间充质干细胞，胚胎干细胞和诱导多能干细胞等，但是以上各种干细胞在安全性和可获得性上还存在一定的局限性。近年来，研究者们发现从脂肪组织中提取间充质干细胞，具有来源丰富、采集方便、生长因子多样、免疫原性低等优点，可作为组织工程尿道的优先选择。外泌体是干细胞发挥修复功能的主要因子，若能够充分利用干细胞旁分泌功能，在体外即获得充足的脂肪干细胞外泌体，然后与组织工程尿道移植物相结合，可能会获得更好的尿道修复效果。利用同轴共纺技术制备可负载外泌体的纳米纤维支架，利用双乳化法制备负载成纤维细胞生长因子的乳酸羟基乙酸共聚物微球，这种负载外泌体和生长因子的微球/纳米纱复合支架有望在组织工程尿道修复与重建领域得到应用。
静电纺丝技术在组织工程支架制备领域有广泛应用，所制备的多为纳米级到微米级的纤维，具有较大的比表面积和较高的孔隙率。因此静电纺丝纤维支架能在形态和结构上模拟天然细胞外基质，有利于细胞的黏附和增殖，进而为组织再生创造有利的条件。可用于静电纺丝的材料范围广泛，包括天然的高分子物，如：胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖等；和合成高分子物，如：聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、乳酸己内酯共聚物(PLCL)等。合成材料乳酸己内酯共聚物(75:25)具有良好的力学性能和生物可降解性能。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，有助于提高支架的生物相容性。负载生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物微球能在局部达到缓慢释放的效果，能保持较好的生物活性，更好的促进组织再生和创伤愈合。
在静电纺丝的工艺方面，目前已有多种方法可以得到不同形态的支架，同轴共纺技术是其中之一。在原有装置的基础上，根据需要将壳层和芯层材料的液体分别装在不同的两个注射器中，注射器末端连接一根内径不同的针头，壳层溶液流出和芯层液体汇合，该技术称之为同轴共纺技术。在纺丝过程中，电场力主要作用于壳层的聚合物溶液，内层药物溶液仅受到外层溶液的黏性应力，不受电场力的影响，在保持生长因子等药物活性的同时，能起到延时缓释的作用。
动态水流静电纺是一种近年来逐步发展的静电纺技术，与传统的静电纺相比，其特点在于纤维的接收装置不是固定的平面，而是流动的水面。由水面接收到的纳米纤维在水流的作用下被加捻为微米级别的纤维束，收集于不锈钢滚筒表面，形成具有一定厚度的纳米纤维网络。在冷冻干燥处理后，这些纳米纤维网络能保持具有一定孔隙的结构，有利于细胞的迁移和长入支架内部，进而促进组织修复。
课题组之前关于载药纳米纱的研究仅为负载抗纤维化药物的纳米纱，且实验结果中关于单根载药纳米纤维的透射电镜图中，仅有不连续的芯层结构，这是因为这种抗纤维化药物在无水乙醇中的溶解性并不理想，因此真正包含在纤维内部的芯层溶液就更少了，实际的载药量也就更少了。而本发明中制备的芯层负载外泌体的纳米纱，单根纤维能形成明显的皮芯结构，证明同轴静电纺丝的方法能实现外泌体的有效负载。同时，外泌体(Exosome)是细胞外囊泡的主要组成部分，研究证明外泌体广泛参与细胞之间的交流，其可能作为干细胞旁分泌的主要因子来实现损伤修复作用，外泌体内部包含细胞质内的miRNA,mRNA等活性物质，能够激活靶细胞的基因表达，从多方面促进组织潜在修复能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种负载外泌体和生长因子的微球/纳米纱复合支架及其制备方法，本发明中制备的芯层负载外泌体的纳米纱，单根纤维能形成明显的皮芯结构，证明同轴静电纺丝的方法能实现外泌体的有效负载,克服之前同轴静电纺丝制备的纳米纱载药量低的缺陷。本发明在纳米纱芯层负载干细胞发挥修复功能的主要因子外泌体，同时将其与负载生长因子的微球结合，得到了微球/纳米纱复合支架。
本发明的一种微球/纳米纱复合支架，所述复合支架为微球物理粘合在纳米纱表面；其中纳米纱为核壳结构纳米纱，其中芯层为外泌体，壳层为胶原蛋白/乳酸己内酯共聚物复合物；微球为内部负载成纤维细胞生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物微球。
本发明的一种微球/纳米纱复合支架的制备方法，包括：
将负载有成纤维细胞生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米微球分散在正己烷中，得到含有微球的正己烷悬液，将含有微球的正己烷悬液滴加在纳米纱的一面，待悬液中的正己烷挥发后，然后将含有微球的正己烷悬液加在纳米纱的另一面，浸泡在正己烷和四氢呋喃的混合溶液中，将微球物理粘合到纳米纱上，真空干燥1-3天以除去有机溶剂，得到微球/纳米纱复合支架。
上述制备方法的优选方式如下：
所述负载有成纤维细胞生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米微球具体由下列方法制备：将成纤维细胞生长因子溶液加入聚乳酸羟基乙酸共聚物溶液中，探头超声，形成悬浊液；然后将悬浊液加入含有壳聚糖的聚乙烯醇溶液中，超声乳化，形成乳液，搅拌以挥发溶剂，待微球固化成型后，离心洗涤并冷冻干燥。
所述纳米纱由下列方法制备：将乳酸己内酯共聚物PLCL和胶原蛋白COL共混溶液作为壳层溶液，将外泌体溶液作为芯层纺丝液，采用动态水流静电纺装置进行纺丝，冷冻过夜、冷冻干燥，得到纳米纱；该方法获得的纳米纱的芯层为外泌体，壳层为胶原蛋白/乳酸己内酯共聚物复合物。
所述壳层溶液为分别配置乳酸己内酯共聚物纺丝液，质量百分浓度为8％-12％，配置胶原蛋白纺丝液，质量百分浓度为8％-12％，然后共混；或者直接将乳酸己内酯共聚物、胶原蛋白溶于溶剂中，得到壳层溶液。
所述纺丝液的溶剂均为六氟异丙醇HFIP；胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白，具体的胶原蛋白为鱼源或猪源胶原蛋白。
所述壳层纺丝液中乳酸己内酯共聚物、胶原蛋白的质量比为9:1或3:1。
所述纺丝为同轴共纺技术与动态水流静电纺丝技术结合进行纺丝。
所述纺丝工艺参数为：温度20-25℃，相对湿度50-60％，壳层纺丝流速1.0-1.2mL/h,芯层纺丝流速为0.1-0.2mL/h，针头垂直于水面，距离为13-15cm，纺丝电压为10-13kV，用不锈钢滚筒接受纳米纱，纺丝时间为5-10h。
本发明提供一种所述方法制备的微球/纳米纱复合支架。
本发明提供一种所述微球/纳米纱复合支架的应用。
有益效果
(1)本发明纳米纱的疏松结构有利于细胞的三维渗透，纳米纱内部负载的外泌体中包含的miRNA及微球内的负载的生长因子有利于促进组织修复。
(2)本发明首次将天然细胞外基质(ECM)的主要成分胶原蛋白与具有优良力学性能的乳酸己内酯共聚物作为原料制备复合材料，并在芯层负载干细胞发挥修复功能的主要因子外泌体，同时将其与负载生长因子的微球结合，得到了微球/纳米纱复合支架，该支架具有良好的力学性能，能够满足体内微环境需要的生物力学强度。
(3)本发明制备的微球/纳米纱复合支架能在保证一定力学性能的基础上具有更大的孔径和更高的孔隙率，有利于细胞的长入、增殖、迁移，具有良好的生物相容性。
(4)本发明制备的复合支架能对负载的外泌体进行缓慢释放，与传统的静电纺相比，这种纳米纱具有更大的孔径和更高的孔隙率，因其具有疏松多孔的三维结构，有利于细胞的长入、增殖、迁移；与此同时，微球内负载的生长因子也能进行缓慢释放，二者同时作用能够达到修复缺损的组织。
(5)本发明制备的负载外泌体和生长因子的微球/纳米纱复合支架选取的原材料均为生物可降解材料，能随着尿道组织的新生逐渐降解，该仿生支架可采取多种比例，也可根据需求制造出不同的厚度，在尿道组织重建和修复方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为纳米纱的制备设备原理示意图；
图2为负载外泌体的载药纳米纱单根纤维的载药透射电镜图；
图3为微球/纳米纱复合支架的表面扫描电镜图；
图4为人源皮肤成纤维细胞在微球/纳米纱复合支架的上生长在各时间点(1天，4天，7天)的增殖情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将培养犬脂肪干细胞(ADSC，从上海市第六人民医院获得)的培养基上清液以250×g离心15分钟，然后用PBS洗涤沉淀3次，并以低速(300×g，10分钟，2,000×g，10分钟)连续离心以去除细胞碎片。然后，将上清液通过0.22μm过滤器过滤。将过滤后的上清液转移至15mL Amicon Ultra-15离心过滤器中，并以4,000×g离心。将超滤后的液体用PBS洗涤3次，然后以4,000×g进行再次超滤。为了纯化外泌体，将超滤后的液体转移到Ultra-ClearTM管，并以100,000×g超速离心70分钟以沉淀外泌体，然后将其用大量PBS洗涤，并再次以相同的速度超速离心70分钟。所有步骤均在4℃下进行。将外泌体重悬于无菌PBS中，并保存在-80℃冰箱中进行后续实验。
(2)称取1.08g粘均分子量为2.6的PLCL(75:25)(购于济南岱罡生物科技有限公司)和0.12g的分子量约为30万的鱼胶原蛋白(购于山东国际生物科技园有限公司)溶于10mL六氟异丙醇(购于上海达瑞精细化学品有限公司)，磁力搅拌器过夜搅拌，得到PLCL/COL溶液(质量浓度12％)，作为壳层纺丝液，将500μL的外泌体溶液溶于1mL的PBS中作为芯层纺丝液(浓度为50％)，在温度25℃，相对湿度50％，壳层纺丝流速1.0mL/h，芯层纺丝流速为0.1mL/h，针头垂直于水面，距离为15cm，纺丝电压为10kV，纺丝时间为10h，用不锈钢滚筒接受纳米纱，转速为20r/min，按照图1所示装置进行负载外泌体纳米纱的制备。最后将制得的纳米纱置于-80℃冰箱冷冻过夜、冷冻干燥除去水分后得到负载外泌体的纳米纱。
(3)称取0.1g粘均分子量为0.62的聚乳酸羟基乙酸共聚物(购于济南岱罡生物科技有限公司)溶于1mL二氯甲烷中，磁力搅拌器搅拌1小时使其溶解；称取1g相对密度为1.27-1.31的聚乙烯醇(购于沃凯化学试剂有限公司)溶于100mL的去离子水中，油浴加热，冷却后备用。称取0.04g低粘度：<200mPa.s的壳聚糖(购于阿拉丁化学试剂有限公司)和1mL的乙酸加入冷却后的聚乙烯醇溶液中，搅拌至溶解。用移液枪取500μL的生长因子溶液加入聚乳酸羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液中，探头超声，形成悬浊液，将悬浊液加入含有壳聚糖的聚乙烯醇溶液中，超声乳化，形成乳液，将上述乳液高速搅拌以挥发溶剂，待微球固化成型后，离心洗涤并里冷冻干燥，得到载有成纤维细胞生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米微球。
将微球均匀分散在正己烷中，再滴加在纳米纱上，待正己烷挥发后，将含有微球的正己烷悬液滴加在纳米纱的另一面，然后将支架浸泡在正己烷和四氢呋喃的混合溶液中，将微球物理粘合到纳米纱上，将支架真空干燥3天以除去有机溶剂，即得微球/纳米纱复合支架。与此同时制备对照组，纳米纱组为乳酸己内酯共聚物共混纺制的；负载外泌体的纳米纱组为芯层载有外泌体的纳米纱；负载生长因子的纳米纱组是在纳米纱组的基础上，结合了载有成纤维细胞生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米微球；负载外泌体和生长因子的纳米纱组是负载外泌体的纳米纱组的基础上，结合了载有成纤维细胞生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米微球。
将上述实施例1中得到的纳米纤维用铜网接收，通过透射电镜观察单根纤维的结构，如图2所示，单根纤维粗细均匀，具有明显的皮芯结构。
将上述实施例1中得到的纳米纱微球复合支架喷金后通过扫描电子显微镜观察表面形貌，如图3所示，复合支架中的纳米纱由多根纳米纤维加捻缠绕而成，有明显的沟槽结构，微球能分散在纳米纱支架的表面，并且没有破坏纳米纱的纳米纤维结构。
将上述实施例1中得到的纳米纱微球复合支架用打孔器制成相应大小，置于24孔板中，将人源皮肤成纤维细胞接种在各组支架上，2万/孔，分别培养1,4,7天后，用细胞增殖检测试剂盒检测细胞在各组支架(各组支架的制备方法上文中已给出详细说明)上的增殖情况，如图4所示，结果显示细胞在同时载有外泌体和生长因子的支架(实施例1中获得的同时载有外泌体和生长因子的支架)上在第7天的吸光度最高，比其它对照组有更好的生长状态。

Claims (10)

1.一种微球/纳米纱复合支架，其特征在于，所述复合支架为微球粘合在纳米纱表面；其中纳米纱为核壳结构纳米纱，其中芯层为外泌体，壳层为胶原蛋白/乳酸己内酯共聚物复合物；微球为内部负载成纤维细胞生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物微球。
2.一种微球/纳米纱复合支架的制备方法，包括：
将负载有成纤维细胞生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米微球分散在正己烷中，得到含有微球的正己烷悬液，将含有微球的正己烷悬液滴加在纳米纱的一面，待悬液中的正己烷挥发后，然后将含有微球的正己烷悬液加在纳米纱的另一面，浸泡在正己烷和四氢呋喃的混合溶液中，真空干燥，得到微球/纳米纱复合支架。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述负载有成纤维细胞生长因子的聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米微球具体由下列方法制备：将成纤维细胞生长因子溶液加入聚乳酸羟基乙酸共聚物溶液中，探头超声，形成悬浊液；然后将悬浊液加入含有壳聚糖的聚乙烯醇溶液中，超声乳化，形成乳液，搅拌以挥发溶剂，待微球固化成型后，离心洗涤并冷冻干燥。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述纳米纱由下列方法制备：
将乳酸己内酯共聚物、胶原蛋白纺丝液共混溶液为壳层溶液，将外泌体溶液作为芯层纺丝液，采用动态水流静电纺装置进行纺丝，冷冻过夜、冷冻干燥，得到纳米纱。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述纺丝液的溶剂为六氟异丙醇；胶原蛋白为鱼源或猪源胶原蛋白。
6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述壳层纺丝液中乳酸己内酯共聚物、胶原蛋白的质量比为9:1或3:1。
7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述纺丝为同轴共纺技术与动态水流静电纺丝技术结合进行纺丝。
8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述纺丝工艺参数为：温度20-25℃，相对湿度50-60％，壳层纺丝流速1.0-1.2mL/h,芯层纺丝流速为0.1-0.2mL/h，针头垂直于水面，距离为13-15cm，纺丝电压为10-13kV，用不锈钢滚筒接受纳米纱，纺丝时间为5-10h。
9.一种权利要求2所述方法制备的微球/纳米纱复合支架。
10.一种权利要求1所述微球/纳米纱复合支架的应用。
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