CN110734896B - 一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用，属于皮肤修复技术领域。本发明通过Wnt4基因和YWHAZ基因的表达腺病毒载体在间质干细胞中过表达来修饰MSC来源外泌体(MSC‑exosome)，使exosome过表达Wnt4基因和YWHAZ基因，实现MSC‑exosome促进大鼠烫伤皮肤组织的再生修复的药用目的。

Description

一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于皮肤修复技术领域，具体涉及一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种由于人体内胰岛素分泌的绝对或相对不足而引起的终身性代谢性疾病，属于影响人类健康的重要疾病。糖尿病足部皮肤溃疡(diabetic foot ulcer)是糖尿病最常见和最主要的并发症之一，流行病学调查显示约有1/4糖尿病患者会发生足部溃疡，糖尿病足部溃疡最早发生神经病变，后期发展会导致足部循环障碍，感觉障碍，进一步出现足趾或足部坏疽，最终导致截肢或合并全身严重感染而死亡，因此糖尿病皮肤溃疡较烧伤等其他创伤发病机制复杂且更加难以愈合。现有治疗方法如神经生长因子合并局部换药处理等，仍存在如抗菌药物使用不当，伤口护理和外科干预不当等问题，使得溃疡创面迁延不愈，因此尚需更为有效的解决方案。
Exosome即非可溶性的微囊泡结构是近年来发现的细胞间信号通讯的重要途径，是细胞可溶性细胞因子外的重要旁分泌形式。Exosome的特性主要有：(1)直径为40～100nm；(2)具有来源细胞的胞质和脂质胞膜成分；(3)密度为1.13～1.19g/ml；(4)含有其来源细胞的特异性蛋白及exosome相关蛋白如CD9、CD81、Alix等。Exosome成分主要包括：microRNA，mRNA，mtDNA，蛋白，表面标记等，蛋白组学分析发现exosome的蛋白组成较为复杂，不同细胞来源的exosome蛋白组成亦有差异。
MSC分泌的微囊泡(MSC-exosome)是其旁分泌作用中最有活性成分，已有报道证实MSC-exosome在心、肝、肾、神经系统等组织损伤修复中发挥了重要作用。研究发现，已成功分离纯化不同来源的人骨髓及脐带MSC分泌的exosome，具有促进大鼠皮肤烫伤再生修复的作用(专利号CN201410775694.6)。但是未处理过的hucMSC-exosome治疗效果不佳。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用，Wnt4/YWHAZ共修饰得到的改造后的间质干细胞源外泌体具有较好的促进大鼠烫伤皮肤组织的再生修复的功能。
本发明提供了一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体的制备方法，包括以下步骤：
1)分别构建Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒；
2)用步骤1)构建得到的Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒转染间质干细胞，培养；
3)收集Wnt4和YWHAZ过表达后的间质干细胞培养后的上清液，去除漂浮的活细胞，分离纯化上清液中的外泌体，得到Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体。
优选的，所述Wnt4过表达腺病毒中Wnt4的mRNA变异体的核苷酸序列如序列表SEQID No.1所示。
所述YWHAZ过表达腺病毒中YWHAZ的mRNA变异体的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示。
所述Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒中腺病毒的元件顺序为mCMV-MCS-3Flag-SV40-EGFP。
优选的，步骤2)中所述转染时，Wnt4过表达腺病毒或YWHAZ过表达腺病毒的病毒滴度分别为1～2×108PFU/mL。
优选的，步骤2)中所述培养前，Western blot技术分析转染后的间质干细胞中Wnt4和YWHAZ的过表达情况，筛选Wnt4和YWHAZ过表达的间质干细胞。
优选的，步骤2)中所述培养的方法包括以下步骤：
用含体积浓度10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养3～5代Wnt4和YWHAZ过表达的间质干细胞，待细胞融合至70％～80％时换无血清培养基培养48h，收集上清液。
优选的，步骤3)中所述去除漂浮的活细胞的方法包括离心；所述离心的转速为700～900rpm；所述离心的时间为12～20min。
优选的，步骤3)中所述分离纯化上清液中的外泌体的方法包括以下步骤：
将去除活细胞后的上清液依次去除细胞碎片和细胞器、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心、再次超滤浓缩和除菌；
所述去除细胞碎片和细胞器的方法包括离心；去除细胞碎片的离心转速为2 000×g；离心时间为10min；去除细胞器的离心转速为10 000×g；离心时间为30min；
所述超滤浓缩或再次超滤浓缩时超滤所用滤膜的截留分子量为100kDa；所述超滤浓缩的离心转速为1 000×g；离心的时间为30min；离心的温度为4℃；
所述蔗糖密度梯度离心的转速为100 000×g；离心的时间为3h；离心的温度为4℃；所述蔗糖密度梯度离心的介质为质量百分含量30％的蔗糖/重水密度垫；
所述除菌包括滤膜除菌；所述滤膜除菌的孔径为0.22μm。
优选的，所述间质干细胞为人脐带间质干细胞。
本发明提供了所述制备方法制备得到的Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体。
本发明提供了所述Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体在制备促进糖尿病动物皮肤组织再生修复的药物中的应用。
本发明提供了所述制备方法制备得到的Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体。本发明利用MSC-exosome能够携载Wnt4和YWHAZ的特性，将Wnt4和YWHAZ基因过表达于MSC细胞后，分离提取得到MSC源外泌体。采用western blot检测Wnt4/YWHAZ-exosome和Vector-exosome的表面标记蛋白，结果发现，Wnt4/YWHAZ-exosome中Wnt4/YWHAZ蛋白表达量显著地高于未进行修饰的对照exosome，证明对hucMSC-exosome进行Wnt4/YWHAZ蛋白的高表达修饰成功且有效，Wnt4/YWHAZ-exosome构建成功。
本发明提供了所述Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体在制备促进糖尿病动物皮肤组织再生修复的药物中的应用。对2型糖尿病(T2DM)大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤模型为研究对象，用Wnt4/YWHAZ蛋白修饰的hucMSC-exosome进行治疗，以PBS作为空白对照，对照Vector-exosome作为对照，大体创面观察照片表明，与对照PBS相比，Wnt4/YWHAZ-exosome与Vector-exosome均可以促进烫伤皮肤的修复作用，但是Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组的创伤面积比Vector-exosome更小，治疗效果更佳；从毛发生长状态来看，Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组皮肤组织损伤后毛发生长最多，证明其具有更好地促进损伤后皮肤组织附属结构形成的作用。
同时，大体创面观察照片表明，与单独YWHAZ修饰的exosome(YWHAZ-exosome)相比，Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组的创伤面积更小，促进皮肤表皮再生修复效果更佳，证明Wnt4的修饰是Wnt4/YWHAZ-exosome促进皮肤组织再生的重要原因。HE染色的结果显示，Wnt4-exosome与Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组的表皮生长情况没有太大差别，但与单独Wnt4-exosome治疗组相比，Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组的皮肤附属结构明显的增多，表明YWHAZ的修饰对于Wnt4/YWHAZ-exosome促进皮肤干细胞分化方面具有重要作用。以上两个结果证明，Wnt4/YWHAZ共修饰才能更好的提高MSC-exosome治疗皮肤组织再生修复作用。
附图说明
图1为Wnt4骨架质粒的电泳图，Marker为DNA Marker(100～15000bp)；
图2为YWHAZ骨架质粒的电泳图，Marker为DNA Marker(100～15000bp；
图3为本发明分离培养的脐带间质干细胞的形态图；
图4为对照腺病毒(Ad-Vector)及Wnt4/YWHAZ腺病毒(Ad-Wnt4+Ad-YWHAZ)转染后的MSC，提取总蛋白，Western blot分析Wnt4/YWHAZ的表达情况；
图5为透射电镜观察Wnt4和YWHAZ共修饰的exosome与对照exosome的形态，标尺为100nm；
图6为Western blot分析分离纯化后的exosome中Wnt4和YWHAZ的蛋白表达情况；
图7为Wnt4/YWHAZ共修饰的exosome及对照exosome治疗大鼠深度烫伤的大体创面照片；
图8为Wnt4/YWHAZ修饰的exosome及对照exosome治疗大鼠深度烫伤的创面组织病理HE染色后的照片；
图9为Wnt4/YWHAZ修饰的exosome其对照exosome治疗大鼠深度烫伤的创面组织PCNA免疫组织化学染色；
图10为细胞计数分析Wnt4/YWHAZ-exosome及对照Vector-exosome对皮肤角质HACAT细胞的增值影响结果图；
图11为划痕实验分析Wnt4/YWHAZ-exosome及对照Vector-exosome对皮肤角质HACAT细胞的迁移影响结果图；
图12为Wnt4/YWHAZ-exosome与YWHAZ-exosome治疗治疗大鼠深度烫伤的大体创面照片；
图13为Wnt4/YWHAZ-exosome与Wnt4-exosome治疗治疗大鼠深度烫伤的皮肤组织HE照片。
具体实施方式
本发明提供了一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体的制备方法，包括以下步骤：
1)分别构建Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒；
2)用步骤1)构建得到的Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒转染间质干细胞，培养；
3)收集Wnt4和YWHAZ过表达后的间质干细胞培养后的上清液，去除漂浮的活细胞，分离纯化上清液中的外泌体，得到Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体。
本发明分别构建Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒。
在本发明中，所述Wnt4过表达腺病毒中Wnt4的mRNA变异体的核苷酸序列优选如序列表SEQ ID No.1所示(NCBI登陆号为NM_030761.5，
Figure GDA0002323676440000051
Figure GDA0002323676440000052
Figure GDA0002323676440000061
Figure GDA0002323676440000062
)；所述YWHAZ过表达腺病毒中YWHAZ的mRNA变异体的核苷酸序列优选如序列表SEQ ID No.2所示(NCBI登陆号为NM_003406.4，
Figure GDA0002323676440000063
Figure GDA0002323676440000064
)；所述Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒中腺病毒的元件顺序优选为mCMV-MCS-3Flag-SV40-EGFP，载体的编号为FV012。本发明对所述Wnt4和YWHAZ基因的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的Wnt4和YWHAZ基因来源即可。本发明对所述腺病毒的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的腺病毒的商品途径购买得到即可。Wnt4和YWHAZ过表达腺病毒构建与常规腺病毒载体构建的步骤一致，无特殊要求。Wnt4和YWHAZ腺病毒载体骨架质粒构建的基本信息为表1和表2，Wnt4和YWHAZ腺病毒载体骨架质粒的电泳图依次见图1和图2。
表1 Wnt4骨架质粒构建的基本信息表
Figure GDA0002323676440000071
表2 YWHAZ骨架质粒构建的基本信息表
Figure GDA0002323676440000072
完成构建后，本发明用构建得到的Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒转染间质干细胞，培养。
在本发明中，所述间质干细胞优选为人脐带间质干细胞(hucMSC)。本发明对所述人脐带MSC的分离培养方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的分离培养方法即可，例如采用已建立的方法成功分离培养及鉴定hucMSC(Qiao Chun et al.Human mesenchymal stemcells isolated from the umbilical cord.Cell Biol Int.2008Jan；32(1):8-15)。分离出的hucMSC于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养(见图3)。
在本发明中，所述转染时，Wnt4过表达腺病毒或YWHAZ过表达腺病毒的病毒滴度分别优选为1～2×108PFU/mL。本发明对所述转染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转染方法即可。
在本发明中，所述培养前，优选Western blot技术分析转染后的间质干细胞中Wnt4和YWHAZ的过表达情况，筛选Wnt4和YWHAZ过表达的间质干细胞，结果见图4。本发明对Western blot技术分析转染后的间质干细胞中Wnt4和YWHAZ的过表达情况没有特殊限制，采用本领域所熟知的Western blot技术即可。
在本发明中，所述培养的方法优选包括以下步骤：用含体积浓度10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养3～5代Wnt4和YWHAZ过表达的间质干细胞，待细胞融合至70％～80％时换无血清培养基培养48h，收集上清液。所述培养过程，有利于Wnt4和YWHAZ过表达在外泌体中。
培养后，本发明收集Wnt4和YWHAZ过表达后的间质干细胞培养后的上清液，去除漂浮的活细胞，分离纯化上清液中的外泌体，得到Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体。
在本发明中，所述去除漂浮的活细胞的方法优选包括离心；所述离心的转速优选为700～900rpm，更优选为800rpm；所述离心的时间优选为12～20min，更优选为15min。
在本发明中，所述分离纯化上清液中的外泌体的方法优选包括以下步骤：将去除活细胞后的上清液依次去除细胞碎片和细胞器、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心、再次超滤浓缩和除菌；所述去除细胞碎片和细胞器的方法优选包括离心；去除细胞碎片的离心转速优选为2 000×g；离心的时间优选为10min；去除细胞器的离心转速优选为10 000×g；离心的时间优选为30min；所述超滤浓缩或再次超滤浓缩时超滤所用滤膜的截留分子量优选为100kDa；所述超滤浓缩的离心转速优选为1 000×g；离心的时间优选为30min；离心的温度优选为4℃；所述蔗糖密度梯度离心的转速优选为100 000×g；离心的时间优选为3h；离心的温度为4℃；所述蔗糖密度梯度离心的介质优选为质量百分含量30％的蔗糖/重水密度垫；所述除菌优选包括滤膜除菌；所述滤膜除菌的孔径优选为0.22μm。分离纯化后，本发明还优选用BCA蛋白质定量试剂盒法进行蛋白质定量检测。
本发明提供了所述制备方法制备得到的Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体。透射电镜观察exosome的基本形态，结果见图5。用western blot检测Wnt4/YWHAZ-exosome和Vector-exosome的表面标记蛋白和Wnt4/YWHAZ蛋白的高表达修饰情况，结果见图6。
本发明提供了所述Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体在制备促进糖尿病动物皮肤组织再生修复的药物中的应用。
在本发明中，所述药物的剂型优选为注射剂。所述注射剂中所述Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体的浓度为1g/mL。所述Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体的注射量为200μg/只大鼠。
下面结合实施例对本发明提供的一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
名词解释：
Wnt4(Wnt family member 4；Wnt家族成员4)；YWHAZ(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta；酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白zeta)；hucMSC(Human umbilical cord MesenchymalStem Cells；人脐带间质干细胞)；exosome(外泌体)；PBS(磷酸盐缓冲液)；Vector-exosome(对照空载腺病毒转染的外泌体)；Wnt4/YWHAZ-exosome(Wnt4及YWHAZ过表达腺病毒转染的外泌体)；Ad-VECTOR(对照空载的腺病毒载体)；Ad-Wnt4(Wnt4过表达的腺病毒载体)；Ad-YWHAZ(YWHAZ过表达的腺病毒载体)。
实施例1
主要材料和来源分别如下：
MSC培养试剂低糖DMEM、胎牛血清(Gibco公司产品)、胰蛋白酶(Sigma公司产品)、二氧化碳培养箱(Forma公司)、无血清培养基(上海依科赛公司；
转染试剂：lipo2000(美国lifetechnology公司)
倒置显微镜，荧光显微镜，生物显微镜，电子显微镜，超净工作台，台式离心机；
Wnt4过表达腺病毒载体(苏州复百澳生物技术有限公司)，YWHAZ过表达腺病毒载体(苏州复百澳生物技术有限公司)；
Wnt4和YWHAZ修饰exosome的制备试剂：重水(D2O，上海创赛公司)，分析纯蔗糖(广州化学试剂厂)，胎牛血清(Gibico)，兔抗人CD81抗体(美国Bioworld Technology公司)，兔抗人CD63抗体(美国Epitomics公司)，BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(北京康为世纪公司)，HRP化学发光底物、100kDa MWCO超滤离心管、0.22μm无菌滤膜(美国Millipore公司)；透射电子显微镜(FEI Tecnai 12，Philips公司)；定量PCR试剂(北京Cwbio公司)。
对本发明实例1具体实施步骤描述如下
(1)脐带MSC的分离培养：采用已建立的方法成功分离培养及鉴定hucMSC(QiaoChun et al.Human mesenchymal stem cells isolated from the umbilical cord.CellBiol Int.2008Jan；32(1):8-15)，分离出的hucMSC于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养，如图3。
(2)将Wnt4和YWHAZ过表达腺病毒及其对照病毒以大约108的病毒滴度进行MSC细胞的转染，通过Westernblot技术分析腺病毒hucMSC转染后，其表达Wnt4和YWHAZ的蛋白情况，证明Wnt4和YWHAZ是否在hucMSC中过表达成功(图4)。
(3)收集Wnt4和YWHAZ过表达后的hucMSC培养上清(hucMSC-CM)：选择生长状态良好的3～5代Wnt4和YWHAZ过表达腺病毒转染的hucMSC先用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70％-80％时换无血清培养基培养，48h后收集培养上清，离心机800rpm离心15min以去除漂浮的活细胞，-70℃冰箱储存备用。
(4)Wnt4和YWHAZ蛋白修饰的exosome(Wnt4/YWHAZ-exosome)脐带间质干细胞分泌上清(hucMSC-CM)中外泌体的分离纯化(本发明应用蔗糖密度梯度离心法，此方法已有专利保护，不作为本发明保护的重点)：将收集的hucMSC上清液于4℃、2 000×g离心10min，以去除细胞碎片；收集上清后于4℃、10 000×g离心30min，以去除细胞器；将上清转移至100-kDa MWCO超滤离心管，4℃、1000×g离心30min进行浓缩；将浓缩液缓慢移至5ml 30％蔗糖/重水密度垫(ρ＝1.210g/cm3)，4℃、100000×g离心3h；收集底部5ml蔗糖/重水层(含exosome)，PBS稀释后加入100kDa MWCO超滤离心管中，4℃、1 000×g离心30min，PBS洗涤3次；最后用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，分装后于-70℃保存，并用BCA蛋白质定量试剂盒法进行蛋白质定量检测。
(5)透射电镜观察exosome的基本形态：hucMSC-Ex各20μL，充分混匀后滴加于直径2mm的载样铜网上，于室温静置5min后，用滤纸轻轻吸去铜网边缘残余液体，然后将铜网倒扣于30g/L磷钨酸(pH 6.8)液滴上，室温下负染5min，最后将铜网在白炽灯下烘干，置于透射电镜下观察并拍照，如图5所示经过Wnt4/YWHAZ表达修饰后的exosome(Wnt4/YWHAZ-exosome)及其对照exosome(Vector-exosome)直径约为100nm囊泡状结构；
(6)westernblot检测Wnt4/YWHAZ-exosome和Vector-exosome的表面标记蛋白：配制15％SDS-PAGE电泳胶，将上述提取的exosome充分裂解后加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，按200μg蛋白质总量上样，电转移(350mA，120min)将蛋白质转至PVDF膜上，用含50g/L脱脂牛奶的TBS/T室温封闭1h，分别与兔抗人CD9抗体和兔抗人CD81抗体(1:500)于4℃反应过夜，次日用TBS/0.5％Tween 20洗膜3次后，与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗37℃温育1h)，TBS/0.5％Tween 20洗膜3次后，加入预混HRP化学发光底物，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测，如附图6所示，脐带来源的exosome的标记CD81，CD63呈阳性表达；同时可以发现，Wnt4/YWHAZ-exosome中Wnt4/YWHAZ蛋白表达量显著地高于未进行修饰的对照exosome，证明对hucMSC-exosome进行Wnt4/YWHAZ蛋白的高表达修饰成功且有效，Wnt4/YWHAZ-exosome构建成功(图6)。
实施例2
实验动物来源及试剂说明：
SD大鼠(济宁医学院动物实验中心，此实验由济宁医学院附属医院伦理委员会批准)；
本课题组自行发明的小型动物烫伤装置(已授权专利号：201420060187.X)；
免疫组织化学染色试剂(武汉博士德公司，按照试剂盒说明书进行操作)；
24孔培养板，6孔培养板(美国Corning公司)；罗氏便携式血糖仪(活力型)
HACAT细胞(上海中科院购买)；
PCNA抗体(美国Bioworld公司)
生物显微镜(日本Nikon公司)，病理切片HE染色及PCNA组织化学染色的实验平台(德国Leica公司)。
具体实施步骤描述如下：
(1)2型糖尿病(T2DM)大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤模型的构建：200g左右雄性SD大鼠，45％高脂饲料喂养5周后尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)(35mg/kg)(Sigma)，7天后用罗氏便携式血糖仪(活力型)检测血糖有无>16.7mmol/L，并通过口服糖耐量实验(OGTT)、胰岛素耐受实验(IPITT)等实验检测糖耐量等辅助诊断是否构建成功(大鼠高血糖标准为16.7mmol/L)，将T2DM大鼠背部应用8％的Na2S进行脱毛处理，次日应用发明人自制的烫伤装置80℃损伤8s，制造一个直径为1.5cm的圆形深Ⅱ度烫伤的创面。
(2)Wnt4/YWHAZ蛋白修饰的hucMSC-exosome(Wnt4/YWHAZ-exosome)的应用：将每只大鼠在创面皮下组织注射200μl磷酸盐缓冲液(PBS)溶解的蛋白含量为200μg Wnt4/YWHAZ-exosome及其对照exosome(原始外泌体，参见已授权专利号201410775694.6，发明名称为人脐带间质干细胞分泌的exosome治疗皮肤损伤的应用的专利)进行治疗，以PBS作为空白对照；修复效果观察的时间分别是烫伤治疗后的5天，10天。
如图7，大体创面观察照片表明，与对照PBS相比，Wnt4/YWHAZ-exosome与对照exosome均可以促进烫伤皮肤的修复作用，但是Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组的创伤面积比对照exosome更小，治疗效果更佳；从毛发生长状态来看，Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组皮肤组织损伤后毛发生长最多，证明其具有更好地促进损伤后皮肤组织附属结构形成的作用。
皮肤组织病理切片HE染色后的观察表明，与PBS的阴性对照相比，Wnt4/YWHAZ-exosome与对照exosome均可以促进烫伤皮肤的表皮再生化，但Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组的皮肤组织细胞增生最活跃，且表皮再生化程度最明显，表明与原始状态的exosome(未改造的外泌体)相比，Wnt4/YWHAZ蛋白修饰的exosome(Wnt4/YWHAZ-exosome)具有更佳地治疗效果，如图8；从HE染色后的皮肤组织结构中可以看出，与原始exosome(exosome)Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组的皮肤组织中，毛囊、皮脂腺等附属结构显著地的增高，证明了Wnt4/YWHAZ-exosome具有更佳的治疗效果，如图8。
对治疗组和对照组皮肤组织进行细胞增殖指标PCNA的组织化学染色表明，Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组皮肤组织中PCNA的阳性率较未修饰exosome显著增多(见图9)。
因此，较原有的发明(已授权专利号201410775694.6，人脐带间质干细胞分泌的exosome治疗皮肤损伤的应用)相比，Wnt4/YWHAZ蛋白修饰的hucMSC-exosome具有更好的促进大鼠深度烫伤修复的作用。
实施例3
实验器材说明：
HACAT细胞购买自ATCC。
倒置显微镜(日本Nikon公司)，超净工作台(国产)，台式离心机(美国Thermo公司)。
实验步骤如下：
(1)通过细胞计数验证不同修饰方式对细胞生长的影响，具体是将5000个HACAT细胞种在24孔板中，第二天加Wnt4/YWHAZ-exosome或Vector-exosome刺激，然后每天计数每孔细胞的数量，连续计数3天。
结果表明，与SD大鼠体内皮肤组织的结果一致，Wnt4/YWHAZ-exosome和Vector-exosome均能促进体外皮肤细胞HaCAT细胞数量的增加，但是Wnt4/YWHAZ-exosome处理组HACAT细胞生长速度更快，且显著地高于Vector-exosome(见图10)；
(2)通过细胞的划痕实验来分析不同修饰的exosome对细胞迁移的影响，将106HACAT细胞种至6孔板中，应用10μm的枪头进行划痕，加Wnt4/YWHAZ-exosome或Vector-exosome刺激，24h后进行拍照，观察细胞向划痕区域迁移的速率。
结果显示，较Vector-exosome对照相比，Wnt4/YWHAZ-exosome处理后的HACAT的细胞迁移能力显著地增高(见图11)。
与Vector-exosome相比，Wnt4/YWHAZ-exosome具有更强地促进皮肤细胞扩增和向创面迁移的能力。
对比例1
按照实施例1的方法构建单独过表达Wnt4的外泌体(Wnt4-exosome)，不同之处在于仅用Wnt4过表达腺病毒转染人脐带间质干细胞，其他步骤没有差别。
对比例2
按照实施例1的方法构建单独过表达YWHAZ的外泌体(YWHAZ-exosome)，不同之处在于仅用YWHAZ过表达腺病毒转染人脐带间质干细胞，其他步骤没有差别。
实施例4
Wnt4/YWHAZ蛋白修饰的hucMSC-exosome(Wnt4/YWHAZ-exosome)的应用：将每只大鼠在创面皮下组织注射200μl磷酸盐缓冲液(PBS)溶解的蛋白含量为200μg Wnt4/YWHAZ-exosome及其对照Vector-exosome进行治疗，以单独YWHAZ修饰的exosome和单独Wnt4修饰的exosome作为空白对照，修复效果观察的时间分别是烫伤治疗后的5天，10天。
结果如下：
(1)大体创面观察照片表明，与单独YWHAZ修饰的exosome(YWHAZ-exosome)相比，Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组的创伤面积更小，促进皮肤表皮再生修复效果更佳，证明Wnt4的修饰是Wnt4/YWHAZ-exosome促进皮肤组织再生的重要原因(见图12)。
(2)HE染色的结果显示，Wnt4-exosome与Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组的表皮生长情况没有太大差别，但与单独Wnt4-exosome治疗组相比，Wnt4/YWHAZ-exosome治疗组的皮肤附属结构明显的增多，表明YWHAZ的修饰对于Wnt4/YWHAZ-exosome促进皮肤干细胞分化方面具有重要作用(见图13)。以上两个结果证明，Wnt4/YWHAZ共修饰才能更好的提高MSC-exosome治疗皮肤组织再生修复作用。
与单独Wnt4或者YWHAZ修饰exosome相比(Wnt4-exosome或者YWHAZ-exosome)，Wnt4/YWHAZ-exosome具有更好的修复效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 济宁医学院附属医院
<120> 一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1055
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagtcccc gctcgtgcct gcgttcgctg cgcctcctcg tcttcgccgt cttctcagcc 60
gccggagcaa ctggctgtac ctggccaagc tgtcgtcggt ggggagcatc tcagaggagg 120
agacgtgcga gaaactcaag ggcctgatcc agaggcaggt gcagatgtgc aagcggaacc 180
tggaagtcat ggactcggtg cgccgcggtg cccagctggc cattgaggag tgccagtacc 240
agttccggaa ccggcgctgg aactgctcca cactcgactc cttgcccgtc ttcggcaagg 300
tggtgacgca agggactcgg gaggcggcct tcgtgtacgc catctcttcg gcaggtgtgg 360
cctttgcagt gacgcgggcg tgcagcagtg gggagctgga gaagtgcggc tgtgacagga 420
cagtgcatgg ggtcagccca cagggcttcc agtggtcagg atgctctgac aacatcgcct 480
acggtgtggc cttctcacag tcgtttgtgg atgtgcggga gagaagcaag ggggcctcgt 540
ccagcagagc cctcatgaac ctccacaaca atgaggccgg caggaaggcc atcctgacac 600
acatgcgggt ggaatgcaag tgccacgggg tgtcaggctc ctgtgaggta aagacgtgct 660
ggcgagccgt gccgcccttc cgccaggtgg gtcacgcact gaaggagaag tttgatggtg 720
ccactgaggt ggagccacgc cgcgtgggct cctccagggc actggtgcca cgcaacgcac 780
agttcaagcc gcacacagat gaggacctgg tgtacttgga gcctagcccc gacttctgtg 840
agcaggacat gcgcagcggc gtgctgggca cgaggggccg cacatgcaac aagacgtcca 900
aggccatcga cggctgtgag ctgctgtgct gtggccgcgg cttccacacg gcgcaggtgg 960
agctggctga acgctgcagc tgcaaattcc actggtgctg cttcgtcaag tgccggcagt 1020
gccagcggct cgtggagttg cacacgtgcc gatga 1055
<210> 2
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggataaaa atgagctggt tcagaaggcc aaactggccg agcaggctga gcgatatgat 60
gacatggcag cctgcatgaa gtctgtaact gagcaaggag ctgaattatc caatgaggag 120
aggaatcttc tctcagttgc ttataaaaat gttgtaggag cccgtaggtc atcttggagg 180
gtcgtctcaa gtattgaaca aaagacggaa ggtgctgaga aaaaacagca gatggctcga 240
gaatacagag agaaaattga gacggagcta agagatatct gcaatgatgt actgtctctt 300
ttggaaaagt tcttgatccc caatgcttca caagcagaga gcaaagtctt ctatttgaaa 360
atgaaaggag attactaccg ttacttggct gaggttgccg ctggtgatga caagaaaggg 420
attgtcgatc agtcacaaca agcataccaa gaagcttttg aaatcagcaa aaaggaaatg 480
caaccaacac atcctatcag actgggtctg gcccttaact tctctgtgtt ctattatgag 540
attctgaact ccccagagaa agcctgctct cttgcaaaga cagcttttga tgaagccatt 600
gctgaacttg atacattaag tgaagagtca tacaaagaca gcacgctaat aatgcaatta 660
ctgagagaca acttgacatt gtggacatcg gatacccaag gagacgaagc tgaagcagga 720
gaaggagggg aaaattaa 738

Claims (10)

1.一种Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别构建Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒；
2)用步骤1)构建得到的Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒转染间质干细胞，培养；
3)收集Wnt4和YWHAZ过表达后的间质干细胞培养后的上清液，去除漂浮的活细胞，分离纯化上清液中的外泌体，得到Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述Wnt4过表达腺病毒中Wnt4的mRNA变异体的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
所述YWHAZ过表达腺病毒中YWHAZ的mRNA变异体的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
所述Wnt4过表达腺病毒和YWHAZ过表达腺病毒中腺病毒的元件顺序为mCMV-MCS-3Flag-SV40-EGFP。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中所述转染时，Wnt4过表达腺病毒或YWHAZ过表达腺病毒的病毒滴度独立为1～2×108PFU/mL。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中所述培养前，Western blot技术分析转染后的间质干细胞中Wnt4和YWHAZ的过表达情况，筛选Wnt4和YWHAZ过表达的间质干细胞。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中所述培养的方法包括以下步骤：
用含体积浓度10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养3～5代Wnt4和YWHAZ过表达的间质干细胞，待细胞融合至70％～80％时换无血清培养基培养48h，收集上清液。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3)中所述去除漂浮的活细胞的方法包括离心；所述离心的转速为700～900rpm；所述离心的时间为12～20min。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3)中所述分离纯化上清液中的外泌体的方法包括以下步骤：
将去除活细胞后的上清液依次去除细胞碎片和细胞器、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心、再次超滤浓缩和除菌；
所述去除细胞碎片和细胞器的方法包括离心；去除细胞碎片的离心转速为2000×g；离心时间为10min；去除细胞器的离心转速为10000×g；离心时间为30min；
所述超滤浓缩或再次超滤浓缩时超滤所用滤膜的截留分子量为100kDa；所述超滤浓缩的离心转速为1000×g；离心的时间为30min；离心的温度为4℃；
所述蔗糖密度梯度离心的转速为100000×g；离心的时间为3h；离心的温度为4℃；所述蔗糖密度梯度离心的介质为质量百分含量30％的蔗糖/重水密度垫；
所述除菌包括滤膜除菌；所述滤膜除菌的孔径为0.22μm。
8.根据权利要求1～7任意一项所述制备方法，其特征在于，所述间质干细胞为人脐带间质干细胞。
9.权利要求1～7任意一项所述制备方法制备得到的Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体。
10.权利要求9所述Wnt4/YWHAZ共修饰的间质干细胞源外泌体在制备促进糖尿病动物皮肤组织再生修复的药物中的应用。
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