CN117547503A - 负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶及其制备方法和应用，其属于生物医学技术领域，该制备方法包括以下步骤：将甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中，搅拌反应后，再依次进行透析和冷冻干燥处理，得到水凝胶前体；往水凝胶前体中加入光引发剂和抗炎外泌体，然后置于紫外光下交联形成负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶；其中，抗炎外泌体是从脂肪间充质干细胞炎症模型中提取得到的。本发明提供的制备方法，成功建立了抗炎外泌体‑水凝胶载药系统，其可实现抗炎外泌体在创面的缓释，延长其作用时间，丰富了目前治疗糖尿病创面的手段，为糖尿病皮肤创面治疗提供新思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体是一种负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤作为人体的第一道生理防线和最大的器官，容易受到外界物理性、生物性及化学性等因素而发生损伤。皮肤创面修复包括四个阶段：出血、炎症、增殖、重塑。正常的皮肤具有强大的自我修复能力。
而糖尿病患者的高血糖状态及继发的表面血管及神经病变使得皮肤自我修复功能严重受损。因此糖尿病患者的溃疡比较难以愈合，尤其是远端溃疡。糖尿病足溃疡(DFU)是糖尿病的重要并发症，糖尿病患者发生足部溃疡的风险为19％-34％，且溃疡复发率很高：溃疡愈合后1年内为40％，5年内为65％。约5％的DFU患者面临截肢，而截肢患者的死亡率达到20％以上。
目前糖尿病溃疡的常规治疗手段是在控制血糖的基础上积极抗感染治疗，对于感染溃疡的局部处理则包括：对结痂和坏死组织的清创、清洗伤口和溃疡减压。用于治疗溃疡的敷料和伤口愈合的产品种类繁多，包括酶类、凝胶、水胶体和含碘或银盐的抗菌剂等，但均未能明显促进创面的愈合。
目前干细胞技术飞速发展，大量临床试验表明，间充质干细胞可通过分化为皮肤组织细胞；分泌的细胞因子调节炎性反应，诱导血管新生，增强上皮细胞生长，加速细胞外基质的形成促进创面愈合，给创面治疗带来新的希望。现有研究表明间充质干细胞主要通过旁分泌外泌体参与组织损伤修复。外泌体是一种活细胞分泌的囊性小泡，大小为40-160nm，携带大量具有组织或细胞特异性的蛋白质、脂质及遗传物质，可调控不同的生理活动。与干细胞治疗相比，外泌体具有许多干细胞不可比拟的优点：1、外泌体具有更低的免疫原性，可以避免产生免疫排斥反应；2、外泌体可保护其内容物免于降解，从而防止某些活性成分降解失效；3、外泌体可在培养基内大量富集从而实现量产；4、外泌体功能可通过改变细胞环境来改变。
糖尿病溃疡难以愈合的原因部分在于创面愈合存在炎症期延长或炎症过度。创面愈合均会经历炎症期，皮肤的免疫细胞会迁移到创面并分泌大量的促炎因子。炎症反应是机体的免疫应答反应，可清除病原体及坏死细胞，对创面愈合至关重要。而在糖尿病创面中，愈合早期的炎症反应与正常创面相比出现时间晚，持续时间长。高血糖、高血脂及缺血缺氧环境可导致炎症细胞出现内环境紊乱及功能障碍，生成大量的活性氧，进而诱导细胞凋亡或坏死，还促进炎症因子的释放，使创面进入炎症一氧化应激-炎症的恶性循环，导致创面难以愈合。因此抑制炎症反应并减少在炎症反应过程中产生的细胞因子对改善皮肤创面的免疫微环境具有重要意义。
目前，已有大量研究证明外泌体具有调节免疫、免疫抑制的作用，可促使免疫细胞转化为抗炎表型，减少促炎细胞因子的分泌。随着对外泌体研究不断深入，工程化外泌体成为一大研究热点。工程化外泌体通过对天然外泌体进行生物工程技术处理后，赋予或者增强天然外泌体的生物功能，以达到治疗目的。而现有应用中，外泌体的功能多取决于其所来源的细胞类型，尚无工程化抗炎外泌体用于促进皮肤创面愈合。而且外泌体治疗皮肤创面的方法通常为注射。但由于糖尿病患者皮肤修复能力严重受损，即便是针尖大小的伤口也可能发展为溃疡，同时通过注射给药的外泌体也会被机体快速清除代谢，导致治疗效果大打折扣。因此，有必要提供一种工程化抗炎外泌体的制备方法，再通过简单、无创、有效的水凝胶载药系统治疗糖尿病创面具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
将甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中，搅拌反应后，再依次进行透析和冷冻干燥处理，得到水凝胶前体；
往水凝胶前体中加入光引发剂和抗炎外泌体，然后置于紫外光下交联形成负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶；
所述抗炎外泌体的制备方法包括以下步骤：
从脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞沉淀，然后去除残留红细胞，离心后用完全培养基重悬后，再进行传代培养；
将传代培养的脂肪间充质干细胞加入新鲜的完全培养基中，并添加脂多糖进行诱导，得到脂肪间充质干细胞炎症模型；
从脂肪间充质干细胞炎症模型中提取得到抗炎外泌体。
优选地，所述完全培养基至少包括基础培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素。
优选地，所述基础培养基为DMEM基础培养基。
优选地，所述脂多糖的终浓度为0.05-0.15μg/mL。
优选地，从脂肪间充质干细胞炎症模型中提取得到抗炎外泌体的步骤，具体包括：
将脂肪间充质干细胞炎症模型用缓冲液润洗，并加入基础培养基进行培养后，再取其富集外泌体的上清液；
利用差速离心法对上清液进行处理后，再经过超滤浓缩、过滤及超速离心处理，得到抗炎外泌体。
优选地，所述明胶溶液中明胶的浓度为0.05-0.15g/mL；所述甲基丙烯酸酐与明胶溶液的体积比为(0.6-1)：10。
优选地，所述光引发剂为LAP光引发剂。
优选地，每1mL的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶中含有150-250μg的抗炎外泌体。
本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述制备方法制得的负载抗炎外泌体的Ge1MA水凝胶。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶在制备用于治疗糖尿病皮肤创面的药物中的应用。
本发明提供的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，成功建立了抗炎外泌体-水凝胶载药系统，其可实现抗炎外泌体在创面的缓释，延长其作用时间，丰富了目前治疗糖尿病创面的手段，为糖尿病皮肤创面治疗提供新思路。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法的流程示意图。
图2为本发明实施例利用NTA检测抗炎外泌体大小的结果示意图。
图3为本发明实施例利用TEN检测抗炎外泌体形态的结果示意图。
图4为本发明实施例利用qRT-PCR检测IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β细胞因子相对表达量的结果示意图。
图5为本发明实施例制得的负载抗炎外泌体的Ge1MA水凝胶进行糖尿病小鼠创面试验的结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的一个实施例中，提供了一种负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
S1、将甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中，搅拌反应后，再依次进行透析和冷冻干燥处理，得到水凝胶前体；
S2、往水凝胶前体中加入光引发剂和抗炎外泌体，然后置于紫外光下交联形成负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶；
上述抗炎外泌体的制备方法包括以下步骤：
S21、从脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞沉淀，然后去除残留红细胞，离心后用完全培养基重悬后，再进行传代培养；
S22、将传代培养的脂肪间充质干细胞加入新鲜的完全培养基中，并添加脂多糖进行诱导，得到脂肪间充质干细胞炎症模型；
S23、从脂肪间充质干细胞炎症模型中提取得到抗炎外泌体。
本发明实施例提供的方法可以从来源丰富的脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的脂肪间充质干细胞，其分泌的外泌体具有促进组织细胞修复、替代器官治疗等功能。
另外，水凝胶是一种高分子生物材料，可在各种治疗中传递功能性药物、分子和细胞。水凝胶作为缓释药物的载体，保护受损区域免受外界不良刺激，保持受损部位湿润，提高药物利用率，该方法可实现外泌体的智能缓释，延长外泌体的局部作用时间。
具体的，在步骤S21中，取外科手术患者皮下脂肪组织，去除其他组织，用无菌PBS缓冲液冲洗多次后，再经过胶原酶I消化、过滤、离心处理，得到脂肪间充质干细胞沉淀；然后，加入红细胞裂解液去除残留红细胞，离心后用完全培养基重悬，转移到细胞培养瓶中传代培养。
在步骤S22中，取4-5代脂肪间充质干细胞，加入脂多糖(LPS)，诱导12h即可得到脂肪间充质干细胞炎症模型。
在本发明的一个优选实施例中，上述完全培养基至少包括基础培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素；具体的，完全培养基可由89％基础培养基、10％胎牛血清以及1％青霉素/链霉素组成。
在本发明的一个优选实施例中，上述基础培养基为DMEM基础培养基，但不限于此。
在本发明的一个优选实施例中，上述脂多糖的终浓度为0.05-0.15μg/mL。
在本发明的一个优选实施例中，从脂肪间充质干细胞炎症模型中提取得到抗炎外泌体的步骤，具体包括：
S231、将脂肪间充质干细胞炎症模型用缓冲液润洗，并加入基础培养基进行培养后，再取其富集外泌体的上清液；
S231、利用差速离心法对上清液进行处理后，再经过超滤浓缩、过滤及超速离心处理，得到抗炎外泌体。
在步骤S23中，脂肪间充质干细胞炎症模型可用PBS缓冲液润洗2-3次后加入基础培养基，放入细胞培养箱中培养10-14h后，取其富集外泌体的上清液；然后利用差速离心法去除上清液中的死细胞、细胞碎片及其他杂质，再经过超滤浓缩、过滤及超迷离心得到高浓度、高纯度的抗炎外泌体。
在本发明的一个优选实施例中，上述明胶溶液中明胶的浓度为0.05-0.15g/mL；上述甲基丙烯酸酐与明胶溶液的体积比为(0.6-1)：10。
在本发明的一个优选实施例中，上述光引发剂为LAP光引发剂。
在本发明的一个优选实施例中，每1mL的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶中含有150-250μg的抗炎外泌体。
在本发明的另一个实施例中，还提供了一种上述负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶在制备用于治疗糖尿病皮肤创面的药物中的应用。
在本发明的另一个实施例中，还提供了一种糖尿病创面模型的建立方法：小鼠经过4-5周高糖高脂饮食有道胰岛素抵抗后，腹腔注射低剂量链脲佐菌素溶液建立糖尿病小鼠模型。在糖尿病小鼠脊柱两侧制备全层皮肤创面及得到高度还原糖尿病溃疡的创面模型。
下述实施例为本发明在实际应用中的部分具体实施案例，但不局限于此。
实施例1：如附图1所示，该实施例提供了一种负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)人脂肪间充质干细胞的分离及培养：取外科手术患者皮下脂肪组织，置于培养皿中，用无菌剪刀尽量去除多于组织后，用10mL灭菌一次性注射器抽取无菌PBS冲洗脂肪组织至冲洗液澄清，剪刀将脂肪组织充分剪碎，转移至离心管中，加入2倍体积PBS，2000rpm离心10min。更换离心管，加入与脂肪组织等体积0.1％胶原酶I，室温中消化1h。加入1倍体积完全培养基(由89％基础培养基、10％胎牛血清以及1％青霉素/链霉素组成)终止消化，用细胞筛网过滤脂肪消化液至新的离心管，离心机2000rpm离心10min，弃上清，按1：3体积比例向细胞沉淀加入红细胞裂解液，用移液枪吹打混匀，常温裂解2min后以1000rpm离心5min。去除上清液，加入3ml完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液移入T25细胞培养瓶中，显微镜下观察到脂肪间充质干细胞形态，一般多呈梭形或纺锤形。将细胞放入5％CO2、37℃的细胞培养培养。每3天换液1次，待细胞生长至融合度达80％-89％时，即可进行胰酶消化传代处理。
(2)人脂肪间充质干细胞炎症模型的建立：待脂肪间充质干细胞传代至4-5代，生长覆盖瓶底70％-80％时，弃去旧培养基，移液枪加入3mL新鲜完全培养基及0.3μg的LPS(0.1μg/mL)，轻轻摇匀后放入5％CO2、37℃细胞培养箱诱导12h。
(3)抗炎外泌体的提取：利用LPS诱导人脂肪间充质干细胞炎症模型12h后，从细胞培养箱中取出细胞，弃去培养基，移液枪吸取1mL不含钙、镁离子的PBS缓冲液润洗细胞1-2次后加入3mL的DMEM基础培养基，继续放入细胞培养箱培养12h后，移液枪取上清液，转移至15mL离心管中，4℃、300g离心6min，以去除死细胞；将上清液再次离心，4℃下10000g离心30min，以去除细胞碎片及其他杂质；最后将上清液转移至15mL超滤管中，4℃、3500g离心20min，得到浓缩上清液；浓缩上清液经过0.22μm滤膜过滤后，超速离心机4℃、120000g离心90min，弃上清，最终获得高浓度、高纯度的工程化抗炎外泌体沉淀。抗炎外泌体沉淀用PBS重悬得到浓度为1μg/μL的外泌体悬液，于-80℃冰箱储存。
(4)水凝胶前体的合成：称取1g明胶于烧杯中，加入10mL的PBS缓冲液，水浴锅中水浴加热至60℃，磁力搅拌溶解。然后再加入0.8mL甲基丙烯酸酐，水浴加热至50℃，磁力搅拌反应3h。随后加入40mL在40℃下预热过的PBS溶液到上述溶液中以终止反应。将得到的溶液装入14000Da透析袋中，在40-50℃去离子水中透析1周，透析后的溶液在冷冻干燥机中进行冻干，得到泡沫状水凝胶前体(GelMA前体)。
(5)0.25％(w/v)光引发剂标准溶液的配制：取20mL的PBS直接加入装有0.05g LAP的棕色瓶中，在水浴锅中以40-50℃水浴加热溶解15min，期间不断震荡瓶身，混匀后4℃避光条件下保存。
(6)建立抗炎外泌体-GelMA水凝胶载药系统：取所需质量的水凝胶前体置于离心管中，加入PBS溶液配制30％(w/v)的GelMA溶液，取相应量(参考现有GelMA水凝胶制备所需的光引发剂用量即可)的0.25％(w/v)光引发剂标准溶液加入离心管，40-50℃避光水浴加热溶解30min，不断振荡使GelMA充分浸润溶解，待溶解后立刻用0.22μm的无菌针头过滤器将溶液过滤至新的无菌离心管中，即得到GelMA混合溶液；接着，将上述GelMA混合溶液经55℃水浴加热30min后，立刻在室温下加入上述所提取的抗炎外泌体，使得每1mL的GelMA水凝胶含有200μg外泌体；然后将混合溶液置于紫外光照射下照射1min进行交联，形成负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶。
实施例2：该实施例利用纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)检测上述实施例1制得的抗炎外泌体的大小，具体如下：NTA工作原理是在检测时通过光学显微镜收集外泌体的散射光信号，观测一段时间内颗粒在溶液中做布朗运动的影像，并对每一个颗粒进行追踪和分析，再通过爱因斯坦方程式(<X，Y>2＝KBTts/3πηdh，其中，<X，Y>2/ts：扩散系数；T：测量温度；KB：玻尔兹曼常数；η：介质粘度；dh：液体力学直径)计算出抗炎外泌体的流体力学尺寸。检测步骤和现有技术中常规检测步骤相同，结果如图2所示，直径在100nm左右，在外泌体直径范围内。
实施例3：该实施例利用透射电子显微镜(TEN)检测上述实施例1制得的抗炎外泌体的形态，其中，双层囊膜结构是外泌体重要标志之一，透射电子显微镜分辨率可达0.1-0.2nm，可将被观察物体放大至数百万倍，非常适合进行外泌体双层囊膜超微结构观测。具体的检测步骤如下：抗炎外泌体用戊二醛固定：外泌体沉淀用50-100μL的2％PFA重悬，如果是富集的冰冻外泌体，融化并与等量4％PFA混合。取5μL抗炎外泌体悬液滴加到载样铜网上，再用1％戊二醛液滴载样铜网5min后用ddH2O洗2min。外泌体染色：铜网放在50μL草酸双氧铀液滴5min，再放在50甲基纤维素-UA液滴上10min，铜网常温干燥数分钟后80kV下检测成像。获得成像结果，如图3所示，透射电子显微镜下的上述制得的抗炎外泌体呈均匀、球形的膜囊泡。
实施例4：该实施例利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测上述实施例1制得的外泌体抗炎的功能，通过Trizol试剂处理提取出总mRNA，并使用cDNA合成试剂盒根据制造商的方案逆转录成cDNA。然后进行RT-PCR，得到抗炎细胞因子IL-10和TGF-β及促炎细胞因子IL-6和TNF-α的基因表达情况差异。具体操作流程如下：
1、诱导巨噬细胞：THP-1细胞为悬浮细胞，具有分化为巨噬细胞的能力。将THP-1细胞分成两组，以6×105/mL的密度分别培养于T25培养瓶中，每组加入3mL完全培养基(89％RPMI-1640+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素)及160ng/mL的PMA，放入5％CO2、37℃细胞培养箱，诱导72h，悬浮的THP-1细胞分化成贴壁的巨噬细胞。取出诱导完毕的巨噬细胞，弃去旧培养基，用移液枪吸取1mL的PBS润洗细胞，重复3次，以完全去除非贴壁细胞和旧培养基。
2、分组处理巨噬细胞：实验组巨噬细胞加入上述提取的抗炎外泌体(20μg/mL)及新鲜完全培养基(89％RPMI-1640+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素)，空白对照组只加等体积的完全培养基(89％RPMI-1640+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素)，于5％CO2、37℃细胞培养箱培养。48h后去除旧培养基，移液枪吸1mL的PBS润洗，重复3次后，加入1mL胰酶消化贴壁细胞2min，待镜下观察到细胞变圆变亮，用1mL的完全培养基终止消化，并用移液枪吹打细胞贴壁的培养瓶底部，确保所有细胞均消化为细胞悬液。将细胞悬液转移到新的离心管中，以300g离心3min，弃上清，得到的细胞沉淀可进行qRT-PCR。
3、qRT-PCR实验过程：
3.1、RNA提取：细胞沉淀中加入1mL的Trizol试剂，反复吹打，室温裂解10min，将裂解液转移至1.5mLEP管中，每个样本加入200μL氯仿，涡旋振荡器振荡，使Trizol和氯仿充分混匀，静止1-2分钟使溶液重新分层。4℃，12000rpm的条件下离心15min，离心后液体分为三层，上层为含有RNA的氯仿，中间白色层是蛋白和细胞碎片，下层为Trizol试剂。用移液枪小心转移上层RNA至新的1.5mLEP管中，再加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min后4℃，12000rpm离心10min，可得到位于离心管底部的白色RNA沉淀。弃去上清液，轻柔加入1mL75％乙醇，上下颠倒洗去残留在RNA沉淀表面的异丙醇后4℃，7500rpm离心10min。小心吸去上清液，将EP管倒扣在吸水纸上，室温晾干至RNA沉淀从白色变成透明。加入40μL的DEPC水，重悬RNA沉淀后即可进行下一步。
3.2、测RNA浓度：
打开酶标仪后，纸巾擦拭盖子和样本板，每个样本孔上滴2μL的DD水，干净的纸擦掉后在第一个孔加入2μL的DD水作为对照，其他孔加2μL的RNA样本，进行检测。测试结果OD260/280在1.8-2.0范围内表明所提RNA纯度较高，越接近2说明纯度越高。
3.3、RNA逆转录合成cDNA：
使用逆转录试剂盒，将500ng的RNA逆转录为CDNA，全程冰上操作。
去除基因组DNA：4×DN Master Mix与gDNA Remover按1：50体积混合后，按下表1配制去除基因组DNA的反应体系。
表1
将配好的反应体系放入PCR仪中，设置反应程序为：37℃45min，4℃维持。
逆转录反应：将去除基因组DNA的8μL反应液按下表2配制逆转录反应的反应体系。
表2
将配好的反应体系放入PCR仪中，设置反应程序为：37℃15min，50℃5min，98℃5min，4℃维持。
3.4、qRT-PCR反应：
将逆转录反应得到的cDNA，配制如下表3的20μL的反应体系，全程冰上操作。
表3
上述反应体系混匀后，设置qRT-PCR仪反应程序：95℃1min Cycle 1；95℃5s，55℃10s，72℃15s Cycle 40；4℃维持。用GAPDH定量各mRNA的相对水平，并以相对比率表达。
上述实验结果如图4所示，从图中可以看出，本发明实施例所提取的抗炎外泌体可显著减少巨噬细胞IL-6、TNF-α促炎细胞因子的表达，增加IL-10、TGF-β抗炎细胞因子的表达，其表明本发明实施例所提取的抗炎外泌体具有显著的抗炎特性。
实施例5：该实施例提供了一种II型糖尿病小鼠模型建立方法，具体如下：
将6只4-5周龄、体重在16-20g小鼠饲养在温度25℃，光/暗周期交替12小时环境中，予高糖高脂饮食(基础维持饲料加蔗糖、炼猪油和蛋黄按比搭配制作高脂高糖饲料：其比例为猪油18％，蔗糖20％，蛋黄3％，基础饲料59％)诱导小鼠胰岛素抵抗。4-6周后，小鼠禁食不禁水8h，左手握小鼠，拇指及食指捏住小鼠颈背部，小指和无名指协同大鱼际固定小鼠尾部，腹部向上，头呈低位，一次性注射器抽取链脲佐菌素溶液(100mg/kg，溶于0.1mmol/L柠檬酸缓冲液中，避光冰上配制)，在小鼠下腹部离腹白线约0.5cm处刺入腹腔并注射。在第3、7、14天用血糖仪从小鼠尾静脉采静脉血，检测空腹血糖，血糖水平为≥200mg/dL(11.1mmoL/L)的小鼠被认为患有糖尿病。
实施例6：建立糖尿病小鼠创面模型：将6只糖尿病小鼠分成2组：外泌体-水凝胶组及对照组，1mL一次性注射器抽取0.4ml戊巴比妥钠，一只手抓住小鼠的尾巴向后拉，另一只手的大拇指和食指抓小鼠的头背部皮毛，腹腔向上，在下腹部离腹白线约0.5cm处将穿刺针刺入腹腔，腹腔麻醉小鼠后，用剃毛器剃去小鼠背部毛发，并使用脱毛膏于背部进行脱毛处理至无毛。在小鼠脊柱旁腰背部，左右对称，制备直径8mm全层皮肤缺损创面，记第0天。
实施例7：抗炎外泌体治疗糖尿病小鼠创面：创面第1、3、5天，外泌体-水凝胶组在创面表面覆盖200μL上述制得的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶(抗炎外泌体的含量为200μg/mL)，对照组创面表面覆盖200μL的GelMA水凝胶(未负载抗炎外泌体)，并对两组小鼠创面拍照。第7天对小鼠创面拍照，对比创面面积、愈合速度。结果如图5所示，从图中可以看出，外泌体-水凝胶组小鼠创面愈合速度明显快于对照组，其表明本发明实施例制得的负载抗炎外泌体的Gel MA水凝胶可显著促进糖尿病创面愈合。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容。
Claims (10)
1.一种负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将甲基丙烯酸酐加入明胶溶液中，搅拌反应后，再依次进行透析和冷冻干燥处理，得到水凝胶前体；
往水凝胶前体中加入光引发剂和抗炎外泌体，然后置于紫外光下交联形成负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶；
所述抗炎外泌体的制备方法包括以下步骤：
从脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞沉淀，然后去除残留红细胞，离心后用完全培养基重悬后，再进行传代培养；
将传代培养的脂肪间充质干细胞加入新鲜的完全培养基中，并添加脂多糖进行诱导，得到脂肪间充质干细胞炎症模型；
从脂肪间充质干细胞炎症模型中提取得到抗炎外泌体。
2.根据权利要求1所述的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述完全培养基至少包括基础培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素。
3.根据权利要求2所述的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM基础培养基。
4.根据权利要求1所述的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述脂多糖的终浓度为0.05-0.15μg/mL。
5.根据权利要求1所述的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，其特征在于，从脂肪间充质干细胞炎症模型中提取得到抗炎外泌体的步骤，具体包括：
将脂肪间充质干细胞炎症模型用缓冲液润洗，并加入基础培养基进行培养后，再取其富集外泌体的上清液；
利用差速离心法对上清液进行处理后，再经过超滤浓缩、过滤及超速离心处理，得到抗炎外泌体。
6.根据权利要求1所述的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述明胶溶液中明胶的浓度为0.05-0.15g/mL；所述甲基丙烯酸酐与明胶溶液的体积比为(0.6-1):10。
7.根据权利要求1所述的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为LAP光引发剂。
8.根据权利要求1所述的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶的制备方法，其特征在于，每1mL的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶中含有150-250μg的抗炎外泌体。
9.一种采用权利要求1-8中任一项所述的制备方法制得的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶。
10.一种如权利要求9所述的负载抗炎外泌体的GelMA水凝胶在制备用于治疗糖尿病皮肤创面的药物中的应用。
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