CN117551605A - 一种工程化抗炎外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种工程化抗炎外泌体及其制备方法和应用，其属于生物医学技术领域，其中，抗炎外泌体的制备方法包括以下步骤：从脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞沉淀，然后加入红细胞裂解液去除残留红细胞，离心后用完全培养基重悬，再进行传代培养；将传代培养的脂肪间充质干细胞加入新鲜的完全培养基，并添加脂多糖进行诱导，得到脂肪间充质干细胞炎症模型；将脂肪间充质干细胞炎症模型用PBS缓冲液润洗，并加入基础培养基进行培养后，再取其富集外泌体的上清液；利用差速离心法对上清液进行处理后，再经过超滤浓缩、过滤及超速离心处理，得到抗炎外泌体。本发明制得的抗炎外泌体具有较好的抗炎特性，可显著促进皮肤创面愈合。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体是一种工程化抗炎外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤作为人体最大的器官，是人体免疫的第一道防线，容易受到外界物理性、生物性及化学性等因素而发生损伤。皮肤损伤后，创面修复会经历出血、炎症、增殖、重塑四个阶段。对于普通创伤，机体可通过自身免疫反应和组织再生进行自我修复。但随着人们生活水平的提高以及老龄化进程的加快，世界糖尿病的发病率逐年上升。由于糖尿病患者创面愈合能力严重受损，皮肤创面可进一步发展为糖尿病溃疡，导致住院率、截肢率、致死率增加，给国家、社会的健康发展带来了严重的经济与社会负担。美国科学家通过大量科学研究数据分析得出，目前美国每年用于慢性难愈合创面的护理费用超10亿美元，占欧盟财政资源总额的2％左右，至2030年美国65岁及以上老龄人口数量将达到目前的2倍，慢性难愈合创面的发病率将急剧增加。对于这些慢性创面或创面较大者，机体难以自行愈合，需给予医疗干预进行治疗。
目前干细胞技术飞速发展，为组织器官损伤修复、重构再生提供了更具优势的新途径，成为再生医学领域最具潜力的发展方向之一，也为皮肤创面的治疗提供了新思路。其中间充质干细胞具有可塑性和强大的旁分泌能力，成为治疗皮肤创面的热点。现有研究表明间充质干细胞主要通过旁分泌外泌体参与组织损伤修复。外泌体是细胞分泌的膜外囊泡，由细胞内溶酶体微粒内陷形成多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。其直径范围在40-160nm，包含了DNA、RNA、脂质、代谢物、胞质和细胞表面蛋白质等多种细胞成分。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中，通过融合到靶细胞膜或者靶细胞胞吞作用摄入，将活性因子直接递送到靶细胞内部，对受体细胞组织发挥有效调控作用，参与生命体的生理和病理过程。与干细胞治疗相比，外泌体具有稳定性高、免疫原性低、可被工程化改造等特点与优势，成为组织损伤非细胞治疗的新策略。
慢性难愈合创面多存在炎症期延长或炎症过度的特点。皮肤损伤后中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞会迁移到创面，并分泌大量的促炎细胞因子、蛋白酶和ROS等，进入创面愈合的炎症期。炎症是免疫系统针对各种对活组织的损伤、感染或其他损害所作出的正常反应。皮肤创面愈合早期的免疫应答反应对于清除病原体至关重要。但是，持续的炎症反应会导致慢性皮肤创面形成。功能失调的免疫细胞，如巨噬细胞会促使愈合进程停留在炎症期，导致创面难以愈合。抑制炎症反应并减少在炎症反应过程中产生的促炎细胞因子对改善皮肤创面的免疫微环境具有重要意义。
已有研究证明外泌体具有调节免疫、免疫抑制的作用，例如人脐带血间充质干细胞外泌体可以调节巨噬细胞的极化，促使巨噬细胞向抗炎表型M2型分化，减轻了炎症反应并促进了创面愈合。近年来，随着对外泌体研究不断深入，其应用已经涉及医学基础、免疫治疗等领域。工程化外泌体通过对天然外泌体进行生物工程技术处理后，赋予或者增强天然外泌体的生物功能，以达到治疗目的。而现有应用中，外泌体的功能多取决于其所来源的细胞类型，尚无工程化抗炎外泌体用于促进皮肤创面愈合。因此，有必要提供一种抗炎工程化外泌体的制备方法，增强外泌体的促修复作用，进一步加快创面愈合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工程化抗炎外泌体的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种工程化抗炎外泌体的制备方法，其包括以下步骤：
从脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞沉淀，然后加入红细胞裂解液去除残留红细胞，离心后用完全培养基重悬，再进行传代培养；
将传代培养的脂肪间充质干细胞加入新鲜的完全培养基，并添加脂多糖进行诱导，得到脂肪间充质干细胞炎症模型；
将脂肪间充质干细胞炎症模型用PBS缓冲液润洗，并加入基础培养基进行培养后，再取其富集外泌体的上清液；
利用差速离心法对上清液进行处理后，再经过超滤浓缩、过滤及超速离心处理，得到抗炎外泌体。
优选地，从脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞沉淀的步骤，具体包括：
取皮下脂肪组织，去除血管、结缔组织，用PBS缓冲液冲洗、离心后，再经过胶原酶I消化、过滤、离心处理，得到脂肪间充质干细胞沉淀。
优选地，所述完全培养基至少包括基础培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素。
优选地，所述基础培养基为DMEM基础培养基。
优选地，所述脂多糖的终浓度为0.05-0.15μg/mL。
本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述工程化抗炎外泌体制备方法制得的抗炎外泌体。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述抗炎外泌体在制备用于治疗皮肤创面的药物中的应用。
本发明提供的工程化抗炎外泌体的制备方法，可以成功从脂肪组织提取脂肪间充质干细胞，并建立脂肪间充质干细胞炎症模型，以及成功提取了抗炎外泌体；该抗炎外泌体较非工程化外泌体具有更好的抗炎特性，可显著促进皮肤创面愈合，其弥补了目前抗炎外泌体治疗皮肤创面的技术和应用空白，为皮肤创面治疗提供新思路。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种工程化抗炎外泌体的制备方法的流程示意图。
图2为本发明实施例利用NTA检测抗炎外泌体大小的结果示意图。
图3为本发明实施例利用TEM检测抗炎外泌体形态的结果示意图。
图4为本发明实施例利用RT-PCR检测IL-10、TGF-β、IL-6和TNF-α表达量的结果示意图。
图5为本发明实施例制得的抗炎外泌体进行小鼠试验实验组、对照组的结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的一个实施例中，提供了一种工程化抗炎外泌体的制备方法，其包括以下步骤：
S1、从脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞沉淀，然后加入红细胞裂解液去除残留红细胞，离心后用完全培养基重悬，再进行传代培养：
S2、将传代培养的脂肪间充质干细胞加入新鲜的完全培养基，并添加脂多糖进行诱导，得到脂肪间充质干细胞炎症模型；
S3、将脂肪间充质干细胞炎症模型用PBS缓冲液润洗，并加入基础培养基进行培养后，再取其富集外泌体的上清液；
S4、利用差速离心法对上清液进行处理后，再经过超滤浓缩、过滤及超速离心处理，得到抗炎外泌体。
本发明实施例提供的方法可以从来源丰富的脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的脂肪间充质干细胞，其具有延缓衰老、组织细胞修复、器官替代治疗等功能，可用于提取外泌体。
在本发明的一个优选实施例中，上述从脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞沉淀的步骤，具体包括：
S11、取皮下脂肪组织，去除血管、结缔组织，用PBS缓冲液冲洗、离心后，再经过胶原酶I消化、过滤、离心处理，得到脂肪间充质干细胞沉淀。
具体的，在步骤S1中，取外科手术患者皮下脂肪组织，去除血管、结缔组织，用PBS缓冲液冲洗、离心后用胶原酶I消化、过滤、离心得到脂肪间充质干细胞沉淀；然后，加入红细胞裂解液去除残留红细胞，离心后用完全培养基重悬，转移到细胞培养瓶中传代培养。
在步骤S2中，脂多糖(LPS)是一种运用广泛的炎症剂，是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分。待脂肪间充质干细胞生长覆盖瓶底70％-80％时，弃去旧培养基，加入新鲜完全培养基及脂多糖。放入5％CO2、37℃细胞培养箱诱导10-14h，即可得脂肪间充质干细胞炎症模型。
在步骤S3和S4中，脂肪间充质干细胞炎症模型可用PBS缓冲液润洗2-3次后加入基础培养基，放入细胞培养箱中培养10-14h后，取其富集外泌体的上清液；然后利用差速离心法去除上清液中的死细胞、细胞碎片及其他杂质，再经过超滤浓缩、过滤及超速离心得到高浓度、高纯度的抗炎外泌体。
在本发明的一个优选实施例中，上述完全培养基至少包括基础培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素；具体的，完全培养基可由89％基础培养基、10％胎牛血清以及1％青霉素/链霉素组成。
在本发明的一个优选实施例中，上述基础培养基为DMEM基础培养基，但不限于此。
在本发明的一个优选实施例中，上述脂多糖的终浓度为0.05-0.15μg/mL。
在本发明的另一个实施例中，还提供了一种上述的抗炎外泌体在制备用于治疗皮肤创面的药物中的应用。
具体的，可以用PBS缓冲液将上述抗炎外泌体重悬为1μg/μL，在距创缘约1mm处等距皮下多点注射外泌体悬液，每次注射100μL，注射时尽量靠近创面伤口床。
下述实施例为本发明在实际应用中的部分具体实施案例，但不局限于此。
实施例1：如附图1所示，该实施例提供了一种工程化抗炎外泌体的制备方法，其包括以下步骤：
(1)脂肪间充质干细胞的分离及培养：取外科手术患者皮下脂肪组织，置于培养皿中，用10mL灭菌一次性注射器抽取无菌PBS缓冲液冲洗脂肪组织至无血色，用无菌剪刀尽量去除血管和结缔组织后，充分剪碎，转移至离心管中，加入2倍体积PBS缓冲液，2000rpm离心10min。将脂肪转移至新的离心管，加入等体积0.1％胶原酶I，37℃细胞培养箱中消化60min，至糊状。加入等体积完全培养基(由89％基础培养基、10％胎牛血清以及1％青霉素/链霉素组成)终止消化，用200目筛网将液体过滤，收集滤液并以2000rpm离心10min，离心后弃上清，按1：3体积比例向细胞沉淀加入红细胞裂解液，用移液枪轻轻吹打混匀，常温裂解2min后以1000rpm离心5min。离心后收集沉淀部分，加入适量的完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液移入细胞培养瓶中，显微镜下观察到脂肪间充质干细胞呈梭形、纺锤形或多角形。放入细胞培养箱，5％CO2、37℃条件下培养。每隔3天换液1次，待细胞生长至融合度达80％-89％时，即可进行胰酶消化传代处理。
(2)脂肪间充质干细胞炎症模型的建立：待脂肪间充质干细胞传代至4-5代，生长覆盖瓶底70％-80％时，弃去旧培养基，移液枪加入新鲜完全培养基及0.1μg/mL的LPS，轻轻摇匀后放入5％CO2、37℃细胞培养箱诱导12h。
(3)抗炎外泌体的提取：利用LPS诱导脂肪间充质干细胞炎症模型12h后，从细胞培养箱中取出细胞，弃去培养基，移液枪吸取1mL不含钙、镁离子的PB S缓冲液润洗细胞1-2次后加入DMEM基础培养基，继续放入细胞培养箱培养12h后，移液枪吸出细胞上清液，转移至15mL离心管中，在4℃下300g离心6min，以去除死细胞；取上清液，在4℃下10000g离心30min，以去除细胞碎片及其他杂质；将上清液转移至15mL超滤管(10KD)中，4℃下3500g离心20min，得到浓缩上清液；浓缩上清液经过0.22μm滤膜过滤后，使用超高速离心机4℃下120000g离心90min，弃上清，最终获得高浓度、高纯度的工程化抗炎外泌体沉淀。抗炎外泌体沉淀用PBS缓冲液重悬为1μg/μL的外泌体悬液，于-80℃冰箱储存。
实施例2：该实施例利用纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)检测上述实施例1制得的抗炎外泌体的大小，具体如下：NTA工作原理是在检测时通过光学显微镜收集外泌体的散射光信号，观测一段时间内颗粒在溶液中做布朗运动的影像，并对每一个颗粒进行追踪和分析，再通过爱因斯坦方程式(<X，Y>2＝KBTts/3πηdh，其中，<X，Y>2/ts：扩散系数；T：测量温度；KB：玻尔兹曼常数；η：介质粘度；dh：液体力学直径)计算出抗炎外泌体的流体力学尺寸。检测步骤和现有技术中常规检测步骤相同，结果如图2所示，直径在130nm左右，在外泌体直径范围内。
实施例3：该实施例利用透射电子显微镜(TEM)检测上述实施例1制得的抗炎外泌体的形态，其中，双层囊膜结构是外泌体重要标志之一，透射电子显微镜分辨率可达0.1-0.2nm，可将被观察物体放大至数百万倍，非常适合进行外泌体双层囊膜超微结构观测。具体的检测步骤如下：抗炎外泌体用戊二醛固定：外泌体沉淀用50-100μL的2％PFA重悬，如果是富集的冰冻外泌体，融化并与等量4％PFA混合。取5μL抗炎外泌体悬液滴加到载样铜网上，再用1％戊二醛液滴载样铜网5min后用ddH2O洗2min。外泌体染色：铜网放在50μL草酸双氧铀液滴5min，再放在甲基纤维素-UA液滴上10min，铜网常温干燥数分钟后80kV下检测成像。获得成像结果，如图3所示，透射电子显微镜下的上述制得的抗炎外泌体呈均匀、球形的膜囊泡。
实施例4：该实施例利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对上述实施例1制得的外泌体抗炎功能进行检测，通过Trizol试剂处理提取出总mRNA，并使用cDNA合成试剂盒根据制造商的方案逆转录成cDNA。然后进行RT-PCR，得到抗炎细胞因子IL-10和TGF-β及促炎细胞因子IL-6和TNF-α的基因表达情况差异。
具体操作流程如下：
1、诱导巨噬细胞：THP-1细胞为悬浮细胞，是人外周血的单核细胞系，具有分化为多种巨噬细胞的能力。将THP-1细胞分成两组，以3×105-6×105/mL的密度分别培养于T25培养瓶中，每组加入3mL完全培养基(89％RPMI-1640+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素)及160ng/mL的PMA，放入5％CO2、37℃细胞培养箱，诱导悬浮的THP-1细胞分化成贴壁的巨噬细胞。3天后，取出诱导完毕的巨噬细胞，弃去旧培养基，用移液枪吸取1mL的PBS至含有巨噬细胞的培养瓶中，轻轻润洗后倒掉PBS，重复3次，以完全去除非贴壁细胞和旧培养基。
2、分组处理巨噬细胞：实验组巨噬细胞加入上述提取的抗炎外泌体(20μg/mL)及新鲜完全培养基(89％RPMI-1640+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素)，空白对照组只加等体积的完全培养基(89％RPMI-1640+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素)，于5％CO2、37℃细胞培养箱培养。48h后去除旧培养基，移液枪吸1mL的PBS润洗3次后，加入1mL胰酶消化贴壁细胞2min，待镜下观察到细胞变圆变亮，用1mL的完全培养基终止消化，并用移液枪吹打细胞贴壁的培养瓶底部，确保所有细胞均消化为细胞悬液。将细胞悬液转移到新的离心管中，以300g离心3min，弃上清，得到的细胞沉淀可进行RT-PCR。
3、RT-PCR实验过程：
3.1、RNA提取：细胞沉淀中加入1mL的Trizol试剂，反复吹打，室温裂解10min，将裂解液转移至1.5mLEP管中，每个样本加入200μL氯仿，涡旋振荡器振荡，使Trizol和氯仿充分混匀，静止1-2分钟使溶液重新分层。4℃，12000rpm的条件下离心15min，离心后液体分为三层，上层为含有RNA的氯仿，中间白色层是蛋白和细胞碎片，下层为Trizol试剂。用移液枪小心转移上层RNA至新的1.5mLEP管中，再加入500μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min后4℃，12000rpm离心10min，可得到位于离心管底部的白色RNA沉淀。弃去上清液，轻柔加入1mL75％乙醇，上下颠倒洗去残留在RNA沉淀表面的异丙醇后4℃，7500rpm离心10min。小心吸去上清液，将EP管倒扣在吸水纸上，室温晾干至RNA沉淀从白色变成透明。加入40μL的DEPC水，重悬RNA沉淀后即可进行下一步。
3.2、测RNA浓度：
打开酶标仪后，纸巾擦拭盖子和样本板，每个样本孔上滴2μL的DD水，干净的纸擦掉后在第一个孔加入2μL的DD水作为对照，其他孔加2μL的RNA样本，进行检测。测试结果OD260/280在1.8-2.0范围内表明所提RNA纯度较高，越接近2说明纯度越高。
3.3、RNA逆转录合成cDNA：
使用逆转录试剂盒，将500ng的RNA逆转录为cDNA，全程冰上操作，每个反应体系20μL，如下表1所示：
表1
将配好的反应体系放入PCR仪中，设置反应程序为：37℃45min，85℃5min，4℃维持。
3.4、RT-PCR反应：
将逆转录反应得到的cDNA，配制如下表2的20μL的反应体系，全程冰上操作。
表2
上述反应体系混匀后，设置RT-PCR仪反应程序：95℃2min；Cycle 35，94℃5s，60℃1min；95℃15s，60℃1min，95℃5s。用GAPDH定量各mRN A的相对水平，并以相对比率表达。
上述实验结果如图4所示，从图中可以看出，本发明实施例所提取的抗炎外泌体可显著减少巨噬细胞促炎细胞因子的表达，增加抗炎细胞因子的表达，从而验证了本发明实施例所提取的抗炎外泌体具有较好的抗炎特性。
实施例5：该实施例进行了小鼠创面模型皮下注射外泌体的实验，具体如下：
将6只6-8周小鼠分成2组：实验组及对照组，1mL一次性注射器抽取0.4mL戊巴比妥钠，一只手抓住小鼠的尾巴向后拉，另一只手的大拇指和食指抓小鼠的头背部皮毛，腹腔向上，在下腹部离腹白线约0.5cm处将穿刺针刺入腹腔，腹腔麻醉小鼠后，用剃毛器剃去小鼠背部毛发，并使用脱毛膏于背部进行脱毛处理至无毛。在小鼠脊柱旁腰背部，左右对称，制备直径8mm全层皮肤缺损创面，记第0天。创面第1、3、5天，实验组小鼠距创缘约1mm处上下左右对称4个点注射上述外泌体悬液(1μg/μL)，每次注射100μL，对照组小鼠同样在创面周围对称注射等体积(100μL)的PBS，并对两组小鼠创面拍照。第7天对小鼠创面拍照，对比创面面积、愈合速度。上述实验结果如图5所示，从图中可以看出，实验组小鼠创面愈合速度明显快于对照组，其表明本发明实施例所制得的抗炎外泌体可显著促进创面愈合。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容。
Claims (7)
1.一种工程化抗炎外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
从脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞沉淀，然后加入红细胞裂解液去除残留红细胞，离心后用完全培养基重悬，再进行传代培养；
将传代培养的脂肪间充质干细胞加入新鲜的完全培养基，并添加脂多糖进行诱导，得到脂肪间充质干细胞炎症模型；
将脂肪间充质干细胞炎症模型用PBS缓冲液润洗，并加入基础培养基进行培养后，再取其富集外泌体的上清液；
利用差速离心法对上清液进行处理后，再经过超滤浓缩、过滤及超速离心处理，得到抗炎外泌体。
2.根据权利要求1所述的工程化抗炎外泌体的制备方法，其特征在于，从脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞沉淀的步骤，具体包括：
取皮下脂肪组织，去除血管、结缔组织，用PBS缓冲液冲洗、离心后，再经过胶原酶I消化、过滤、离心处理，得到脂肪间充质干细胞沉淀。
3.根据权利要求1所述的工程化抗炎外泌体的制备方法，其特征在于，所述完全培养基至少包括基础培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素。
4.根据权利要求3所述的工程化抗炎外泌体的制备方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM基础培养基。
5.根据权利要求1所述的工程化抗炎外泌体的制备方法，其特征在于，所述脂多糖的终浓度为0.05-0.15μg/mL。
6.一种采用权利要求1-5中任一项所述的工程化抗炎外泌体的制备方法制得的抗炎外泌体。
7.一种如权利要求6所述的抗炎外泌体在制备用于治疗皮肤创面的药物中的应用。
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