CN114159549A - 分泌型Clusterin在制备心梗后心肌细胞再生的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分泌型Clusterin在制备心梗后心肌细胞再生的药物中的应用，属于生物医药研究领域，本发明的分泌型Clusterin(凝聚素)不仅可以改善心肌梗死后心脏功能，同时具有促进心肌细胞增殖的效应，促进心肌梗死后心肌再生和心脏保护，为临床中心肌梗死患者的治疗提供新的治疗策略。

Description

分泌型Clusterin在制备心梗后心肌细胞再生的药物中的 应用

技术领域

本发明属于生物医药研究领域，具体涉及一种分泌型Clusterin在制备心梗后心肌细胞再生的药物中的应用。

背景技术

急性心肌梗死是临床上常见的急危重症，随着老龄化，生活节奏的加快，饮食习惯的改变以及社会、心理等因素的影响，急性心肌梗死发病率逐年升高，且死亡率高，严重危害人类健康。心肌梗死后心肌细胞大量坏死,坏死心肌由瘢痕组织取代，心肌收缩功能下降，最终演变为心力衰竭，导致患者生活质量急剧下降，甚至死亡。虽然目前常规治疗方法如溶栓、经皮冠脉介入术或冠脉旁路搭桥术可使闭塞血管再通，药物治疗可缓解心肌重构，但不能从根本上修复已坏死的心肌。要实现对心肌梗死后心衰的预防，最根本的策略是应用有收缩能力的心肌细胞代替坏死的心肌，即通过心肌再生弥补坏死的心肌细胞。心肌细胞增殖是内源性心肌再生的主要来源，但哺乳动物成年心肌细胞增殖微弱，如何促进心肌增殖是目前面临的重要科学问题。近年来研究人员试图采用多种策略诱导成年哺乳动物内源性心肌细胞增殖。Srivastava等人通过过表达四种细胞周期相关基因CDK1,CDK4,cyclinB1和cyclin D1，可以成功促进成年小鼠心肌细胞增殖。Hirose等人研究发现，小鼠出生后不久甲状腺激素含量增加50倍，通过抑制甲状腺激素合成可以促进心肌细胞增殖。但上述促心肌细胞增殖策略因存在技术问题、不良反应的原因无法实现临床转化，因此寻找新的促心肌细胞增殖措施显得尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种分泌型Clusterin在制备心梗后心肌细胞再生的药物中的应用；本发明的目的之二在于提供一种药物制剂，本发明的目的之三在于提供一种药物制剂在制备心梗后心肌细胞再生的药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、分泌型Clusterin在制备心梗后促进心肌细胞再生的药物中的应用，所述分泌型Clusterin的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选的技术方案之一，所述促进心肌细胞再生具体为：

a、促进心肌梗死后心肌细胞增殖；

b、促进心肌梗死后心肌血管再生；

c、抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡；

d、抑制心肌梗死后心肌细胞纤维化；

e、改善心梗后心脏功能的恢复。

作为优选的技术方案之一，所述促进心肌细胞再生的具体机制为：分泌型Clusterin促进NF-κB下游靶基因CCL2的转录和翻译。

2、一种药物制剂，所述药物制剂包括上述分泌型Clusterin和一种或多种药学上可以接受的载体或辅料。

3、所述药物制剂在制备心梗后心肌细胞再生的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明所提供的分泌型Clusterin蛋白不仅改善心肌梗死后心脏功能，同时促进心肌细胞增殖。本发明还对分泌型Clusterin蛋白促进心肌细胞增殖信号机制作了研究，结果表明在外源性分泌型Clusterin蛋白刺激心肌细胞后通过进一步促进NF-κB(p65)核转位，并促进其下游靶基因CCL2的转录核翻译，且通过促进Clusterin与CCL2二者间蛋白互作进而持续激活下游JAK2/STAT3信号通路，从而发挥促心肌细胞增殖效应，对临床急性心肌梗死的治疗提供新的策略。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为不同浓度梯度分泌型Clusterin重组蛋白对心肌细胞增殖的影响，细胞增殖指标分别为Ki67、PH3、EDU。

图2为AAV2/9-Clusterin心肌注射2周后对心肌梗死后心肌细胞增殖的影响。

图3为AAV2/9-Clusterin心肌注射2周后对心肌梗死后心肌细胞存活的影响。

图4为AAV2/9-Clusterin心肌注射2周后对心肌梗死后血管新生的影响。

图5为AAV2/9-Clusterin心肌注射4周后对心肌梗死后心肌纤维化的影响。

图6为AAV2/9-Clusterin心肌注射2周、4周后对心肌梗死后心脏功能的影响。

图7为分泌型Clusterin重组蛋白处理心肌细胞对NF-κB(p65)核转位的影响。

图8为分泌型Clusterin重组蛋白处理心肌细胞对NF-κB(p65)核/质蛋白分布的影响。

图9为分泌型Clusterin重组蛋白处理心肌细胞对NF-κB(p65)下游靶基因CCL2表达水平的影响，图A和B分别显示分泌型Clusterin重组蛋白处理心肌细胞后转录组测序结果GO富集分析和KEGG信号通路分析；图C显示NF-κB信号通路富集分子的FPKM值；图D显示采用QT-RCR方法验证分泌型Clusterin重组蛋白处理心肌细胞后CCL2在转录水平的变化。

图10为NF-κB(p65)抑制剂JSH-23预处理后再给予Clusterin重组蛋白处理对心肌细胞增殖比率的影响。

图11为免疫荧光技术显示分泌型Clusterin与CCL2存在共定位。

图12、13为免疫共沉淀(CO-IP)技术显示分泌型Clusterin与CCL2二者间存在蛋白相互作用。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1

不同浓度分泌型Clusterin重组蛋白对心肌细胞增殖的影响

1、原代心肌细胞提取

取新生SD大鼠(0-1d)心脏置于预冷的PBS缓冲液中清洗3次，用眼科剪将心室剪成约1mm³大小碎块，0.125％胰酶室温消化，第一次消化上清弃去，再以0.08％胶原酶II重复消化约5-6次直至组织被消化尽完全，每次约5min，消化后上清用含10％FBS的DMEM完全培养基终止消化液。200目筛网过滤，300×g离心5min，DMEM完全培养基混悬细胞沉淀，差速贴壁1h。取差速贴壁后细胞悬液0.4％台盼蓝染色并进行细胞计数。以2×10⁵/mL密度接种细胞，置于5％CO₂、饱和湿度37℃孵箱培养。贴壁24小时给予细胞换液进行后续心肌细胞增殖实验。

2、Clusterin重组蛋白的获得

设计引物(F：5'CGCGGATCCATGAAGATTCTCCTGCTGT3'，R：5'CCCAAGCTTTTCCGCACGGCTTTTCCTGC3')，在上下游引物的5’端分别加入BamHI和HindIII酶切位点，PCR扩增Clusterin基因的编码序列，回收克隆产物，连接至pMD19-T，转化至DH5α，筛选阳性克隆，并进行测序验证。将测序正确的菌种进行扩大培养，培养后离心收集菌体，提取质粒。用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切带有目的基因的pMD19-T质粒和表达载体pET-32a(+)质粒，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果并分别回收酶切后的目的基因和pET-32a(+)载体。将酶切后的目的片段同酶切后的pET-32a(+)用T4DNA连接酶进行连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，用含Amp的LB平板进行筛选。经T7通用引物和特异引物进行菌落PCR验证后，用含有100μg/mL Amp的LB培养基进行扩大培养，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀达到0.6(约2.5h)。加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导目的蛋白的表达，16℃、110rpm培养20-24h，8000rpm离心5min收集菌体；按照25mL菌液加入1mL溶菌缓冲液的比例加入适量的溶菌缓冲液，冰浴条件下超声波破碎，破碎条件为：工作1s，间隔2s，功率300w，总超声时间30min，可依据菌体破碎效果相应地延长超声时间；菌体破碎完成后，4℃、12000rpm离心10min，收集上清，将上清用0.45μm的滤膜进行过滤，以去除上清中残留的大颗粒物质；将获得的上清液加入含有cOmplete His-Tag Purification Resin重悬树脂的Ni柱，用特定咪唑浓度梯度的缓冲液(50mM NaH2PO4，pH8.0；300mM NaCl；0～250mM咪唑)洗脱His标签蛋白；获得的融合蛋白液经SDS-PAGE检测后，于-80℃保存，备用。分泌型Clusterin蛋白的蛋白氨基酸序列如下SEQ ID NO：1所示。

3、心肌细胞增殖实验

更换1％FBS-DMEM培养基后加入不同浓度梯度(25、50、100、500ng/mL)的Clusterin重组蛋白，处理24小时后进行细胞固定及细胞增殖相关指标(Ki67、PH3、EDU)免疫荧光染色。操作步骤如下：

(1)固定细胞：NRVM处理24小时后，弃去原培养基，PBS清洗3次后，以4％多聚甲醛室温固定20mim；

(2)PBS清洗3次，5min/次；

(3)透膜、封闭处理：用0.05％Triton X-100/1％BSA透膜、封闭细胞30min；

(4)PBS清洗3次，5min/次；

(5)孵育一抗：心肌肌钙蛋白TnI+增殖指标(Ki67、PH3)，4℃孵育过夜；

(6)PBS清洗3次，5min/次；

(7)用PBS按1:200比例稀释二抗(488/555)，37℃孵育1小时；

(8)二抗孵育的最后10min将染核液DAPI加入进行室温孵育；

(9)PBS清洗3次，5min/次；

(10)将玻片置于荧光显微镜下观察；

(11)荧光抗淬灭剂及指甲油封片。

结果如图1所示，体外实验中，从三个细胞增殖指标(Ki67、PH3、EDU)可以看出，Clusterin重组蛋白处理24小时后可以呈浓度依赖性促进心肌细胞增殖。

实施例2

AAV2/9-Clusterin对小鼠心肌梗死后心肌再生的影响

建立小鼠心肌梗死模型：选取8-10周龄20-25g的雄性C57BL/6J小鼠，异氟烷气体麻醉小鼠，将麻醉号的小鼠仰卧位固定于37℃恒温手术台，给小鼠颈部及胸部进行清洁脱毛，然后进行经口气管插管并调节呼吸机参数，胸前皮肤消毒后开胸，在手术显微镜下于左心耳下缘约1～2mm处用7-0手术线结扎左冠状动脉前降支，根据心电图ST段抬高和心肌组织颜色变苍白确定心肌梗死模型成功。

构建腺相关病毒AAV2/9-Clusterin过表达载体和AAV2/9-Clusterin干扰载体：具体包装纯化步骤如下：

首先，准备质粒。把外源基因Clu(Gene ID 12759)克隆进合适的载体。构建好的病毒载体和pHelper(携带腺病毒来源的基因)和pAAV-RC(携带AAV复制和衣壳基因)质粒进行大量抽提。

接下来，培养AAV-293细胞，接种AAV-293细胞于10cm皿，汇合度达到70～80％时进行细胞转染。

第三步，制备转染试剂和质粒的复合物进行细胞转染。a.将待转染的病毒载体质粒pHelper：pAAV-RC：穿梭质粒＝1：1：1溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min。b.将Obio转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min。c.将Obio转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和Obio转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。d.取出细胞皿，将上面配好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养板中。e.转染6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10ml新鲜完全培养基培养。

第四步，病毒收获及纯化。1)转染72h后，使用细胞刮将细胞刮下，并收集到离心管，同时收集细胞上清液至离心管。2)离心将上清过滤，细胞沉淀振荡器中振散后用上清液重悬。3)取细胞裂解液在液氮浴，37℃水浴中反复冻融。4)将冻融过的病毒液离心后过滤至离心管中。5)将过滤过的病毒液转入超速离心管中离心。6)超离后弃大部分上清，加入核酸酶消化去除残留的质粒DNA，37℃孵育。7)离心后过滤至超离管中。8)加入碘克沙醇梯度液超速离心。9)使用自制的针头收集病毒层。10)超滤去除梯度液残留。

最后，进行病毒滴度测定。目前测定AAV的滴度通过定量PCR检测基因组中AAV载体的基因组拷贝数来测定AAV的病毒颗粒数。1)准备样品和标准品，梯度稀释标准品质粒和待测样品至原浓度10^-5，10^-6，10^-7，10^-8次；2)根据反应数(X)计算反应总管体积(每个梯度做两个复孔，每10个反应多准备1个)：3)在每个反应孔中加入反应液15μl，然后加入5μl的模板；4)上机，退火温度设为60℃，按照标准操作得到Ct值并计算AAV样品中的拷贝数。

对心肌梗死模型小鼠进行心肌梗死边缘区腺相关病毒将上述包装构建好的AAV2/9-Clusterin过表达载体(pAAV-CMV-Clu-3Flag-P2A-EGFP)和AAV2/9-Clusterin干扰载体(pAAV-CMV-bGlobin-EGFP-U6-shRNA(Clu))心肌内注射，以30g针头小动物微量注射器分3-5个点进行注射，每个点5-10微升，病毒滴度5×10¹⁰v/g。2周后取材进行心肌增殖指标(Ki67/PH3)免疫荧光组织染色。操作步骤如下：

(1)心脏标本取材

将需要取材的小鼠麻醉后脱颈处理，立即用剪刀剪开小鼠胸腔部分皮肤和皮下组织肌肉层，镊子撑开胸腔，用PBS冲洗心脏内血液，将心脏组织见下后置于预冷的PBS溶液中，修剪流出道和黏连组织。用于病理组织染色的心脏标本随后置于4％的多聚甲醛中固定。

(2)心脏组织石蜡包埋及切片

将固定号的心脏组织置于包埋盒中，依次按照75％、85％、95％和无水乙醇中进行脱水，随后二甲苯中透明2次，最后置于60℃的液体石蜡中。在Leica包埋机下将心脏组织样本利用石蜡固定于包埋盒中，包埋号的组织块置于冰冻台冷冻半小时。将冰冻号的蜡块固定于Leica切片机固定槽中，修片后调整切片机厚度4μm进行组织切片。将切下的组织片置于展片太中进行展片，约2-3分钟，以表面的褶皱消失为标准。用防脱载玻片捞出烤干后进行后续免疫荧光组织染色实验。

(3)免疫荧光组织染色

首先将切好的组织片以68℃烤片1-2小时；将载玻片依次放入3缸二甲苯浸泡进行脱蜡处理；随后依次放入无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、75％乙醇各3分钟水化，并洗去二甲苯，自来水冲洗5分钟。以柠檬酸钠-EDTA抗原修复液在高压锅中煮沸进行抗原修复20分钟，自然冷却。取出组织载玻片，PBS清洗3次，每次5分钟。封闭：0.1％TritonX-100+BSA室温封闭处理1小时。一抗孵育(TNI+增殖指标Ki67/PH3)，4℃过夜孵育。第二天复温后PBS清洗3次，每次5分钟，然后孵育荧光二抗(488/555)，37℃/1小时。最后10分钟进行DAPI染核处理，荧光显微镜下观察后进行封片、收集图像。

结果如图2所示，2周后心肌梗死后心肌增殖指标显示，与对照组相比，AAV2/9-Clusterin过表达载体组可以有效促进心肌梗死后心肌细胞增殖；AAV2/9-Clusterin干扰载体组抑制心肌梗死后心肌细胞增殖。

实施例3

AAV2/9-Clusterin对小鼠心肌梗死后心肌细胞存活和血管新生的影响

前期动物实验小鼠心肌梗死模型建立及腺相关病毒AAV2/9-Clusterin过表达载体和AAV2/9-Clusterin干扰载体的构建及心肌内注射方法同上(具体参照实施例2)。

TUNEL染色检测细胞凋亡：利用原位脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺末端标记(TUNEL)细胞凋亡探测盒(购自罗氏生物科技有限公司)，分别对心梗后不同处理组的心脏切片，然后将组织切片置于65℃环境中加热水化，之后用二甲苯清洗浸泡脱蜡，再依次用体积分数为100％，95％，80％，70％的酒精进行再水化，然后将切片置于含有20μg/mL蛋白激酶K的溶液中，在37℃条件下处理60分钟后将切片置于质量分数为1％的三硝基甲苯X-100中处理8分钟，然后将切片用PBS溶液冲洗两次，最后加入50μL的TUNEL反应混合物，将切片在37℃避光的水浴箱中孵育60分钟，DAPI进行细胞核染色，采用双盲法进行形态学观察并采集图像，在高倍镜下每张切片任选5个不重叠视野，采用Nikon图像分析软件自动计数TNEL阳性细胞核机细胞核总量。凋亡指数＝(TUNEL阳性细胞核/细胞核总数)×100％。由图3可知，与对照组相比，AAV2/9-Clusterin过表达载体组可以有效抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡；AAV2/9-Clusterin干扰载体组加重心肌梗死后心肌细胞凋亡。

血管新生指标CD31免疫荧光染色：首先将切好的组织片以68℃烤片1-2小时；将载玻片依次放入3缸二甲苯浸泡进行脱蜡处理；随后依次放入无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、75％乙醇各3分钟水化，并洗去二甲苯，自来水冲洗5分钟。以柠檬酸钠-EDTA抗原修复液在高压锅中煮沸进行抗原修复20分钟，自然冷却。取出组织载玻片，PBS清洗3次，每次5分钟。封闭：0.1％TritonX-100+BSA室温封闭处理1小时。一抗孵育(CD31)，4℃过夜孵育。第二天复温后PBS清洗3次，每次5分钟，然后孵育荧光二抗(488)，37℃/1小时。最后10分钟进行DAPI染核处理，荧光显微镜下观察后进行封片、收集图像。其结果如图4所示，与对照组相比，AAV2/9-Clusterin过表达载体组可以有效促进心肌梗死后血管新生；AAV2/9-Clusterin干扰载体组抑制心肌梗死后血管新生。

实施例4

AAV/9-Clusterin对小鼠心肌梗死后心肌纤维化和心功能的影响

前期动物实验小鼠心肌梗死模型建立及腺相关病毒AAV2/9-Clusterin过表达载体和AAV2/9-Clusterin干扰载体的构建及心肌内注射方法同上(具体参照实施例2)。

Masson病理组织染色检测心梗后心肌纤维化：使用改良Masson三色染色试剂盒(具体购自索莱宝试剂公司)，具体步骤如下：切好的心脏组织切片68℃烤片1-2小时，常规脱蜡至水；切片入Bouin液，于37℃过夜进行媒染，然后流水冲洗至切片上的黄色消失；天青石蓝染液滴染2-3分钟，稍水洗；Mayer苏木素染色液滴染2-3分钟，稍水洗；酸性乙醇分化液分化数秒，流水冲洗10分钟；品红染色液滴染10分钟，蒸馏水稍冲洗；磷钼酸溶液处理约10分钟，倾去上液，切片不用水洗，直接滴入苯胺蓝染液染5分钟；弱酸溶液处理2分钟；95％的乙醇快速脱水；无水乙醇脱水3次，每次5-10秒；二甲苯透明3次，每次1-2分钟；中性树胶封固。结果如图5所示，与对照组相比，AAV2/9-Clusterin过表达载体组可以有效抑制心肌梗死后心肌纤维化程度；AAV2/9-Clusterin干扰载体组心肌梗死后心肌纤维化程度加剧。

小鼠超声心动图检测：将实验小鼠麻醉后固定于操作板上，使用760MHz的超声探头，测定左室长轴切面情况，然后根据超声检测结果计算左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末容积(LVEDV)、左心室收缩末容积(LVESV)，每只小鼠分别测定3次，取其平均值并计算标准差，其结果如图6所示，与对照组相比，AAV2/9-Clusterin过表达载体组可以有效改善心肌梗死小鼠心功能；AAV2/9-Clusterin干扰载体组抑制心肌梗死后心功能的恢复。

实施例5

Clusterin对心肌细胞NF-κB(p65)核转位及其下游靶基因CCL2的调控及其进一步促心肌增殖的信号机制研究

1、Clusterin对心肌细胞NF-κB(p65)核转位影响

采用重组蛋白Clusterin处理心肌细胞30分钟后进行细胞固定及免疫荧光染色，操作步骤如下：

(1)固定细胞：NRVM处理30分钟后，弃去原培养基，PBS清洗3次后，以4％多聚甲醛室温固定20mim；

(2)PBS清洗3次，5min/次；

(3)透膜、封闭处理：用0.05％Triton X-100/1％BSA透膜、封闭细胞30min；

(4)PBS清洗3次，5min/次；

(5)孵育一抗：心肌肌钙蛋白TnI+NF-κB(p65)，4℃孵育过夜；

(6)PBS清洗3次，5min/次；

(7)用PBS按1:200比例稀释二抗(488/555)，37℃孵育1小时；

(8)二抗孵育的最后10min将染核液DAPI加入进行室温孵育；

(9)PBS清洗3次，5min/次；

(10)将玻片置于荧光显微镜下观察。

(11)荧光抗淬灭剂及指甲油封片。

其结果如图7所示，Clusterin处理心肌细胞后NF-κB(p65)入核增加，提示Clusterin可以促进NF-κB(p65)核转位。

2、Clusterin对心肌细胞核/质蛋白NF-κB(p65)分布的影响

Clusterin重组蛋白处理心肌细胞30分钟后采用碧云天细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒进行心肌细胞核/质蛋白分离提取，具体操作步骤如下：

(1)NRVM处理30分钟后，弃去原培养基，PBS清洗2次，用细胞刮刮夏细胞，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用；

(2)每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A；

(3)最高速剧烈Vortex涡旋震荡5秒，把细胞沉淀完全悬浮并散开；

(4)冰浴10-15分钟；

(5)加入细胞浆蛋白抽提试剂B10微升。最高速剧烈Vortex涡旋震荡5秒，冰浴1分钟；

(6)最高速剧烈Vortex涡旋震荡5秒，4℃12000-16000g离心5分钟；

(7)立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白(注意：千万不要触及沉淀)；

(8)对于沉淀，完全吸尽残余上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂(注意：不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染)；

(9)最高速剧烈Vortex涡旋震荡15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散啊开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex涡旋震荡15-30秒，共30分钟；

(10)4℃12000-16000g离心10分钟；

(11)立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可立即使用，也可以-80℃冻存，择期进行SDS-PAGE电泳。

其结果如图8所示，Clusterin处理心肌细胞后细胞核内NF-κB(p65)分布增加，胞浆内分布减少，提示Clusterin可以促进NF-κB(p65)核转位。

3、Clusterin通过活化NF-κB(p65)调控下游靶基因CCL2的表达

具体作用机制筛选采用转录组学测序和荧光定量PCR实验方法。

采用Clusterin重组蛋白处理乳鼠心肌细胞24小时后，转录组学测序KEGG-Pathway分析显示：NF-κB信号通路变化最为明显；且CCL2在NF-κB信号通路中富集最为显著，并且在QT-PCR进一步印证了此结果。如图9中A～D所示，转录组学测序KEGG-pathway分析结果显示，Clusterin重组蛋白处理心肌细胞后NF-κB(p65)活化增强，QT-PCR提示Clusterin处理后心肌细胞CCL2表达水平明显升高。应用NF-κB抑制剂(JSH-23)干扰NF-κB(p65)信号通路后，Clusterin促心肌细胞增殖能力减弱，同时伴有CCL2的表达降低，如图10所示，给予N F-κB抑制剂(JSH-23)预处理后再予以Clusterin重组蛋白处理心肌细胞，细胞增殖指标Ki67免疫荧光染色指标显示，心肌细胞增殖比率降低。上述结果进一步提示Clusterin可能通过活化NF-κB(p65)信号通路上调CCL2的表达发挥促进心肌细胞增殖效应。

4、Clusterin与CCL2的蛋白间相互作用研究

通过免疫荧光共定位及免疫共沉淀(CO-IP)技术发现，Clusterin与CCL2蛋白之间存在相互作用。

免疫荧光共定位：具体步骤如下：

(1)固定细胞：NRVM处理24小时后，弃去原培养基，PBS清洗3次后，以4％多聚甲醛室温固定20mim；

(2)PBS清洗3次，5min/次；

(3)透膜、封闭处理：用0.05％Triton X-100/1％BSA透膜、封闭细胞30min；

(4)PBS清洗3次，5min/次；

(5)孵育一抗：心肌肌钙蛋白TnI(鼠抗)、Clusterin一抗(羊抗)+CCL2一抗(兔抗)，4℃孵育过夜；

(6)PBS清洗3次，5min/次；

(7)用PBS按1:200比例稀释二抗(488/555/647)，37℃孵育1小时；

(8)二抗孵育的最后10min将染核液DAPI加入进行室温孵育；

(9)PBS清洗3次，5min/次；

(10)将玻片置于荧光显微镜下观察；

(11)荧光抗淬灭剂及指甲油封片。

其结果如图11所示，心肌细胞Clusterin与CCL2二者间存在亚细胞共定位。

免疫共沉淀(CO-IP)：常规提取细胞总蛋白后，将上清转移至一个新的离心管中，BCA法检测蛋白浓度，留取Input标本。准备Protein A琼脂糖珠，每1ml总蛋白加入100μlProtein A agarose，将预处理过的10μl protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育过夜，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，在4℃以5 000g离心5min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用60μLPBS缓冲液洗3～4次；最后加入30-50μl洗脱液，室温静置15min后加入2×SDS上样缓冲液，沸水煮5min，样品保存至-20℃或直接进行Western blotting及质谱后续实验。其结果如图12、13所示，心肌细胞Clusterin与CCL2二者间存在蛋白相互作用。

综上，表明分泌型Clusterin在体外和在体实验中均有显著的促进心肌细胞增殖效应，其具体促进心肌细胞增殖的机制与NF-κB(p65)核转位及其下游靶基因CCL2的调控，且通过促进Clusterin与CCL2二者间蛋白互作持续激活其下游JAK2/STAT3信号通路发挥促进心肌细胞增殖效应。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军特色医学中心

<120> 分泌型Clusterin在制备心梗后心肌细胞再生的药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Met Lys Thr Leu Leu Leu Phe Val Gly Leu Leu Leu Thr Trp Glu

1 5 10 15

Ser Gly Gln Val Leu Gly Asp Gln Thr Val Ser Asp Asn Glu Leu Gln

20 25 30

Glu Met Ser Asn Gln Gly Ser Lys Tyr Val Asn Lys Glu Ile Gln Asn

35 40 45

Ala Val Asn Gly Val Lys Gln Ile Lys Thr Leu Ile Glu Lys Thr Asn

50 55 60

Glu Glu Arg Lys Thr Leu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Ala Lys Lys Lys

65 70 75 80

Lys Glu Asp Ala Leu Asn Glu Thr Arg Glu Ser Glu Thr Lys Leu Lys

85 90 95

Glu Leu Pro Gly Val Cys Asn Glu Thr Met Met Ala Leu Trp Glu Glu

100 105 110

Cys Lys Pro Cys Leu Lys Gln Thr Cys Met Lys Phe Tyr Ala Arg Val

115 120 125

Cys Arg Ser Gly Ser Gly Leu Val Gly Arg Gln Leu Glu Glu Phe Leu

130 135 140

Asn Gln Ser Ser Pro Phe Tyr Phe Trp Met Asn Gly Asp Arg Ile Asp

145 150 155 160

Ser Leu Leu Glu Asn Asp Arg Gln Gln Thr His Met Leu Asp Val Met

165 170 175

Gln Asp His Phe Ser Arg Ala Ser Ser Ile Ile Asp Glu Leu Phe Gln

180 185 190

Asp Arg Phe Phe Thr Arg Glu Pro Gln Asp Thr Tyr His Tyr Leu Pro

195 200 205

Phe Ser Leu Pro His Arg Arg Pro His Phe Phe Phe Pro Lys Ser Arg

210 215 220

Ile Val Arg Ser Leu Met Pro Phe Ser Pro Tyr Glu Pro Leu Asn Phe

225 230 235 240

His Ala Met Phe Gln Pro Phe Leu Glu Met Ile His Glu Ala Gln Gln

245 250 255

Ala Met Asp Ile His Phe His Ser Pro Ala Phe Gln His Pro Pro Thr

260 265 270

Glu Phe Ile Arg Glu Gly Asp Asp Asp Arg Thr Val Cys Arg Glu Ile

275 280 285

Arg His Asn Ser Thr Gly Cys Leu Arg Met Lys Asp Gln Cys Asp Lys

290 295 300

Cys Arg Glu Ile Leu Ser Val Asp Cys Ser Thr Asn Asn Pro Ser Gln

305 310 315 320

Ala Lys Leu Arg Arg Glu Leu Asp Glu Ser Leu Gln Val Ala Glu Arg

325 330 335

Leu Thr Arg Lys Tyr Asn Glu Leu Leu Lys Ser Tyr Gln Trp Lys Met

340 345 350

Leu Asn Thr Ser Ser Leu Leu Glu Gln Leu Asn Glu Gln Phe Asn Trp

355 360 365

Val Ser Arg Leu Ala Asn Leu Thr Gln Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Leu

370 375 380

Arg Val Thr Thr Val Ala Ser His Thr Ser Asp Ser Asp Val Pro Ser

385 390 395 400

Gly Val Thr Glu Val Val Val Lys Leu Phe Asp Ser Asp Pro Ile Thr

405 410 415

Val Thr Val Pro Val Glu Val Ser Arg Lys Asn Pro Lys Phe Met Glu

420 425 430

Thr Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Glu Tyr Arg Lys Lys His Arg Glu

435 440 445

Glu

Claims (5)

1.分泌型Clusterin在制备心梗后促进心肌细胞再生的药物中的应用，其特征在于，所述分泌型Clusterin的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述促进心肌细胞再生具体为：

a、促进心肌梗死后心肌细胞增殖；

b、促进心肌梗死后心肌血管再生；

c、抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡；

d、抑制心肌梗死后心肌细胞纤维化；

e、改善心梗后心脏功能的恢复。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述促进心肌细胞再生的具体机制为：分泌型Clusterin促进NF-κB下游靶基因CCL2的转录和翻译。

4.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括权利要求1所述的分泌型Clusterin和一种或多种药学上可以接受的载体或辅料。

5.权利要求4所述的药物制剂在制备心梗后心肌细胞再生的药物中的应用。

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