CN113355358B - 一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113355358B
CN113355358B CN202110673143.9A CN202110673143A CN113355358B CN 113355358 B CN113355358 B CN 113355358B CN 202110673143 A CN202110673143 A CN 202110673143A CN 113355358 B CN113355358 B CN 113355358B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
hsa
sequence
associated virus
serum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110673143.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113355358A (zh
Inventor
靳建亮
苗登顺
王嵘
周佳雯
陈海云
谢春凤
朱剑云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Medical University
Original Assignee
Nanjing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Medical University filed Critical Nanjing Medical University
Priority to CN202110673143.9A priority Critical patent/CN113355358B/zh
Publication of CN113355358A publication Critical patent/CN113355358A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113355358B publication Critical patent/CN113355358B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01137—Phosphatidylinositol 3-kinase (2.7.1.137)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法，首先分别设计合成两端带有EcoR I与Hind III两个酶切位点的目的基因片段，构建含有hsa‑mir‑21‑5p的重组穿梭质粒和含有hsa‑miR‑128‑3p及hsa‑miR‑221‑3p串联序列的重组穿梭质粒，然后分别制备过表达hsa‑miR‑21‑5p序列的重组腺相关病毒和过表达hsa‑miR‑128‑3p及hsa‑miR‑221‑3p串联序列的腺相关病毒，等体积混合制成复合剂。经实验证明，该复合剂能靶向PI3KR1，抑制PI3K信号通路，进而减少心肌肥大标志基因ANP和BNP的表达，为防治病理性心肌细胞肥大提供了新的治疗药物。

Description

一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用。
背景技术
病理性心肌细胞肥大(pathological cardiomyocytes hypertrophy,PCH)是心力衰竭的关键风险因素，其受很多因素的调控，尤其是肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统及其主要效应分子血管紧张素II(AngII)。老年个体心脏中Ang II上调，RAAS系统激活是引起心脏衰老的关键机制。衰老相关的病理性心肌细胞肥大(SA-PCH)与RAAS系统活化、心肌纤维化、衰老相关分泌表型(SASP)、心脏功能障碍以及发病率和死亡率增加有关，并且随着衰老成为全球公共卫生日益突出的问题，防治SA-PCH对治疗多种心血管疾病保护老年健康有着重要的意义。
腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，经过病毒包装后可以形成携带有外源插入基因的腺相关病毒的病毒颗粒。由于腺相关病毒的安全性能好和表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。腺相关病毒有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，其中腺相关病毒血清9型对心脏亲和力高，目前已经广泛应用于心脏疾病的靶向基因治疗。
传统的药物和干预措施仅可部分改善临床症状，探索新的临床治疗方法和策略从而抑制甚至逆转病理性心肌细胞肥大逐渐成为心血管领域研究的重要方向。通过构建血清9型腺相关病毒，通过靶向心脏抑制PCH和SA-PCH，具有取材方便、易通过大规模培养细胞获得，腺相关病毒不整合到宿主基因组具有安全可靠性、剂量稳定可控，是治疗心血管疾病的一种理想的基因药物。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法。
技术方案
发明人制备hsa-miR-21-5p DNA序列过表达和hsa-miR-128-3p及hsa-miR-221-3p串联DNA序列过表达的血清9型重组腺相关病毒复合剂，其效应分子主要为hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p，其通过靶向PI3KR1，抑制PI3K信号通路，防治PCH和SA-PCH，具体方案如下：
一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-mir-21-5p序列，以及带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列，分别进行PCR扩增，酶切以后利用琼脂糖凝胶电泳将目的片段所在区域切胶回收，得到hsa-mir-21-5p目的片段和hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联目的片段；
所述hsa-mir-21-5p序列如SEQ ID NO:1所示，hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列如SEQ ID NO:2所示。
(2)将hsa-mir-21-5p目的片段和穿梭质粒pshuttl-CMV各自用限制性内切酶EcoRI和Hind III双酶切，然后将得到的双酶切反应产物混合，进行DNA连接反应，得到含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒，对其进行扩增，提纯；
将hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联目的片段和穿梭质粒pshuttl-CMV各自用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，然后将得到的双酶切反应产物混合，进行DNA连接反应，得到含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒，对其进行扩增，提纯；
(3)将含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV-RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为过表达hsa-mir-21-5p序列的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定；
将含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV-RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为过表达hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定；
(4)将过表达hsa-mir-21-5p序列的血清9型重组腺相关病毒与过表达hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的血清9型重组腺相关病毒等体积混合，得到血清9型重组腺相关病毒复合剂。
进一步，步骤(1)中，带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-mir-21-5p序列的PCR扩增的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步，步骤(1)中，带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的PCR扩增的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。
进一步，步骤(2)中，含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒以及含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒的扩增方法为：将含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒以及含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒分别与感受态细胞混合后，放入42℃的水浴孵育90秒，再迅速放入冰浴孵育2分钟，涂板于选择培养平板上，37℃过夜培养，第二天挑选单克隆菌落，接种于含50mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃过夜扩增培养；随后离心裂解菌液，抽提纯化质粒。
进一步，步骤(4)中，过表达hsa-mir-21-5p序列的血清9型重组腺相关病毒与过表达hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的血清9型重组腺相关病毒的体积比为1:1。
上述方法制得的血清9型重组腺相关病毒复合剂在制备用于防治病理性心肌细胞肥大的药物中的用途。发明人将200μL复合剂通过尾静脉注射感染小鼠心脏，结果显示：经该复合剂处理后，心肌肥大小鼠心脏明显变小，心肌纤维化程度减轻，心肌细胞的横截面积明显变小，靶向蛋白PI3Kp85α和心肌肥大相关蛋白Troponin I、ANP和BNP表达明显下降，以上结果说明该miRNAs过表达的血清9型重组腺相关病毒复合剂能够通过抑制PI3K/Akt信号通路防治小鼠心肌细胞肥大。
一种用于防治病理性心肌细胞肥大的药物，其主要活性成分为上述方法制得的血清9型重组腺相关病毒复合剂。
进一步，所述药物还包含药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体包括稀释剂和赋形剂。
进一步，所述药物剂型为针剂或冻干粉。
本发明的有益效果：本发明成功构建了一种miRNAs过表达的血清9型重组腺相关病毒，该病毒靶向心脏，通过在肥大的心肌细胞内过表达miRNAs，包括has-miR-21-5p、has-miR-128-3p和has-miR-221-3p，靶向PI3KR1，抑制PI3K信号通路，进而减少心肌肥大标志基因ANP和BNP的表达，从而为防治病理性心肌细胞肥大和衰老相关的病理性心肌细胞肥大提供了新的临床治疗方法及策略。
附图说明
图1为AAV-hsa-miR-21重组质粒的结构图；
图2为AAV-hsa-miR-128-1-hsa-miR-221重组质粒的结构图；
图3为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏超声图；
图4为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的左室后壁厚度和室间隔厚度统计图；
图5为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏重量与体重和胫骨长度之比统计图；
图6为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏组织HE染色图以及室间隔厚度统计图；
图7为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏组织Masson染色以及胶原面积统计图；
图8为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏组织WGA染色以及心肌细胞横截面积统计图；
图9为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏组织心肌肥大相关蛋白水平检测及表达水平统计图；
图10为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏组织心肌损伤标志物以及PI3Kp85α蛋白水平检测及表达水平统计图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。
下述实施例中，所用的实验材料和主要实验仪器的来源信息如表1、表2所示：
表1实验材料
Figure GDA0003438285820000041
表2主要实验仪器
Figure GDA0003438285820000042
Figure GDA0003438285820000051
实施例1
一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过检索GeneBank网站，找到hsa-miR-21-5p、hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p序列，经上海汉恒生物科技有限公司合成带有EcoR I和Hind III两个酶切位点序列的hsa-miR-21-5p及带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列，所述hsa-mir-21-5p序列如SEQ ID NO:1所示，hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列如SEQ ID NO:2所；分别进行PCR扩增，扩增体系见表3：
表3
Figure GDA0003438285820000052
其中，带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-mir-21-5p序列的PCR扩增的上游引物序列为:5’-acagaattctgtcgggtagcttatcagactgatgttgactgttgaatctcatggc-3’(SEQ ID NO:3)；下游引物序列为:5’-acaaagctttgtcagacagcccatcgactggtgttgccatgagattcaacagtcaac-3’(SEQ ID NO:4)；
带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的PCR扩增的上游引物序列为:5’-gctttccggtcgccacctaagaattctgagctgttggattcggggccgt-3’(SEQ ID NO:5)，下游引物序列为:5’-cagaggttgattatcgataagcttgagaacatgtttccaggtagcctg-3’(SEQ ID NO:6)。
扩增程序见表4：
表4
Figure GDA0003438285820000061
酶切以后利用琼脂糖凝胶电泳将目的片段所在区域切胶回收，回收目的片段，得到hsa-mir-21-5p目的片段和hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联目的片段。
(2)将hsa-mir-21-5p目的片段和穿梭质粒pshuttl-CMV各自用限制性内切酶EcoRI和Hind III双酶切(置于37℃水浴锅中1小时进行酶切反应)，酶切以后利用琼脂糖凝胶电泳将目的片段所在区域切胶回收，然后将得到的双酶切反应产物混合，冰水浴中进行DNA连接反应，得到含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒(记为AAV-hsa-miR-21重组质粒，图1为AAV-hsa-miR-21重组质粒的结构图)，对其进行扩增，提纯；
将hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联目的片段和穿梭质粒pshuttl-CMV各自用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，然后将得到的双酶切反应产物混合，冰水浴中进行DNA连接反应，得到含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒(记为AAV-hsa-miR-128-1-hsa-miR-221重组质粒，图2为AAV-hsa-miR-128-1-hsa-miR-221重组质粒的结构图)，对其进行扩增，提纯；
酶切反应的体系见表5：
表5
Figure GDA0003438285820000062
Figure GDA0003438285820000071
DNA连接反应的体系见表6：
表6
Figure GDA0003438285820000072
含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒以及含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒的扩增方法为：将含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒以及含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒分别与DH5α感受态细胞混合后，放入42℃的水浴孵育90秒，再迅速放入冰浴孵育2分钟，涂板于选择培养平板上，37℃过夜培养，第二天挑选单克隆菌落，接种于含50mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(配方：将10g胰蛋白胨(Tryptone)、5g酵母提取物(Yeast extract)、5g NaCl先溶解于950ml去离子水中，使用1mol/LNaOH调pH至7.4，使用去离子水定容至1L，通过高压蒸汽灭菌20min，冷却后使用)，37℃过夜扩增培养；随后离心裂解菌液，抽提纯化质粒，送上海汉恒生物科技有限公司进行测序鉴定。
(3)腺相关病毒包装：将含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV-RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为过表达hsa-mir-21-5p序列的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定；
将含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV-RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为过表达hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定；
具体方案如下：
采用的试剂见表7：
表7
Figure GDA0003438285820000081
腺相关病毒的包装步骤如下：
第一天：将AAV-293T细胞(购自上海汉恒生物科技有限公司)传代到100mm平皿中用于转染，操作完毕后置于37℃、5％CO2和95％相对湿度的培养箱中，培养48小时。
第三天：转染
确认细胞密度达到约80～90％的汇合率即可进行转染。转染直径100mm平皿所需的转染复合物成分见表8：
表8
Figure GDA0003438285820000082
转染后6h更换含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基。上表中pAAV-RC质粒和pHelper质粒购自上海汉恒生物科技有限公司。
细胞收集：转染后72h，将含AAV颗粒的细胞用细胞刮轻轻刮下，收集于15mL离心管中，150×g离心3min收集细胞，去除培养上清，用PBS洗一次，最后再用300μLPBS重悬细胞。准备37℃恒温水浴锅和液氮，将装有细胞的离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。4℃，2000×g，5min，去除细胞碎片，收集含AAV颗粒的裂解上清，即得到过表达hsa-mir-21-5p序列的血清9型重组腺相关病毒和过表达hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的血清9型重组腺相关病毒。
腺相关病毒的纯化方法：
1)全能核酸酶处理：每1mL病毒粗提物中加入0.1μLBenonase酶，37℃水浴1h，除去病毒液中的细胞基因组及残留的质粒DNA。600×g，4℃，离心10min，取上清。
2)柱纯化(根据Biomiga腺相关病毒纯化试剂盒V1469-01纯化)。将柱纯化得到的4mLAAV病毒样品液体，加入到超滤管中，1400×g离心30min，得到约1mLAAV。收集最终得到的纯化后的病毒，于﹣80℃保存。
(4)将过表达hsa-mir-21-5p序列的血清9型重组腺相关病毒与过表达hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的血清9型重组腺相关病毒等体积混合，得到血清9型重组腺相关病毒复合剂。
实施例2
重组腺相关病毒复合剂通过抑制PI3K信号通路，防治病理性心肌细胞肥大
由南京医科大学医药实验动物中心购入8周龄C57BL/6品系野生型(WT)小鼠21只，分为3组(7只/组)。具体分组如下：第一组不予任何处理(下述图中标记为WT)；第二组不予给药处理，2周后直接以Ang II埋泵缓释诱导小鼠心肌细胞肥大，持续4周(下述图中标记为WT+Ang II)；第三组给予WT小鼠注射实施例1的血清9型重组腺相关病毒复合剂，2周后以Ang II埋泵缓释诱导小鼠心肌细胞肥大，持续4周(下述图中标记为WT+Ang II+hsa-miRs)。
模型建立方法：将腺相关病毒复合剂按照200μl/只小鼠(1×1012v.g/ml)剂量由尾静脉进行注射。2周后进行Ang II埋泵处理，称量每只小鼠重量，按1.3mg/kg/day计算，将对应量的Ang II注入渗透压泵中(10396-18,ALZET)，再植入小鼠皮下，持续4周后进行下述分析。
上述处理结束后，对各处理组小鼠进行心脏超声心动图检测。使用高分辨率成像系统检测小鼠心脏，于长轴和短轴方向测量室厚壁厚度(LVPW)，室间隔厚度(IVS)，评估小鼠心功能。进一步将小鼠以1％戊巴比妥钠麻醉，眼球取血后脱颈椎处死，打开胸腔，冲洗心脏干净后剪下，滤纸上去除周围组织。心脏标本称量重量后一并量取该小鼠左右侧胫骨长度取均值，取心尖部于4％的多聚甲醛中固定24h以上，梯度乙醇脱水，二甲苯透明石蜡包埋。石蜡切片厚度为5μm，37℃烘箱内烤片24h。通过HE染色观察心室壁及室间隔厚度，通过Masson三色染色观察心肌纤维化面积，通过WGA染色观察心肌细胞肥大情况，其余心脏组织用于提取心脏蛋白，通过Western Blot检测心肌细胞肥大相关蛋白ANP、BNP、β-MHC、Troponin I以及正常心肌细胞骨架蛋白Desmin的表达水平检测。下述统计图中呈现平均值(Mean)±标准误(SEM)，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001与WT组相比；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001与WT+Ang II组相比。
结果见图1-8：
图3为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏超声图；图4为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的左室后壁厚度(LVPW)和室间隔厚度(IVS)统计图。由图1-2可以看出，与WT组小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，小鼠LVPW和IVS明显升高。与Ang II处理组相比，给予血清9型重组腺相关病毒复合剂处理，有效降低了LVPW和IVS水平。
图5为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏重量与体重和胫骨长度之比统计图，其中，图5A为各处理组小鼠的心脏外观图，图5B为小鼠的心脏重量与体重和胫骨长度之比统计图，可以看出：与WT组小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，小鼠心脏外观明显变大，心脏重量与体重之比(HW/BW)和心脏重量与胫骨长度之比(HW/TL)明显升高；与Ang II处理组相比，采用实施例1的血清9型重组腺相关病毒复合剂处理后，小鼠心脏外观变小，HW/BW和HW/TL降低。
图6为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏组织HE染色图以及室间隔厚度统计图，其中，图6A为小鼠的心脏组织HE染色图，图6B为小鼠的心脏组织室间隔厚度统计图，可以看出：与WT组小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，小鼠心室横截面积变大，心脏室间隔厚度明显变厚；与Ang II处理组相比，给予实施例1的血清9型重组腺相关病毒复合剂处理后，心室横截面积缩小，室间隔厚度变小，但仍高于WT小鼠。
图7为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏组织Masson染色以及胶原面积统计图，其中图7A为小鼠心脏组织Masson染色图,图7B为小鼠心肌组织胶原面积统计图。可以看出：与WT组小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，小鼠心肌胶原面积占比明显变大；与Ang II处理组相比，采用实施例1的血清9型重组腺相关病毒复合剂处理后，心肌胶原面积减少，但仍差于WT小鼠。
图8为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏组织WGA染色以及心肌细胞横截面积统计图，其中图8A为小鼠心脏组织WGA染色图，图8B为小鼠心肌细胞横截面积统计图。可以看出：与WT小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，小鼠心肌细胞横截面积明显变大；与Ang II处理组相比，采用实施例1的血清9型重组腺相关病毒复合剂处理后，小鼠心肌细胞横截面积变小，但仍略大于WT小鼠。
图9为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏组织心肌肥大相关蛋白水平检测及表达水平统计图，其中图9A为各处理组小鼠心脏心肌肥大相关蛋白印迹图，图9B为各处理组小鼠心脏心肌肥大相关蛋白表达水平统计图。可以看出：与WT组小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，小鼠心肌肥大相关分子ANP、BNP蛋白表达水平明显升高；与Ang II处理组相比，采用实施例1的血清9型重组腺相关病毒复合剂处理后，ANP、BNP蛋白表达水平降低，但仍高于WT小鼠。
图10为经尾静脉注射血清9型重组腺相关病毒复合剂的心肌肥大小鼠的心脏组织心肌损伤标志物以及PI3K p85α蛋白水平检测及表达水平统计图，其中图10A为各处理组小鼠心脏心肌损伤标志物Troponin I以及PI3Kp85α蛋白印迹图，图10B为各处理组小鼠心脏心肌损伤标志物Troponin I以及PI3Kp85α蛋白表达水平统计图。可以看出：与WT组小鼠相比，Ang II诱导的心肌肥大后，小鼠心肌损伤标志物Troponin I以及PI3Kp85α蛋白表达水平明显升高；与Ang II处理组相比，采用实施例1的血清9型重组腺相关病毒复合剂处理后，小鼠心肌损伤标志物Troponin I以及PI3Kp85α蛋白表达水平明显降低，但仍高于WT小鼠。
序列表：
SEQ ID NO:1
hsa-miR-21的序列
tgtcgggtagcttatcagactgatgttgactgttgaatctcatggcaacaccagtcgatgggctgtctgaca
SEQ ID NO:2
hsa-miR-128-1和hsa-miR-221串联序列
tgagctgttggattcggggccgtagcactgtctgagaggtttacatttctcacagtgaaccggtctctttttcagctgcttcaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttacgggccccccctcgaggtcgggataaaagcagtctgggctttcacatgacagcatctggggctgcggcagagggtcgggtccgaagcgctgccttatcagcgtccccagccctgggaggtgacagctggctggcttgtgtcagcccctcgggcactcacgtatctccgtccgacgggtttaaaatagcaaaactctgaggccacacaatagcttgggcttatatgggctcctgtgggggaagggggagcacggagggggccggggccgctgctgccaaaatagcagctcacaagtgttgcattcctctctgggcgccgggcacattcctgctggctctgcccgccccggggtgggcgccggggggaccttaaagcctctgccccccaaggagcccttcccagacagccgccggcacccaccgctccgtgggacgatccccgatgaacatccaggtctggggcatgaacctggcatacaatgtagatttctgtgttcgttaggcaacagctacattgtctgctgggtttcaggctacctggaaacatgttctc
SEQ ID NO:3
带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-mir-21-5p序列的PCR扩增的上游引物序列
acagaattctgtcgggtagcttatcagactgatgttgactgttgaatctcatggc
SEQ ID NO:4
带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-mir-21-5p序列的PCR扩增的上游引物序列
acaaagctttgtcagacagcccatcgactggtgttgccatgagattcaacagtcaac
SEQ ID NO:5
带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的PCR扩增的上游引物序列
gctttccggtcgccacctaagaattctgagctgttggattcggggccgt
SEQ ID NO:6
带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的PCR扩增的下游引物序列
Cagaggttgattatcgataagcttgagaacatgtttccaggtagcctg。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> 腺相关病毒(adeno-associated virus)
<400> 1
tgtcgggtag cttatcagac tgatgttgac tgttgaatct catggcaaca ccagtcgatg 60
ggctgtctga ca 72
<210> 2
<211> 756
<212> DNA
<213> 腺相关病毒(adeno-associated virus)
<400> 2
tgagctgttg gattcggggc cgtagcactg tctgagaggt ttacatttct cacagtgaac 60
cggtctcttt ttcagctgct tcaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 120
caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt 180
gtccaaactc atcaatgtat cttacgggcc ccccctcgag gtcgggataa aagcagtctg 240
ggctttcaca tgacagcatc tggggctgcg gcagagggtc gggtccgaag cgctgcctta 300
tcagcgtccc cagccctggg aggtgacagc tggctggctt gtgtcagccc ctcgggcact 360
cacgtatctc cgtccgacgg gtttaaaata gcaaaactct gaggccacac aatagcttgg 420
gcttatatgg gctcctgtgg gggaaggggg agcacggagg gggccggggc cgctgctgcc 480
aaaatagcag ctcacaagtg ttgcattcct ctctgggcgc cgggcacatt cctgctggct 540
ctgcccgccc cggggtgggc gccgggggga ccttaaagcc tctgcccccc aaggagccct 600
tcccagacag ccgccggcac ccaccgctcc gtgggacgat ccccgatgaa catccaggtc 660
tggggcatga acctggcata caatgtagat ttctgtgttc gttaggcaac agctacattg 720
tctgctgggt ttcaggctac ctggaaacat gttctc 756
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 腺相关病毒(adeno-associated virus)
<400> 3
acagaattct gtcgggtagc ttatcagact gatgttgact gttgaatctc atggc 55
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 腺相关病毒(adeno-associated virus)
<400> 4
acaaagcttt gtcagacagc ccatcgactg gtgttgccat gagattcaac agtcaac 57
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 腺相关病毒(adeno-associated virus)
<400> 5
gctttccggt cgccacctaa gaattctgag ctgttggatt cggggccgt 49
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 腺相关病毒(adeno-associated virus)
<400> 6
cagaggttga ttatcgataa gcttgagaac atgtttccag gtagcctg 48

Claims (5)

1.血清9型重组腺相关病毒复合剂在制备用于防治病理性心肌细胞肥大的药物中的用途，所述血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法包括如下步骤：
（1）合成带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-mir-21-5p序列，以及带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列，分别进行PCR扩增，酶切以后利用琼脂糖凝胶电泳将目的片段所在区域切胶回收，得到hsa-mir-21-5p目的片段和hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联目的片段；
（2）将hsa-mir-21-5p目的片段和穿梭质粒pshuttl-CMV各自用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，然后将得到的双酶切反应产物混合，进行DNA连接反应，得到含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒，对其进行扩增，提纯；
将hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联目的片段和穿梭质粒pshuttl-CMV各自用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，然后将得到的双酶切反应产物混合，进行DNA连接反应，得到含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒，对其进行扩增，提纯；
（3）将含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV-RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为过表达hsa-mir-21-5p序列的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定；
将含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV-RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为过表达hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定；
（4）将过表达hsa-mir-21-5p序列的血清9型重组腺相关病毒与过表达hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的血清9型重组腺相关病毒混合，得到血清9型重组腺相关病毒复合剂。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（1）中，带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-mir-21-5p序列的PCR扩增的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（1）中，带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的PCR扩增的上游引物序列如SEQ IDNO:5所示，下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤（2）中，含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒以及含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒的扩增方法为：将含有hsa-mir-21-5p序列的重组穿梭质粒以及含有hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的重组穿梭质粒分别与感受态细胞混合后，放入42℃的水浴孵育90秒，再迅速放入冰浴孵育2分钟，涂板于选择培养平板上，37℃过夜培养，第二天挑选单克隆菌落，接种于含50mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃过夜扩增培养；随后离心裂解菌液，抽提纯化质粒。
5.如权利要求1或2或3或4所述的用途，其特征在于，步骤（4）中，过表达hsa-mir-21-5p序列的血清9型重组腺相关病毒与过表达hsa-miR-128-3p和hsa-miR-221-3p串联序列的血清9型重组腺相关病毒的体积比为1:1。
CN202110673143.9A 2021-06-17 2021-06-17 一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用 Active CN113355358B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110673143.9A CN113355358B (zh) 2021-06-17 2021-06-17 一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110673143.9A CN113355358B (zh) 2021-06-17 2021-06-17 一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113355358A CN113355358A (zh) 2021-09-07
CN113355358B true CN113355358B (zh) 2022-03-11

Family

ID=77534853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110673143.9A Active CN113355358B (zh) 2021-06-17 2021-06-17 一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113355358B (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611355B (zh) * 2018-05-04 2021-08-31 北京锦篮基因科技有限公司 X染色体连锁肌小管肌病的基因药物

Also Published As

Publication number Publication date
CN113355358A (zh) 2021-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100558745C (zh) 同种排斥反应的特异性抑制
CN102140461A (zh) 小干扰核酸和药物组合物及其制药应用
CN102115787B (zh) 一种微小rna及其反义核酸在制备诊断、预防、治疗和/或预后评估心脏疾病的试剂盒或药物中的用途
CN102140459A (zh) 一种小干扰核酸和药物组合物及其制药应用
CN111139240B (zh) 一种靶向乙型肝炎病毒的改造的CRISPR/SaCas9系统及其应用
CN112138159B (zh) 乳酸脱氢酶在组织炎症和纤维化治疗中的应用
CN102140460A (zh) 小干扰核酸和药物组合物及其制药应用
CN113151357B (zh) 一种Bmi-1-RING1B过表达的血清9型重组腺相关病毒的构建方法及其应用
CN102242080B (zh) miR-24用于治疗或诊断心衰或患心衰倾向或者改善心肌细胞功能的方法
CN113355358B (zh) 一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用
US11340221B2 (en) Use of molecular marker Dkk-3 associated with muscle atrophy
CN110295227B (zh) 基于hsa-miR-320a的糖尿病早期预警和/或诊断试剂盒的制备方法
CN113528528B (zh) 一种促进耐伊马替尼慢性髓细胞白血病细胞K562/G01凋亡shRNA及其应用
CN112626031B (zh) 一种基因修饰的牙髓干细胞及其制备方法和应用
CN114432332A (zh) circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物
Xu et al. FHL2 regulates microglia M1/M2 polarization after spinal cord injury via PARP14-depended STAT1/6 pathway
CN107252491A (zh) 用于治疗心力衰竭的药物及其筛选方法和制备方法
Yang et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviating heart dysfunction through suppressing MG53 protein in rat model of diabetic cardiomyopathy
CN114712393B (zh) Hnf-1α基因修饰的间充质干细胞在防治肝癌中的用途
CN110804100A (zh) 融合多肽及其在增强干细胞归巢能力和抗凋亡能力中的应用和药物组合物
WO2020248771A9 (zh) 基于hsa-miR-320a的糖尿病早期预警和/或诊断试剂盒的制备方法、防治糖尿病的药物及其筛选方法和制备方法
CN114517209B (zh) 环状RNA circTTC3过表达腺相关病毒载体、腺相关病毒及其应用
CN115838725B (zh) 在哺乳动物心脏中特异性启动基因的启动子序列及其应用
CN113337594B (zh) Lpcat1基因在制备治疗肝脏炎症药物及诊断试剂盒中的应用
CN116768982A (zh) 一种多肽及其在制备防治肿瘤的药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant