CN111440821A - 干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和应用方法 - Google Patents

干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和应用方法，其中制备方法包括：从人体组织中分离干细胞并进行培养；结合PB转座子、EF1A启动子序列、KOZAK序列、所要表达的目的蛋白序列、T2A序列、所要表达目的蛋白序列、CD33信号肽序列、IRES序列、PURO序列和附加体系统，构建重组表达载体；将重组表达载体加入干细胞的培养悬液，采用电转染方式获得能够表达目的蛋白的干细胞。通过本发明的技术方案，可以将重组表达载体转移至干细胞中，迅速获得高表达的细胞，可以增加两种细胞因子的协同作用，使两种细胞因子同时表达，使重组表达载体质粒在干细胞内长时间存在并高效表达目的蛋白。

Description

干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和应用方法
技术领域
本发明涉及干细胞外泌体技术领域，尤其涉及一种干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和一种干细胞高效表达目的蛋白的应用方法。
背景技术
干细胞外泌体在国外研究已经多年，用于市场上的外泌体越来越多，而国内对于干细胞外泌体的应用也随之越来越多，但是干细胞外泌体表达浓度低应用效果一般，对目的蛋白外泌体的表达效率较低、蛋白表达量较低。
发明内容
针对上述问题中的至少之一，本发明提供了一种干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和应用方法，通过电转染方式将重组表达载体转移至干细胞中，从而提取得到目的蛋白外泌体，采用人源启动子EF1A，在寡肽-1和碱性成纤维蛋白或其他蛋白N端融合CD33信号肽，有利于蛋白分泌，采用IRES表达原件可以增加两种细胞因子的协同作用，使两种细胞因子同时表达，采用附加体系统可以使转移的重组表达载体质粒在干细胞内长时间存在并高效表达目的蛋白，采用PURO序列筛选标记可以迅速获得高表达的细胞。
为实现上述目的，本发明提供了一种干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，包括：从人体组织中分离干细胞并进行培养；结合PB转座子、EF1A启动子序列、KOZAK序列、所要表达的目的蛋白序列、T2A序列、所要表达目的蛋白序列、CD33信号肽序列、IRES序列、PURO序列和附加体系统，构建重组表达载体；将所述重组表达载体加入所述干细胞的培养悬液，采用电转染方式获得能够表达所述目的蛋白的干细胞。
在上述技术方案中，优选地，所述重组表达载体中包括两种目的蛋白的序列，两种目的蛋白的序列分别设置于所述T2A序列的前后两侧。
在上述技术方案中，优选地，所述目的蛋白包括寡肽-1、碱性成纤维蛋白、角质蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白、原纤蛋白、再生蛋白、转化因子、胰岛素样生长因子和转化因子。
在上述技术方案中，优选地，所述人体组织中分离出的所述干细胞包括间充质干细胞、脂肪干细胞和上皮干细胞，所述人体组织包括人脐带组织和脂肪组织。
在上述技术方案中，优选地，所述电转染方式的实施步骤包括：在电转染实施前1-2天，将所述干细胞转移至细胞培养瓶，使得电转染前所述干细胞的细胞汇合度为50％-70％；采用PBS缓慢冲洗所述干细胞，再吸出所述PBS，采用胰酶蛋白酶消化所述干细胞，再加入含血清的培养基中和胰酶；离心收集所述干细胞，采用PBS、hepes和无血清培养基重悬细胞，使之密度为1×106～5×106cell/ml；设置电转染参数为2.0kV、25uFD；将所述重组表达载体的质粒加入电转杯，根据所述干细胞种类设置所述质粒的起始浓度为10～50μg/ml；向电击杯中加入重悬后的细胞，颠转所述电击杯进行混匀；将所述电击杯放入电击槽中，进行一次脉冲电击；将电击后的细胞转移至含有培养基的孔中；晃动孔板以混匀细胞，电转24～48小时后，细胞基因瞬时表达。
在上述技术方案中，优选地，所述目的蛋白为寡肽-1和碱性成纤维蛋白时，所述重组表达载体为PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—碱性成纤维蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1。
在上述技术方案中，优选地，所述目的蛋白为寡肽-1和角质蛋白时，所述重组表达载体为PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—角质蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1。
在上述技术方案中，优选地，从人脐带组织中分离间充质干细胞的步骤包括：分离得到人脐带组织块，并利用胰酶消化5-10分钟；收集组织悬液并离心，弃掉上清液，将所述组织块贴放到平皿中；加入DMEM细胞培养基，定期半量换液；待细胞长满平皿后，去除所述组织块；利用胰酶消化处理后将所述平皿上的原代细胞转移至T75培养瓶中；待细胞长满培养瓶并传代至2-3代，得到间充质干细胞。
在上述技术方案中，优选地，从人脂肪组织中分离脂肪干细胞的步骤包括：将脂肪组织用D-Hanks冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，将脂肪组织放入离心管中；向脂肪组织中加入等体积的0.1％-0.5％Ⅰ型胶原酶，放入37℃汽浴震荡器中进行消化30-60min；当消化完成后，弃掉未消化的脂肪组织，将细胞悬液离心后弃掉上清液；得到离心管底部的脂肪干细胞团，将其重悬使密度调整到1×105mL-1；将细胞悬液接种在细胞培养瓶中，利用DMEM培养基培养，待其生长至融合度80％以上；收集培养液，用PBS洗三遍，利用0.125％-0.25％胰酶消化，细胞计数后接种至细胞培养瓶中，培养得到脂肪干细胞。
本发明还提出一种干细胞高效表达目的蛋白的应用方法，利用如上述技术方案中任一项所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，制备并培养能高效表达目的蛋白的干细胞，用于提取目的蛋白外泌体。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过电转染方式将重组表达载体转移至干细胞中，从而提取得到目的蛋白外泌体，采用人源启动子EF1A，在寡肽-1和碱性成纤维蛋白或其他蛋白N端融合CD33信号肽，有利于蛋白分泌，采用IRES表达原件可以增加两种细胞因子的协同作用，使两种细胞因子同时表达，采用附加体系统可以使转移的重组表达载体质粒在干细胞内长时间存在并高效表达目的蛋白，采用PURO序列筛选标记可以迅速获得高表达的细胞，可以适用于同时表达一种目的蛋白和多种目的蛋白，所构建的载体可适用于多种干细胞表达。
附图说明
图1为本发明一种实施例公开的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：
如图1所示，根据本发明提供的一种干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，包括：从人体组织中分离干细胞并进行培养；结合PB转座子、EF1A启动子序列、KOZAK序列、所要表达的目的蛋白序列、T2A序列、所要表达目的蛋白序列、CD33信号肽序列、IRES序列、PURO序列和附加体系统，构建重组表达载体；将重组表达载体加入干细胞的培养悬液，采用电转染方式获得能够表达目的蛋白的干细胞。
在该实施例中，通过电转染方式将重组表达载体转移至干细胞中，从而得到能够表达多种目的蛋白的干细胞，进一步可用于多种目的蛋白外泌体的提取。其中，采用人源启动子EF1A，在寡肽-1和碱性成纤维蛋白或其他蛋白N端融合CD33信号肽，有利于蛋白分泌，采用IRES表达原件可以增加两种细胞因子的协同作用，使两种细胞因子同时表达，采用附加体系统可以使转移的重组表达载体质粒在干细胞内长时间存在并高效表达目的蛋白，采用PURO序列筛选标记可以迅速获得高表达的细胞。
在上述实施例中，优选地，重组表达载体中包括两种目的蛋白的序列，两种目的蛋白的序列分别设置于T2A序列的前后两侧。
在上述实施例中，优选地，目的蛋白包括寡肽-1、碱性成纤维蛋白、角质蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白、原纤蛋白、再生蛋白、转化因子、胰岛素样生长因子和转化因子。
在上述实施例中，优选地，目的蛋白为寡肽-1和碱性成纤维蛋白时，重组表达载体为PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—碱性成纤维蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1。
在上述实施例中，优选地，目的蛋白为寡肽-1和角质蛋白时，重组表达载体为PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—角质蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1。
在上述实施例中，优选地，人体组织中分离出的干细胞包括间充质干细胞、脂肪干细胞和上皮干细胞，人体组织包括人脐带组织和脂肪组织。
根据本发明提供的一种干细胞高效表达目的蛋白的应用方法，利用如上述实施例中任一项所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，制备并培养能高效表达目的蛋白的干细胞，用于提取目的蛋白外泌体。
根据上述实施例提供的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法以及应用方法，以下提供三个实施例，以对上述方法进行详细说明。
实施例一：
本发明提供一种高效表达寡肽-1和碱性成纤维蛋白的人脐带间充质干细胞的制备方法，具体步骤如下：
1.从人脐带分离人脐带间充质干细胞；
1)分离脐带华通氏胶，将胶体剪碎；
2)利用0.25％胰酶消化5-10分钟；
3)收集组织悬液离心2000转、10分钟；
4)弃掉上清液，将组织块贴放到90mm平皿中；
5)加入2-3毫升DMEM细胞培养基，每2-3天半量换液；
6)待细胞长满平皿，去除组织块；
7)利用0.25％胰酶消化处理，并将平皿上的原代细胞转移至T75培养瓶中；
8)待细胞长满培养瓶，传代至2-3代；
2.构建重组表达载体PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—碱性成纤维蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1；
3.将步骤1所得人脐带间充质干细胞与步骤2所得重组表达载体采用电转染方式，获得能够高效表达寡肽-1和碱性成纤维蛋白的人脐带间充质干细胞：
悬浮细胞：
1)电转前1-2天，将细胞转移至75cm2细胞培养瓶，至转化前细胞汇合度约50-70％，此时细胞数约为2-10×106，而每次电转需约1-10×105个细胞；
2)12ml PBS缓慢冲洗细胞，吸出PBS，用0.4ml胰酶蛋白酶消化细胞，加入10ml含血清的培养基，中和胰酶；
3)离心收集细胞，用PBS、Hepes、无血清培养基等重悬细胞，使之密度为1-5×106cell/ml。
电转化：
1)设置电转程序：2.0KV，25uFD；
2)将线性化的重组质粒加入电转杯，所需质粒根据细胞不同而定，一般起始浓度为10-50ug/ml；
3)向电击杯中加入细胞，颠转电击杯使之混匀；
4)将电击杯放入电击槽中，脉冲电击一次；
5)将细胞转移至已含0.5ml培养基的孔中；
6)轻轻晃动孔板，混匀细胞，电转24-48h后，基因瞬时表达；
7)24-48h后细胞活性检测；
其中，HEPES缓冲液为：10mm Hepes；pH 7.3；40mm NaCl。
实施例二：
本发明提供一种高效表达寡肽-1和碱性成纤维蛋白的脂肪干细胞的制备方法，具体步骤如下：
1.从脂肪组织分离提取脂肪干细胞；
1)将脂肪组织用D-Hanks冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，把脂肪组织放入离心管中；
2)向组织中加入等体积的0.1％-0.5％Ⅰ型胶原酶，放入37℃汽浴震荡器中消化30-60min；
3)当消化完成后，弃掉上层未消化的脂肪组织，将下层的细胞悬液以300g-400g，离心10min后弃上清；
4)得到离心管底部的脂肪干细胞团，将其重悬，密度调整到1×105mL-1；
5)接种在培养面积为25cm2的细胞培养瓶中，用DMEM培养基培养，待其生长至融合度80％以上；
6)收集培养液，用PBS洗三遍，0.125％-0.25％胰酶消化，细胞计数，接种至3个培养面积为75cm2的细胞培养瓶中；
2.构建重组表达载体PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—碱性成纤维蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1；
3.将步骤1所得脂肪干细胞与步骤2所得重组表达载体采用电转染方式，
获得能够高效表达寡肽-1和碱性成纤维蛋白的脂肪干细胞：
悬浮细胞：
1)电转前1-2天，将细胞转移至75cm2细胞培养瓶，至转化前细胞汇合度约50-70％。此时细胞数约为2-10×106，而每次电转需约1-10×105个细胞；
2)12ml PBS缓慢冲洗细胞，吸出PBS，用0.4ml胰酶蛋白酶消化细胞，加入10ml含血清的培养基，中和胰酶；
3)离心收集细胞，用PBS、Hepes、无血清培养基等重悬细胞，使之密度为1-5×106cell/ml。
电转化：
1)设置电转程序：2.0KV，25uFD；
2)将线性化的重组质粒加入电转杯，所需质粒根据细胞不同而定，一般起始浓度为10-50ug/ml；
3)向电击杯中加入细胞，颠转电击杯使之混匀；
4)将电击杯放入电击槽中，脉冲电击一次；
5)将细胞转移至已含0.5ml培养基的孔中；
6)轻轻晃动孔板，混匀细胞，电转24-48h后，基因瞬时表达；
7)24-48h后细胞活性检测；
其中，HEPES缓冲液为：10mm Hepes；pH 7.3；40mm NaCl。
实施例三：
本发明提供一种高效表达寡肽-1和角质蛋白的人脐带间充质干细胞的制备方法，具体步骤如下：
1.从人脐带分离人脐带间充质干细胞；
1)分离脐带华通氏胶，将胶体剪碎；
2)利用0.25％胰酶消化5-10分钟；
3)收集组织悬液离心2000转、10分钟；
4)弃掉上清液，将组织块贴放到90mm平皿中；
5)加入2-3毫升DMEM细胞培养基，每2-3天半量换液；
6)待细胞长满平皿，去除组织块；
7)利用0.25％胰酶消化处理，并将平皿上的原代细胞转移至T75培养瓶中；
8)待细胞长满培养瓶，传代至2-3代；
2.构建重组表达载体PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—角质蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1；
3.将步骤1所得人脐带间充质干细胞与步骤2所得重组表达载体采用电转染方式，获得能够高效表达寡肽-1和角质蛋白的人脐带间充质干细胞：
悬浮细胞：
1)电转前1-2天，将细胞转移至75cm2细胞培养瓶，至转化前细胞汇合度约50-70％，此时细胞数约为2-10×106，而每次电转需约1-10×105个细胞；
2)12ml PBS缓慢冲洗细胞，吸出PBS，用0.4ml胰酶蛋白酶消化细胞，加入10ml含血清的培养基，中和胰酶；
3)离心收集细胞，用PBS、Hepes、无血清培养基等重悬细胞，使之密度为1-5×106cell/ml。
电转化：
1)设置电转程序：2.0KV，25uFD；
2)将线性化的重组质粒加入电转杯，所需质粒根据细胞不同而定，一般起始浓度为10-50ug/ml；
3)向电击杯中加入细胞，颠转电击杯使之混匀；
4)将电击杯放入电击槽中，脉冲电击一次；
5)将细胞转移至已含0.5ml培养基的孔中；
6)轻轻晃动孔板，混匀细胞，电转24-48h后，基因瞬时表达；
7)24-48h后细胞活性检测；
其中，HEPES缓冲液为：10mm Hepes；pH 7.3；40mm NaCl。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以适用于同时表达一种目的蛋白和多种目的蛋白，所构建的载体可适用于多种干细胞表达。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>北京本真工坊生物科技有限公司
<120>干细胞高效表达目的蛋白的制备方法和应用方法
<160>11
<210> 1
<211>1182
<212>DNA
<213>未知
<400> 1
gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60
gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120
atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180
tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240
tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300
cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg 360
tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc 420
tggcttgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct 480
gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc 540
tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg 600
gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg 660
cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg 720
cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca 780
ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg 840
aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt 900
ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc 960
gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg 1020
atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg 1080
taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag 1140
acagtggttc aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt ga 1182
<210>2
<211>48
<212>DNA
<213>未知
<400>2
atgcccctgc tgctgctgct gcccctgctg tgggccggcg ccctggcc 48
<210> 3
<211>6
<212>DNA
<213>未知
<400> 3
gccacc 6
<210> 4
<211>465
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 4
atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60
ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120
ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180
aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240
cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300
tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360
accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420
cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagc 465
<210>5
<211>54
<212>DNA
<213>未知
<400>5
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54
<210>6
<211>574
<212>DNA
<213>未知
<400>6
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataa 574
<210>7
<211>600
<212>DNA
<213>未知
<400>7
atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 60
cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 120
cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac 180
atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag 240
agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt 300
tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag 360
cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc 420
agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg 480
gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc 540
gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga 600
<210>8
<211>1790
<212>DNA
<213>未知
<400>8
aacgggtagc atatgcttcc cgggtagtag tatatactat ccagactaac cctaattcaa 60
tagcatatgt tacccaacgg gaagcatatg ctatcgaatt agggttagta aaagggtcct 120
aaggaacagc gatatctccc accccatgag ctgtcacggt tttatttaca tggggtcagg 180
attccacgag ggtagtgaac cattttagtc acaagggcag tggctgaaga tcaaggagcg 240
ggcagtgaac tctcctgaat cttcgcctgc ttcttcattc tccttcgttt agctaataga 300
ataactgctg agttgtgaac agtaaggtgt atgtgaggtg ctcgaaaaca aggtttcagg 360
tgacgccccc agaataaaat ttggacgggg ggttcagtgg tggcattgtg ctatgacacc 420
aatataaccc tcacaaaccc cttgggcaat aaatactagt gtaggaatga aacattctga 480
atatctttaa caatagaaat ccatggggtg gggacaagcc gtaaagactg gatgtccatc 540
tcacacgaat ttatggctat gggcaacaca taatcctagt gcaatatgat actggggtta 600
ttaagatgtg tcccaggcag ggaccaagac aggtgaacca tgttgttaca ctctatttgt 660
aacaagggga aagagagtgg acgccgacag cagcggactc cactggttgt ctctaacacc 720
cccgaaaatt aaacggggct ccacgccaat ggggcccata aacaaagaca agtggccact 780
cttttttttg aaattgtgga gtgggggcac gcgtcagccc ccacacgccg ccctgcggtt 840
ttggactgta aaataagggt gtaataactt ggctgattgt aaccccgcta accactgcgg 900
tcaaaccact tgcccacaaa accactaatg gcaccccggg gaatacctgc ataagtaggt 960
gggcgggcca agataggggc gcgattgctg cgatctggag gacaaattac acacacttgc 1020
gcctgagcgc caagcacagg gttgttggtc ctcatattca cgaggtcgct gagagcacgg 1080
tgggctaatg ttgccatggg tagcatatac tacccaaata tctggatagc atatgctatc 1140
ctaatctata tctgggtagc ataggctatc ctaatctata tctgggtagc atatgctatc 1200
ctaatctata tctgggtagt atatgctatc ctaatttata tctgggtagc ataggctatc 1260
ctaatctata tctgggtagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagt atatgctatc 1320
ctaatctgta tccgggtagc atatgctatc ctaatagaga ttagggtagt atatgctatc 1380
ctaatttata tctgggtagc atatactacc caaatatctg gatagcatat gctatcctaa 1440
tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagcatag gctatcctaa 1500
tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa 1560
tttatatctg ggtagcatag gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa 1620
tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa tctgtatccg ggtagcatat gctatcctca 1680
tgcatataca gtcagcatat gatacccagt agtagagtgg gagtgctatc ctttgcatat 1740
gccgccacct cccaaggggg cgtgaatttt cgctgcttgt ccttttcctg 1790
<210>9
<211>1926
<212>DNA
<213>未知
<400>9
tcactcctgc ccttcctcac cctcatctcc atcacctcct tcatctccgt catctccgtc 60
atcaccctcc gcggcagccc cttccaccat aggtggaaac cagggaggca aatctactcc 120
atcgtcaaag ctgcacacag tcaccctgat attgcaggta ggagcgggct ttgtcataac 180
aaggtcctta atcgcatcct tcaaaacctc agcaaatata tgagtttgta aaaagaccat 240
gaaataacag acaatggact cccttagcgg gccaggttgt gggccgggtc caggggccat 300
tccaaagggg agacgactca atggtgtaag acgacattgt ggaatagcaa gggcagttcc 360
tcgccttagg ttgtaaaggg aggtcttact acctccatat acgaacacac cggcgaccca 420
agttccttcg tcggtagtcc tttctacgtg actcctagcc aggagagctc ttaaaccttc 480
tgcaatgttc tcaaatttcg ggttggaacc tccttgacca cgatgctttc caaaccaccc 540
tccttttttg cgcctgcctc catcaccctg accccggggt ccagtgcttg ggccttctcc 600
tgggtcatct gcggggccct gctctatcgc tcccgggggc acgtcaggct caccatctgg 660
gccaccttct tggtggtatt caaaataatc ggcttcccct acagggtgga aaaatggcct 720
tctacctgga gggggcctgc gcggtggaga cccggatgat gatgactgac tactgggact 780
cctgggcctc ttttctccac gtccacgacc tctccccctg gctctttcac gacttccccc 840
cctggctctt tcacgtcctc taccccggcg gcctccacta cctcctcgac cccggcctcc 900
actacctcct cgaccccggc ctccactgcc tcctcgaccc cggcctccac ctcctgctcc 960
tgcccctcct gctcctgccc ctcctcctgc tcctgcccct cctgcccctc ctgctcctgc 1020
ccctcctgcc cctcctgctc ctgcccctcc tgcccctcct gctcctgccc ctcctgcccc 1080
tcctcctgct cctgcccctc ctgcccctcc tcctgctcct gcccctcctg cccctcctgc 1140
tcctgcccct cctgcccctc ctgctcctgc ccctcctgcc cctcctgctc ctgcccctcc 1200
tgctcctgcc cctcctgctc ctgcccctcc tgctcctgcc cctcctgccc ctcctgcccc 1260
tcctcctgct cctgcccctc ctgctcctgc ccctcctgcc cctcctgccc ctcctgctcc 1320
tgcccctcct cctgctcctg cccctcctgc ccctcctgcc cctcctcctg ctcctgcccc 1380
tcctgcccct cctcctgctc ctgcccctcc tcctgctcct gcccctcctg cccctcctgc 1440
ccctcctcct gctcctgccc ctcctgcccc tcctcctgct cctgcccctc ctcctgctcc 1500
tgcccctcct gcccctcctg cccctcctcc tgctcctgcc cctcctcctg ctcctgcccc 1560
tcctgcccct cctgcccctc ctgcccctcc tcctgctcct gcccctcctc ctgctcctgc 1620
ccctcctgct cctgcccctc ccgctcctgc tcctgctcct gttccaccgt gggtcccttt 1680
gcagccaatg caacttggac gtttttgggg tctccggaca ccatctctat gtcttggccc 1740
tgatcctgag ccgcccgggg ctcctggtct tccgcctcct cgtcctcgtc ctcttccccg 1800
tcctcgtcca tggttatcac cccctcttct ttgaggtcca ctgccgccgg agccttctgg 1860
tccagatgtg tctcccttct ctcctaggcc atttccaggt cctgtacctg gcccctcgtc 1920
agacat 1926
<210>10
<211>468
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60
ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120
ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180
aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240
cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300
tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360
accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420
cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctga 468
<210>11
<211>546
<212>DNA
<213 >人工序列
<400> 11
atggggaaaa tcagcagtct tccaactcaa ttatttaaga tctgcctctg tgacttcttg 60
aagataaaga tacacatcat gtcgtcttca catctcttct acctggcact ctgcttgctc 120
acctttacca gctcggccac agccggacca gagacccttt gcggggctga gctggtggac 180
gctcttcagt tcgtgtgtgg accaaggggc ttttacttca acaagcccac aggctatggc 240
tccagcattc ggagggcacc acagacgggc attgtggatg agtgttgctt ccggagctgt 300
gatctgagga ggctggagat gtactgtgct ccgctgaagc ctacaaagtc agctcgttcc 360
atccgggccc agcgccacac tgacatgccc aagactcaga agtcccagcc cctatcgaca 420
cacaagaaaa ggaagctgca aaggagaagg aaaggtgagt caaaggcaca cccaggaggg 480
gaacaggagg agggagcaga ggcaactcag aaaatcagag gtgacagaga aaggaggccg 540
agctag 546

Claims (10)

1.一种干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
从人体组织中分离干细胞并进行培养；
结合PB转座子、EF1A启动子序列、KOZAK序列、所要表达的目的蛋白序列、T2A序列、所要表达目的蛋白序列、CD33信号肽序列、IRES序列、PURO序列和附加体系统，构建重组表达载体；
将所述重组表达载体加入所述干细胞的培养悬液，采用电转染方式获得能够表达所述目的蛋白的干细胞。
2.根据权利要求1所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组表达载体中包括两种目的蛋白的序列，两种目的蛋白的序列分别设置于所述T2A序列的前后两侧。
3.根据权利要求1或2所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白包括寡肽-1、碱性成纤维蛋白、角质蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白、原纤蛋白、再生蛋白、转化因子、胰岛素样生长因子和转化因子。
4.根据权利要求1所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述人体组织中分离出的所述干细胞包括间充质干细胞、脂肪干细胞和上皮干细胞，所述人体组织包括人脐带组织和脂肪组织。
5.根据权利要求1所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述电转染方式的实施步骤包括：
在电转染实施前1-2天，将所述干细胞转移至细胞培养瓶，使得电转染前所述干细胞的细胞汇合度为50％-70％；
采用PBS缓慢冲洗所述干细胞，再吸出所述PBS，采用胰酶蛋白酶消化所述干细胞，再加入含血清的培养基中和胰酶；
离心收集所述干细胞，采用PBS、hepes和无血清培养基重悬细胞，使之密度为1×106～5×106cell/ml；
设置电转染参数为2.0kV、25uFD；
将线性化的所述重组表达载体的质粒加入电转杯，根据所述干细胞种类设置所述质粒的起始浓度为10～50μg/ml；
向电击杯中加入重悬后的细胞，颠转所述电击杯进行混匀；
将所述电击杯放入电击槽中，进行一次脉冲电击；
将电击后的细胞转移至含有培养基的孔中；
晃动孔板以混匀细胞，电转24～48小时后，细胞基因瞬时表达。
6.根据权利要求3所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白为寡肽-1和碱性成纤维蛋白时，所述重组表达载体为PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—碱性成纤维蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1。
7.根据权利要求3所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白为寡肽-1和角质蛋白时，所述重组表达载体为PB—EF1A—KOZAK—寡肽-1—T2A—角质蛋白—CD33—IRES—PURO,附加体ORI—附加体EBNA1。
8.根据权利要求4所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，从人脐带组织中分离间充质干细胞的步骤包括：
分离得到人脐带组织块，并利用胰酶消化5-10分钟；
收集组织悬液并离心，弃掉上清液，将所述组织块贴放到平皿中；
加入DMEM细胞培养基，定期半量换液；
待细胞长满平皿后，去除所述组织块；
利用胰酶消化处理后将所述平皿上的原代细胞转移至T75培养瓶中；
待细胞长满培养瓶并传代至2-3代，得到间充质干细胞。
9.根据权利要求4所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，其特征在于，从人脂肪组织中分离脂肪干细胞的步骤包括：
将脂肪组织用D-Hanks冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，将脂肪组织放入离心管中；
向脂肪组织中加入等体积的0.1％-0.5％Ⅰ型胶原酶，放入37℃汽浴震荡器中进行消化30-60min；
当消化完成后，弃掉未消化的脂肪组织，将细胞悬液离心后弃掉上清液；
得到离心管底部的脂肪干细胞团，将其重悬使密度调整到1×105mL-1；
将细胞悬液接种在细胞培养瓶中，利用DMEM培养基培养，待其生长至融合度80％以上；
收集培养液，用PBS洗三遍，利用0.125％-0.25％胰酶消化，细胞计数后接种至细胞培养瓶中，培养得到脂肪干细胞。
10.一种干细胞高效表达目的蛋白的应用方法，利用如权利要求1至9中任一项所述的干细胞高效表达目的蛋白的制备方法，制备并培养能高效表达目的蛋白的干细胞，用于提取目的蛋白外泌体。
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