CN117887665A - 一种绵羊永生化ⅱ型肺泡上皮细胞系及其构建方法 - Google Patents

一种绵羊永生化ⅱ型肺泡上皮细胞系及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117887665A
CN117887665A CN202311777831.5A CN202311777831A CN117887665A CN 117887665 A CN117887665 A CN 117887665A CN 202311777831 A CN202311777831 A CN 202311777831A CN 117887665 A CN117887665 A CN 117887665A
Authority
CN
China
Prior art keywords
immortalized
cells
immortalized cells
increasing
proliferation activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311777831.5A
Other languages
English (en)
Inventor
岳耀敬
李建烨
安雪娇
张瑞
牛春娥
郭婷婷
王海峰
李诚兰
朱丽娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Original Assignee
Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS filed Critical Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority to CN202311777831.5A priority Critical patent/CN117887665A/zh
Publication of CN117887665A publication Critical patent/CN117887665A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/91—Cell lines ; Processes using cell lines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种绵羊永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞系及其构建方法，本发明通过sTERT永生化工具质粒和CRISPR系统成功构建了永生化肺泡细胞株sTERT‑ATⅡ；本发明sTERT‑ATⅡ相比原代肺泡细胞sATⅡ，表现出较强的增殖活性和生长能力，且不具有成瘤风险；同时，本发明构建的永生化肺泡细胞sTERT‑ATⅡ基本保持了肺泡细胞的特性。

Description

一种绵羊永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞系及其构建方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种绵羊永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞系及其构建方法。
背景技术
肺泡上皮由Ⅰ型和Ⅱ型2种细胞组成。Ⅰ型肺泡细胞扁平，光滑，细胞数量比Ⅱ型细胞少，无增殖能力。Ⅱ型肺泡上皮细胞(Alveolar typeⅡcell，ATⅡcell)呈立方形，分泌的表面活性物质能降低肺泡表面张力、维持肺泡稳定性、保持肺顺应性；胚胎期ATⅡ细胞分化延迟引起表面活性物质缺乏可致呼吸窘迫综合征；ATⅡ细胞还参与物质代谢、免疫调节、水和电解质的转运等，与肺组织的各项功能密切相关。病理条件下，ATⅡ细胞的减少可致成纤维细胞增生并进一步纤维化，甚至引起ATⅡ细胞和无纤毛细支气管上皮细胞(Clara cell)不同程度增生、癌变。
绵羊肺腺瘤病(Ovine pulmonary adenomatosis，OPA)即表现为ATⅡ细胞和Clara细胞肿瘤性腺泡样增生。Kikkawa在1974年分离了ATⅡ细胞，之后，不同动物ATⅡ细胞的分离纯化方法不断更新。但原代绵羊ATⅡ细胞细胞体外增殖慢，细胞量获取有限。同时体外长期培养细胞易发生自行分化，反复冻存复苏后也会影响其增殖活性。
细胞永生化技术目前已经十分成熟，应用于各个细胞，为成功构建细胞系的有效方法。永生化后细胞增殖活性大大提高，使扩增变得相对较容易，而且永生化后的细胞具有相对稳定的生物学特性，对于该细胞后续研究提供高效而稳定的重要手段。研究表明，hTERT是最常用的永生化因子之一，可通过向原代培养的细胞中人为引入hTERT基因诱导细胞发生永生化，得到能在体外长期培养的细胞株，而mTERT不具备这一功能。然而，对于非人源的原代细胞，hTERT作为异源物种的基因，具有潜在的风险。因此，近年来已有利用动物自身的TERT来实现本物种细胞永生化的研究，如Takenouchi等人(Takenouchi et al.2017)利用猪的TERT基因配合SV40 LT实现了猪巨噬细胞的永生化，Wang等人(Wang et al.2017)利用逆转录病毒向鸡前脂肪细胞中引入鸡TERT基因进而实现其永生化。相比之下，目前针对羊TERT(sheep TERT，sTERT)的研究主要集中于其在卵母细胞成熟和早期胚胎发育调控中的作用，还未有在建立永生化细胞系方面的报道。此外，在端粒生物学上，羊和人具有诸多相似之处，包括TERT蛋白的表达模式以及基因序列的同源性等。这些都提示sTERT或许与hTERT类似，均能在体外重构端粒酶活性以及维持端粒长度，可以作为永生化因子刺激细胞增殖并延长体外培养细胞的寿命。
因此，构建一种新的绵羊永生化Ⅱ型肺泡上皮细胞系有望为研究绵羊肺腺瘤提供新工具。
发明内容
本发明提出了提高蛋白质的编码基因表达的物质在下任一种中的应用；
A1)提高永生化细胞增殖活性中的应用和/或制备提高永生化细胞增殖活性产品中的应用；
A2)提高永生化细胞生长能力中的应用和/或制备提高永生化细胞生长能力产品中的应用；
A3)减少或消除永生化细胞成瘤率中的应用和/或制备减少或消除永生化细胞成瘤率产品中的应用；
所述蛋白为如下任一种蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列SEQ ID NO：12所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
SEQ ID NO：12所示的蛋白质的氨基酸序列为：
MPRAPRCRAVRALLRASYRQVLPLAAFVRRLRPQGRRLVRRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDAQPPPAAPSFRQVSCLKELVARVVQRLCERGARNVLAFGFTLLAGARGGPPVAFTTSVRSYLPNTVTDTLRGSGAWGLLLRRVGDDVLTHLLSRCALYLLVPPTCAYQVCGPPLYDLRAAAAPRPTRQVGGTRAGFGLPRPASSNGGHGEAGAPLEARAQGARRRRGSARGRLPPAKRPRRGLEPGRDLEGQLARGPPRVVTPTRDAVEAESREGNVPGPCRPFLGGDRGVSSASWRLSPPEGERGAGACAETKRFLYCSGGGEQLRRSFLLCSLPPSLAGARTLVETIFLDSKPGQPGAPRRPRRLPARYWQMRPLFRKLLGNHARCPYGALLRAHCPLPASAPPAGPGHQKRPDAGGCPSERPAAAPEGEASSGRLVQLLRQHSSPWQVYGLLRACLRRLVPAGLWGSRHNERRFLRNVKKLLSLGKHGRLSQQELTWKMKVQDCAWLRASPGACRVPAAEHRRREAVLGRFLRWLMGAYVVELLRGFFYVTETTFQKNRLFFFRKRVWSQLQRLGVRQHLERVRLRELSEAEVRQHQEARPALLTSRLRFVPKPGGLRPIVNVGCVEGAPAPPRDKKVQHLSSRVKTLFAVLNYERARRPGLLGASVLGMDDIHRAWRAFVLPLRARGPAPPLYFVKADVVGAYDALPQDRLAEVIANVLQPQENTYCVRRCAVVRTARGRVCKSFRRHVSTFSDFQPYLRQLVEHLQVMGSLRDAVVIEQSCSLNEPGSSLFNLFLHLVRSHVIRIGGRSYIQCQGIPQGSILSTLLCSFCYGDMENKLFPGVQQDGVLLRLVDDFLLVTPHLTRATDFLRTLVRGVPEYGCQVNLRKTVVNFPVEPGALGGVAPLQLPAHCLFPWCGLLLDTRTLEVHGDHSSYARTSIRASLTFTQGFKPGRNMRRKLLAVLQLKCHGLFLDLQVNSLQTVFTNVYKIFLLQAYRFHACVLQLPFSQPVGSSPAFFLQVIMDTASRGYTLLKARNAGASLGARGASGLFPSEAAHWLCLHAFLHKLARHRATYSRLLGALR TAQARLHRQLPGPTRAALEAAANPAVTADFKTILD。
编码SEQ ID NO：12所示的蛋白质的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，SEQID NO：13所示的核苷酸序列为：
GCGCGGACCCCTGCTCCTCCGCGCGATGCCGCGCGCGCCCAGGTGCCGGGCGGTGCGCGCCCTCCTGCGGGCCAGCTACCGGCAGGTGCTGCCCCTGGCCGCCTTCGTACGGCGCCTGCGGCCCCAGGGCCGCCGGCTTGTGCGGCGCGGGGACCCGGCGGCCTTCCGCGCGCTCGTGGCGCAGTGCTTGGTGTGCGTGCCCTGGGACGCGCAGCCGCCCCCTGCCGCCCCGTCCTTCCGCCAGGTGTCCTGCCTGAAGGAGCTGGTGGCCAGAGTCGTGCAGAGGCTCTGCGAGCGCGGCGCGAGGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCACGCTGCTGGCCGGGGCCCGCGGCGGGCCGCCCGTGGCCTTCACGACCAGCGTGCGCAGCTACCTGCCCAACACGGTCACCGACACGCTGCGCGGCAGCGGCGCCTGGGGGCTGCTGCTGCGCCGCGTGGGCGACGACGTGCTCACCCACCTGCTCTCGCGCTGCGCGCTCTACCTGCTGGTGCCCCCTACCTGCGCCTACCAGGTGTGTGGGCCGCCGCTCTACGACCTCCGCGCCGCCGCCGCTCCTCGGCCCACGCGGCAAGTGGGCGGGACCCGGGCGGGCTTCGGACTCCCGCGCCCGGCCTCGTCGAACGGCGGCCACGGGGAGGCCGGGGCACCCCTGGAGGCGCGGGCCCAGGGCGCGAGGCGGCGTCGGGGCAGCGCGCGAGGACGACTGCCTCCAGCCAAGAGGCCCAGGCGCGGCCTGGAGCCCGGGCGGGATCTCGAAGGGCAGCTGGCCCGCGGCCCGCCCCGCGTGGTGACACCTACCCGAGACGCTGTGGAAGCCGAGTCTCGGGAGGGCAACGTGCCCGGGCCCTGCCGCCCCTTTCTGGGCGGCGACCGGGGTGTCAGCTCCGCGTCCTGGCGGCTGTCACCCCCAGAGGGCGAGCGGGGTGCCGGAGCGTGCGCTGAGACCAAGCGGTTCCTCTACTGCTCCGGAGGCGGCGAACAGCTGCGCCGCTCCTTCCTGCTCTGCTCCCTGCCTCCGAGCCTGGCCGGGGCGCGGACACTCGTGGAAACCATCTTTCTGGACTCGAAGCC CGGGCAGCCAGGGGCTCCCCGCCGGCCGCGCCGCCTGCCCGCGCGCTACTGGCAGATGCGGCCCCTGTTCCGGAAGCTGCTTGGGAACCACGCGCGGTGCCCCTATGGCGCGCTGCTCAGGGCGCACTGCCCGCTGCCGGCCTCTGCGCCCCCGGCGGGGCCAGGCCATCAGAAGCGCCCTGACGCGGGCGGCTGCCCCTCGGAGAGGCCGGCGGCTGCTCCCGAGGGCGAGGCGAGCTCGGGGCGCCTGGTCCAGCTGCTCCGCCAGCACAGCAGCCCCTGGCAGGTGTACGGCCTCCTGCGGGCCTGTCTTCGCCGCCTGGTGCCCGCCGGCCTCTGGGGCTCCCGGCACAACGAGCGGCGCTTCCTGCGGAACGTGAAGAAGCTCCTCTCCCTGGGGAAGCACGGCAGGCTCTCGCAGCAGGAGCTCACGTGGAAGATGAAGGTGCAGGACTGCGCGTGGCTGCGCGCGAGCCCAGGGGCTTGCCGCGTGCCTGCCGCAGAGCACCGCCGGCGGGAGGCCGTCCTGGGCCGCTTCCTGCGCTGGCTGATGGGCGCCTACGTGGTGGAGCTGCTCAGGGGCTTCTTCTACGTCACGGAGACCACGTTCCAGAAGAACCGGCTCTTCTTCTTCCGGAAGCGCGTCTGGAGCCAGCTGCAGCGCCTGGGCGTCAGACAACACCTGGAGCGTGTGCGGCTTCGAGAGCTGTCAGAAGCAGAGGTCAGGCAGCACCAGGAGGCCAGGCCGGCCCTGCTGACGTCCAGGCTCCGTTTCGTCCCCAAGCCCGGCGGGCTGCGGCCCATCGTGAACGTGGGCTGTGT。
优选的，所述蛋白质来源于羊。
本发明还提出了核酸分子在下任一种中的应用；
A1)提高永生化细胞增殖活性中的应用和/或制备提高永生化细胞增殖活性产品中的应用；
A2)提高永生化细胞生长能力中的应用和/或制备提高永生化细胞生长能力产品中的应用；
A3)减少或消除永生化细胞成瘤率中的应用和/或制备减少或消除永生化细胞成瘤率产品中的应用；
所述核酸分子为编码所述蛋白质的核酸分子。
本发明还提出了表达盒在下任一种中的应用；
A1)提高永生化细胞增殖活性中的应用和/或制备提高永生化细胞增殖活性产品中的应用；
A2)提高永生化细胞生长能力中的应用和/或制备提高永生化细胞生长能力产品中的应用；
A3)减少或消除永生化细胞成瘤率中的应用和/或制备减少或消除永生化细胞成瘤率产品中的应用；
所述表达盒含有所述的核酸分子。
本发明还提出了重组载体在下任一种中的应用；
A1)提高永生化细胞增殖活性中的应用和/或制备提高永生化细胞增殖活性产品中的应用；
A2)提高永生化细胞生长能力中的应用和/或制备提高永生化细胞生长能力产品中的应用；
A3)减少或消除永生化细胞成瘤率中的应用和/或制备减少或消除永生化细胞成瘤率产品中的应用；
所述重组载体含有所述的核酸分子或所述表达盒。
本发明还提出了重组微生物在下任一种中的应用；
A1)提高永生化细胞增殖活性中的应用和/或制备提高永生化细胞增殖活性产品中的应用；
A2)提高永生化细胞生长能力中的应用和/或制备提高永生化细胞生长能力产品中的应用；
A3)减少或消除永生化细胞成瘤率中的应用和/或制备减少或消除永生化细胞成瘤率产品中的应用；
所述含重组微生物含有所述的核酸分子、所述表达盒或所述的重组载体。
本发明还提出了一种高增殖活性永生化细胞的构建方法，所述方法包括提高原代细胞中所述蛋白质编码基因的表达量，获得过表达原代细胞，将过表达原代细胞获得高增殖活性永生化细胞。
本发明还提出了一种高生长能力永生化细胞的构建方法，所述方法包括提高目的永生化细胞中所述蛋白质编码基因的表达量，获得高生长能力永生化细胞。
本发明还提出了一种低成瘤率永生化细胞的构建方法，所述方法包括提高目的永生化细胞中所述蛋白质编码基因的表达量，获得低成瘤率永生化细胞。
优选的，所述方法包括提高原代细胞中所述蛋白质编码基因的表达量，获得过表达原代细胞，将过表达原代细胞进行传代，获得高增殖活性永生化细胞。
优选的，所述永生化细胞为永生化的羊sATⅡ细胞。
与现有技术相比，其有益效果在于：
1、本发明所建立的永生化绵羊肺泡Ⅱ型上皮细胞系在国内外未见文献报道；
2、本发明所用的永生化基因为绵羊端粒酶逆转录酶；
3、细胞系建立时在原代细胞上进行基因转染，避免体外传代培养导致肺泡Ⅱ型上皮细胞表型变化，即在细胞仍维持原代表型时完成基因改造；
4、本发明所建立的永生化绵羊肺泡Ⅱ型上皮细胞系为研究呼吸系统的生理和肺炎疾病发病原理提供了独特的细胞模型。
附图说明
图1为绵羊肺泡Ⅱ型上皮细胞sATⅡ的生长状态和形态特征观察结果图；
图2为绵羊sATⅡ碱性磷酸酶(AKP)染色细胞鉴定结果图；
图3为sTERT CDS序列的扩增图，其中，(A)为sTERT CDS区1bp～2324bp扩增图，M为Trans 2K plusⅡDNA Marker；(B)为sTERT CDS区1738bp～3378bp扩增图，M为Trans 2Kplus DNA Marker；(C)为sTERT CDS区1bp～3378bp重叠延伸扩增图，M为Trans 2K plusDNA Marker；
图4为不同物种ROSA26序列比对图；
图5为sTERT-HMEJ供体载体酶切鉴定核酸电泳结果，其中，A为eGFP-P2A-puro-19T经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定结果，M为Trans2K plusⅡDNA Marker，1-3为该中间载体双酶切结果，P为pMD19T(simple)载体骨架；B为sTERT-eGFP-P2Apuro-19T经XbaⅠ酶切鉴定结果，M为Trans 2K plusⅡDNA Marker，1-3为该中间载体单酶切结果，P为eGFP-P2A-puro-19T载体骨架的核酸电泳图；C为CMV-sTERT-eGFP-P2A-puro-19T经SalⅠ酶切鉴定结果，M为Trans1kb DNA Marker，1-3为该中间载体单酶切结果，P为sTERT-eGFP P2A-puro-19T载体骨架的核酸电泳图；D为CMV-sTERT-eGFP-P2A-puro-RA-19T经ClaⅠ酶切鉴定结果，M为Trans1kbDNA Marker，1-3为该中间载体单酶切结果，P为CMV-sTERT-eGFP-P2Apuro-19T载体骨架的核酸电泳图；E为sTERT-HMEJ经PacⅠ酶切鉴定结果，M为Trans 1kb DNAMarker，1-3为该中间载体单酶切结果，P为CMV-sTERT-eGFP-P2A-puro-RA-19T载体骨架的核酸电泳图；
图6为典型的junction PCR结果图；
图7为sTERT-ATⅡ细胞系sTERT表达图；
图8为sTERT-ATⅡ细胞系细胞增殖图；
图9为sTERT-ATⅡ细胞系核型分析图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验材料来源：DMEM高糖培养基、胎牛血清购买于美国Gibco公司；青-链霉素、PEI、分子水(ddH2O)、NucleoZOL购买于美国Invitrogen公司；潮霉素B、DMSO、细胞培养瓶购买于美国Thermo Fisher Scientific公司；SSR41质粒、pCL-Ampho质粒购买于芝加哥大学医学中心分子肿瘤实验室；PC-8(酚抽提试剂、PBS、无水乙醇、甲醛、Blasticidin(BSD)购买于美国Thermo Fisher Scientific公司；引物于美国IDT公司合成；琼脂糖购买于美国Sigma公司；D-Lueiferin购买于美国GBT Gold Biotechnology公司；细胞培养皿购买于美国Corning公司；SYBR Taq购买于美国Bio-Bad公司；MMLV逆转录酶购买于美国New EnglandBiolabs公司。
实施例1
本实验通过绵羊肺泡原代细胞提取培养，观察其形态，并检测其增殖活性及肺泡相关标志物的表达，然后用sTERT永生化工具质粒和CRISPR系统构建永生化绵羊肺泡细胞，对其功能特性进行鉴定，并与原代肺泡细胞进行比较。
1绵羊肺泡细胞原代提取
1.1肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离
实验羊腹腔注射肝素及戊巴比妥钠，(4000u、40mg/kg体质量)。颈动脉放血，颈静脉灌注含肝素的生理盐水冲净全身血液。打开胸腔，用溶液Ⅱ经肺动脉冲洗肺部，经气管插管向肺内通气至肺呈苍白色，取出完整的心肺和气管。依次灌注溶液Ⅰ洗肺泡4次～6次，去除巨噬细胞，再用溶液Ⅱ灌洗2次，至肺中浑浊的液体变成澄清透明。将37℃预温的0.25％胰蛋白酶消化液经气管灌注肺，37℃水浴消化20min。迅速剪碎肺组织，去除结缔组织及支气管，37℃振荡孵育5min，加入5mL胎牛血清终止消化。37℃预温的溶液Ⅲ稀释消化终产物，双层纱布过滤，滤液于4℃下，800r/min离心3min，弃上清，适量溶液Ⅲ轻柔重悬。重悬液经120目和200目滤网过滤，离心弃上清，细胞沉淀用10mLDMEM完全培养液重悬并计数，调节浓度至106个/mL。
1.2IgG黏附及贴壁选择未黏附细胞。
5mL的细胞培养瓶添加1mg山羊IgG，充分溶解于4mLTris缓冲液中(50mmol/L，pH9.3)，置37℃培养3h，DMEM洗涤3次。上述处理的细胞培养瓶加适量DMEM保持瓶底湿润，立即使用。按密度为106个/mL的细胞悬液加入IgG包被的培养瓶中，37℃，5％ CO2孵育2h，移出未黏附细胞。
1.3磁化树脂微粒去除巨噬细胞
上述初步纯化后的未黏附细胞按106个/mL加入培养瓶，每毫升细胞悬液加入10μL无菌的磁化树脂微粒，充分混匀37℃，孵育2h。充分重悬悬浊液，以强力磁铁于培养瓶外，吸附吞噬有磁化树脂微粒的巨噬细胞及残余的磁化树脂微粒，重复吸附多次，倒置显微镜检查，直至无磁化树脂微粒残留。
1.4肺泡Ⅱ型上皮细胞培养
调整细胞密度4×105个/mL转移至培养瓶中，37℃孵育，12h后换液去除未贴壁的细胞。壁贴细胞主要为肺泡Ⅱ型上皮细胞sATⅡ。取少量细胞用台盼蓝进行活力鉴定。继续培养6d～8d，微镜观察细胞生长状态和形态特征，结果如图1所示。
1.5碱性磷酸酶(AKP)染色细胞鉴定
AKP是Ⅱ型细胞分化标记物，文献表明该方法可与电镜观察相媲美。纯化物置有盖玻片的6孔板中培养24h，取出盖玻片，快速风干，按BCIP/NBT试剂盒提供的方法配制AKP孵育液，滴加孵育液于细胞盖玻片上，37℃15min后水洗，核固红复染10min，酒精快速梯度脱水，封片观察，结果如图2所示。
2永生化质粒载体构建
2.1sTERT和mTERTCDS序列的扩增
在NCBI网站上检索获得sTERT的CDS序列(XM_027979953.2)3372bp，分析发现sTERTCDS区序列GC较高，普通的PCR程序难以直接扩增得到。因此，对sTERT的CDS区序列进行分析后将其分为上下两段进行扩增，分别为sTERT1：1bp～2324bp和sTERT2：1738bp～3378bp。设计两对扩增引物，引物需注意上下游GC水平和Tm值尽量接近。以羊睾丸cDNA为模板，第一步先通过PCR的方法得到sTERT1和sTERT2两段序列，第一步中所用的酶为Takara的LAtaq，第二步则将sTERT1和sTERT2两段通过重叠延伸的方法得到完整的sTERT的CDS区片段，sTERT CDS序列的扩增图如图3所示，其中，(A)为sTERT CDS区1bp～2324bp扩增图，M为Trans 2K plusⅡDNA Marker；(B)为sTERT CDS区1738bp～3378bp扩增图，M为Trans2Kplus DNA Marker；(C)为sTERT CDS区1bp～3378bp重叠延伸扩增图，M为Trans 2K plusDNA Marker。
扩增引物为：
sTERT1-F：ATGCCGCGCGCGCCCAGGTGC(SEQ ID NO：1)；
sTERT1-R：GCGTCCCTCAGGGAGCCCAT(SEQ ID NO：2)；
sTERT2-F：CTGGGCGTCAGACAACACTTAGA(SEQ ID NO：3)；
sTERT2-R：TCAGTCCAAGATGGTCTTGAAGTCTGCG(SEQ ID NO：4)。
2.2以p3×Flag-CMV-10作为骨架载体的sTERT真核表达载体的构建
将2.1中扩增得到的sTERT的CDS片段以及pC1-neo-hTERT质粒作为模板，分别设计引物引入相应的酶切位点进行PCR，随后通过琼脂糖凝胶核酸电泳分离目的条带并切胶回收。将回收得到的目的片段与载体骨架p3×Flag-CMV-10分别于37℃酶切过夜，随后再进行一次核酸电泳后回收目的条带。将酶切回收后的片段和骨架载体4℃过夜连接，转化DH5α感受态，涂于氨苄青霉素抗性的固体LB培养板上并于37℃培养14h。挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素的液体LB中，37℃摇床中震荡培养14～16h，提取质粒。利用双酶切对重组质粒进行鉴定后，送北京擎科生物技术公司测序，挑选成功连接的重组质粒扩大培养，去内毒提取后于-20℃留存备用。
引物：
3F-sTERT-F：CCCAAGCTTATGCCGCGCGCGCCCAGGTGC(SEQ ID NO：5)；
3F-sTERT-R：CCCAAGCTTTCAGTCCAAGATGGTCTTGA(SEQ ID NO：6)。
2.3CRISPR/Cas9介导sTERT精确整合打靶位点的筛选
利用CRISPR/Cas9介导永生化因子精确整合的方式构建永生化细胞系不仅需要考虑引入的永生化因子，还需要考虑到插入位点两侧的基因对外源引入的永生化因子的影响。因此，本研究选择羊安全港位点sROSA26作为打靶基因座。通过将人、猪、鼠和兔ROSA26的启动子与第一外显子输入Ensembl在线网站中，与羊的全基因组序列进行比对，发现牛ROSA26的启动子和第一外显子区域且与其他物种高度相似，暗示了bROSA26位点能与其他物种ROSA26位点一样用于基因的安全敲入。因此本研究选择sROSA26基因座的第一内含子区作为打靶区域，利用sgRNA筛选网站CHOPCHOP对打靶位点进行初步的预测，总计输出103个打靶位点。随后，本研究选择利用Cas-OFFinder对这些打靶位点的潜在的脱靶位点进行预测，并对输出的脱靶位点进行统计。理想的打靶位点应当是效率高且潜在脱靶位点尽量少。
Rosa26位点又称为安全港(Safe Harbor)位点，在该位点进行外源基因敲入不仅对细胞及宿主的健康无副作用，同时还能保证外源整合基因的正常表达(Sadelain etal.2011)。在人(Irion et al.2007)和包括小鼠(Zambrowicz et al.1997)、大鼠(Kobayashi et al.2012)、牛(Yuan et al.2021)、猪(Li et al.2014b)在内的哺乳动物上均已实现在此位点靶向插入外源基因，进而实现外源基因的稳定表达。Hu等人(Hu etal.2017)报道称利用CRISPR/Cas9介导SV40 LT基因精确整合到小鼠Rosa26位点可获得可逆永生化的BMSCs细胞。在最近的研究中，已有利用基于HMEJ的CRISPR/Cas9系统向牛ROSA26位点插入NRAMP1基因，从而高效生产抗结核转基因牛的报道(Yuan et al.2021)。因此，为了保证基因组的完整性，获得安全且稳定表达sTERT的永生化细胞系，我们选择通过CRISPR/Cas9系统将sTERT基因精确插入到羊源细胞的基因组上，并选定羊的ROSA26位点作为打靶位点。由于Rosa26位点启动子区域在人、猪、鼠和兔中是高度保守的，因此将这四个物种的Rosa26启动子与第一外显子基因组序列作为模板，与羊全基因组序列进行比对，定位到羊基因组19号染色体的区域。随后，将我们获得的羊ROSA26位点的启动子与第一外显子序列与人、猪、鼠、兔的序列进行进一步对比，结果如图4所示，我们发现ROSA26位点的启动子区和第一外显子区在羊与其他几个物种中高度保守。
参考Lai等人(Li et al.2014b)利用CRISPR/Cas9系统在猪ROSA26基因座插入外源基因时选择的打靶区域，与牛ROSA26基因座序列进行比对，我们选用bROSA26位点的第一内含子的部分区域进行打靶位点的设计。将上述序列输入sgRNA筛选网站CHOPCHOP中，以错配数≤3作为约束条件，总共可产生103个打靶位点。本研究从全部的103个可能的打靶位点中挑选出3条sgRNA，综合评估3条sgRNA的活性以及潜在的脱靶位点后，我们选择打靶位点3来进行后续的打靶载体构建，序列为：GTCGAGTCTCGATTATGGGCGGG(SEQ ID NO：7)。
2.4sgRNA真核表达载体与供体载体的构建
根据2.3中筛选得到的sgRNA序列构建CRISPR/Cas9真核表达载体Cas9/sgRNA3-puro。供体载体的构建主要包括细胞筛选标记的克隆、羊TERT基因扩增、CMV启动子的扩增、同源臂与sgRNA序列的克隆4个步骤。
2.4.1细胞筛选标记的克隆
从已有的载体上扩增得到筛选标记SV40 polyA-loxP-EF1α-eGFP-P2A-puro-loxP，并在上下游分别添加构建完整的供体载体所需的酶切位点序列，用于克隆其它元件。正向引物序列中的酶切位点依次为PacⅠ、SalⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、BamHⅠ，反向引物序列中的酶切位点依次为ClaⅠ、HindⅢ。
基于HMEJ的CRISPR/Cas9基因打靶策略，首先尝试在羊原代sATⅡ细胞基因组bROSA26安全港位点定点插入sTERT基因，构建sATⅡ的永生化细胞系。由于该供体载体元件较多且结构复杂，各元件克隆过程对应的酶切连接操作繁多。
2.4.2羊TERT基因的克隆
以2.4.1中扩增得到的sTERT基因cDNA为模板，上下游引物设计XbaⅠ酶切位点。回收目标片段后，与eGFP-P2A-puro-19T用EcoRⅠ进行单酶切处理，分别回收前者的sTERT目的片段以及后者被酶切后的骨架载体，利用T4连接酶连接，将此新的阳性重组载体暂命名为sTERT-eGFP-P2A-puro-19T。
2.4.3CMV启动子的克隆
以pC1-neo载体作为模板，上下游引物设计SalⅠ酶切位点。回收目标片段后，与2.4.2中获得的sTERT-eGFP-P2A-puro-19T用SalⅠ进行单酶切处理，分别回收前者的CMV目的片段以及后者被酶切线性化的骨架载体，利用T4连接酶连接，将此的阳性重组载体暂命名为CMV-sTERT-eGFP-P2A-puro-19T。
2.4.4同源臂序列的克隆
以sATⅡ基因组为模板，左同源臂上游引物和右同源臂下游引物两侧携带sgRNA序列，分别扩增羊ROSA26打靶位点上游800bp序列和下游800bp序列作为左侧同源臂(LeftArm，LA)和右侧同源臂(Right Arm，RA)，其中延伸时间为1min。分别回收LA和RA的目标片段，末端加A处理，随后A-T连接至pMD19T(simple)载体，转化涂板挑取细菌单克隆送北京擎科生物技术公司测序。将测序正确的LA和RA的阳性重组子分别命名为LA-19T和RA-19T，留存备用。将RA-19T与CMV-sTERT-eGFP-P2A-puro-19T载体进行ClaⅠ的单酶切处理，利用T4连接酶连接，转化涂板挑取细菌单克隆送北京擎科生物技术公司测序，将此的阳性重组载体暂命名为CMV-sTERT-eGFP-P2A-puro-RA-19T。将LA-19T与CMV-sTERT-eGFP-P2A-puro-RA-19T载体进行PacⅠ的单酶切处理，利用T4连接酶连接，转化涂板挑取细菌单克隆送北京擎科生物技术公司测序，测序正确的阳性重组载体为供体载体sTERT-HMEJ打靶载体。
供体载体sTERT-HMEJ打靶载体含有以下顺次排列的元件：sgRNA、LA左同源臂、CMV启动子、sTERT ORF、SV40 polyA、上游loxP、EF1α启动子、eGFP荧光报告基因、P2A、puro抗性(抗嘌呤霉素)基因ORF、SV40 polyA、下游loxP、RA右同源臂、sgRNA和pMD19T(simple)骨架载体。sTERT-HMEJ供体载体酶切鉴定核酸电泳结果如图5所示，其中，A为eGFP-P2A-puro-19T经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定结果，M为Trans 2K plusⅡDNA Marker，1-3为该中间载体双酶切结果，P为pMD19T(simple)载体骨架；B为sTERT-eGFP-P2Apuro-19T经XbaⅠ酶切鉴定结果，M为Trans 2K plusⅡDNA Marker，1-3为该中间载体单酶切结果，P为eGFP-P2A-puro-19T载体骨架的核酸电泳图；C为CMV-sTERT-eGFP-P2A-puro-19T经SalⅠ酶切鉴定结果，M为Trans 1kb DNA Marker，1-3为该中间载体单酶切结果，P为sTERT-eGFP P2A-puro-19T载体骨架的核酸电泳图；D为CMV-sTERT-eGFP-P2A-puro-RA-19T经ClaⅠ酶切鉴定结果，M为Trans1kb DNA Marker，1-3为该中间载体单酶切结果，P为CMV-sTERT-eGFP-P2Apuro-19T载体骨架的核酸电泳图；E为sTERT-HMEJ经PacⅠ酶切鉴定结果，M为Trans 1kb DNAMarker，1-3为该中间载体单酶切结果，P为CMV-sTERT-eGFP-P2A-puro-RA-19T载体骨架的核酸电泳图。
3CRISPR/Cas9介导永生化电转染
由于脂质体对原代胎儿成纤维细胞的毒性较大，因此针对原代sATⅡ，我们选择电转染的方法。具体转染步骤如下：首先用PBS漂洗电转杯两遍，再用电转缓冲液漂洗一遍，置于超净工作台中备用；随后将汇合度达到90％的细胞中的培养液弃去，加适量0.25％的胰酶于37℃培养箱中消化2～3min，加等量的DMEM/F12培养液终止消化，用移液枪将细胞轻柔吹起后加入无菌EP管中1000rpm离心5min；配制含25％Opti-MEM、75％电转缓冲液和适量去内毒质粒的电转工作液，吹打混匀备用；细胞离心完毕后弃去上清，加入1mlOpti-MEM清洗一遍，再次离心；弃去上清，加入电转工作液重悬细胞，后将细胞悬液加入电转杯中，过程尽量减少气泡的产生，于冰上静置10min；使用BTXECM2001电转仪进行电穿孔，条件为电压510V，2ms，两次脉冲；将电转杯再次置于冰上静置10min，期间将DMEM/F12培养液加入细胞培养皿中，随后将悬液轻柔加入到培养皿中，37℃5％ CO2培养箱中培养用于后续实验。
4慢病毒载体构建与慢病毒包装感染
4.1慢病毒载体构建
本研究中慢病毒包装感染使用pLenti-puro、psPAX2和pMD2.G系统，分别利用EcoRⅠ单酶切将sTERT基因克隆进入pLenti-puro骨架载体中。
4.2慢病毒包装
将测序正确的pLenti-sTERT-puro重组表达载体、包装与传递载体psPAX2和pMD2.G共同转染到HEK-293T细胞中，三个载体的转染比例为pLentisTERT/hTERT-puro：psPAX2：pMD2.G＝4：3：1，具体转染步骤参考Lipofectamine2000脂质体转染试剂说明书。转染8h后更换为新鲜的DMEM/F12培养液，继续于37℃5％ CO2培养箱中培养48h。观察到培养液变为橙黄色后，收集培养液上清，1500rpm离心5min去除培养液中多余的细胞碎片，随后用0.44μm的滤器过滤，分装后长期保存于-80℃，切勿反复冻融降低病毒滴度，进而影响感染效率。
4.3慢病毒感染sATⅡ细胞
本研究中选用原代sATⅡ作为慢病毒感染的目标细胞。待sATⅡ细胞生长汇合度达到80％时，吸去培养液上清，将4.2中收取的病毒上清与新鲜DMEM/F12培养液等体积混合后加入细胞培养皿中。37℃5％CO2培养箱中培养24h后，弃去含病毒的培养液上清。用PBS轻柔漂洗细胞两次，加入普通的新鲜DMEM/F12培养液，继续于37℃5％ CO2培养箱中培养，用于后续实验。慢病毒包装和感染步骤需做好防护，所有使用过的枪头器皿和产生的废液垃圾等需用巴氏消毒液浸泡30min以上。
5细胞筛选及鉴定
5.1瞬时转染细胞克隆的筛选及鉴定
转染pC1-sTERT-neo后的sATⅡ细胞培养36h后，添加含800μg/mlG418的DMEM/F12培养液筛选两天。待观察到细胞培养皿中的细胞基本呈单个分布，撤去含G418的筛选培养液，换为普通新鲜DMEM/F12培养液继续培养即可。由于瞬时转染的质粒无法长时间在细胞中维持表达，因此我们认为经过G418筛选的细胞即为转染成功的细胞，不额外进行鉴定。
5.2慢病毒感染细胞克隆的筛选及鉴定
将4中慢病毒载体构建与慢病毒包装感染中包装得到的含sTERT的病毒上清感染sATⅡ细胞，继续培养48h后，将培养液更换为含2μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培养液筛选一天，随后换为含1μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培养液继续筛选7到10天，直到在细胞培养皿中能观察到针尖大小的细胞克隆。在体视显微镜下挑取细胞单克隆于48孔板中，扩大培养。当细胞扩增至6孔板中时，收取细胞蛋白，Westernblot检测整合到sATⅡ基因组上的sTERT的蛋白水平。
5.3CRISPR/Cas9介导基因整合的细胞克隆的筛选及鉴定
将2.2中构建的CRISPR/Cas9真核表达载体和供体载体以1：1的比例利用电转染的方法转入原代sATⅡ细胞中，继续培养36～48h后，观察细胞汇合度达到80％～90％，将培养液更换为含终浓度为1.5μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培养液筛选两天，随后用含1μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培养液筛选十天，挑取单克隆细胞进行junctionPCR鉴定，产物长度为1316bp，上游引物Lj-F序列与左侧同源臂上游基因组序列结合，下游引物Rj-R序列与供体载体上CMV启动子序列区域匹配，junction PCR鉴定结果如图6所示。
JunctionPCR引物序列为：
Lj-F：CGGCGCGAGCTGCAATCCTGAGG(SEQ ID NO：8)；
Lj-R：TCCCACCGTACACGCCTACC(SEQ ID NO：9)；
Rj-F：ATCCACCGGATCTAGATAACTGATC(SEQ ID NO：10)；
Rj-R：GGAGTTGGATCGGTTACTTCCAT(SEQ ID NO：11)。
其中，5’-junction上游引物Lj-F匹配5’端同源臂上游基因组，下游引物Lj-R匹配打靶载体上CMV启动子序列；3’-junction上游引物Rj-F匹配打靶载体上puro后的SV40polyA序列，下游引物Rj-R匹配3’同源臂下游的基因组。只有同时通过了5’端和3’端junctionPCR鉴定的克隆才会扩大培养，用于后续的实验检测。随后回收两轮junction PCR扩增得到的产物，分别连接pMD19T(simple)载体，送北京擎科生物技术公司测序。保留两轮PCR鉴定均正确的克隆，继续扩大培养并传代，检测是否实现了永生化。
永生化羊sATⅡ细胞系的鉴定：
(1)sTERT-ATⅡ永生化细胞系中sTERT表达检测
为了进一步验证利用CRISPR/Cas9系统精确整合到基因组上的sTERT在永生化的sATⅡ中是否稳定表达，我们利用RT-PCR检测了第30代的sTERT-ATⅡ中sTERT基因的表达水平。结果表明，在原代sATⅡ细胞中，sTERT的内源表达量很低；而在sTERT-ATⅡ中，我们检测到sTERT的高水平表达，结果如图7所示。
(2)原代sATⅡ和永生化sTERT-ATⅡ的增殖速率
我们选择了三个sTERT-ATⅡ永生化细胞系进行检测，同时以原代sATⅡ细胞作为对照，连续检测一周内的细胞增殖速率。结果发现三个独立的sTERT-ATⅡ永生化细胞系的增殖速率均快于原代sATⅡ细胞，结果如图8所示。
6不同永生化策略效率统计
本研究中比较的永生化策略总共是3种，即分别利用瞬时转染、慢病毒感染、CRISPR/Cas9系统介导的基因精确整合三种不同的手段将永生化因子sTERT呈递入原代sATⅡ细胞内，用嘌呤霉素筛选细胞。将鉴定正确的克隆继续培养，以细胞扩大培养至60mm细胞皿时作为第一代，当细胞传代至五十代且细胞性质未发生变化，则认为其实现了永生化。统计每种永生化策略得到的细胞克隆数目与传代次数。利用瞬时转染和慢病毒感染的永生化策略的初始克隆数为经过嘌呤霉素筛选后得到的所有克隆数，利用CRISPR/Cas9系统介导的永生化策略的初始克隆数为经过嘌呤霉素筛选随后junctionPCR鉴定正确的克隆数。
利用CRISPR/Cas9系统介导的稳定整合了sTERT基因的阳性sATⅡ克隆在体外继续培养传代，当在体外连续传代数达到30代即被认为实现了永生化。为了进一步验证本研究建立的永生化策略在实现羊细胞永生化上的优势，我们将其与传统的永生化策略进行了比较。我们通过CRISPR/Cas9系统介导的精确插入、慢病毒介导的稳定整合和瞬时转染三种手段将sTERT引入sATⅡ细胞，对获得永生化细胞的效率进行比较。在原代细胞起始细胞量一致的情况下(8×105个细胞)，采用瞬时转染的方法引入TERT基因后，sATⅡ很难实现永生化，其中瞬时转染sTERT的原代细胞体外培养代数不超过15代。利用慢病毒系统分别介导sTERT基因稳定整合到基因组上，sATⅡ细胞实现永生化的效率较低，体外培养代数对于瞬时转染方法而言有所延长，但多数不超过30代，三次独立实验中实现永生化的细胞克隆数分别为2个、3个、4个。而采用基于HMEJ途径的CRISPR/Cas9系统介导sTERT精确整合到基因组中后，sATⅡ细胞能够高效实现永生化，三次独立实验中实现永生化的细胞克隆数分别为7个、5个、9个。
7EdU细胞增殖检测
为了进一步检测sTERT-ATⅡ细胞系的染色体核型是否发生了紊乱，我们对连续培养80代的sTERT-ATⅡ细胞的染色体核型进行了分析。参考Beyotime BeyoClickTM EdUCell Proliferation Kit with Alexa Fluor488说明书对细胞进行染色，最后用荧光倒置显微镜检测拍照。
实验中分别统计了3次独立实验获得的永生化sTERT-ATⅡ克隆以及原代sATⅡ细胞中期染色体组的染色体数目，结果显示3组sTERT-ATⅡ永生化细胞的核型均正常，染色体数目与原代sATⅡ细胞一致，为2N＝56条，结果如图9所示。
综上，本发明通过sTERT永生化工具质粒和CRISPR系统成功构建了永生化肺泡细胞株sTERT-ATⅡ。sTERT-ATⅡ相比原代肺泡细胞sATⅡ，表现出较强的增殖活性和生长能力，且不具有成瘤风险。同时，本发明构建的永生化肺泡细胞sTERT-ATⅡ基本保持了肺泡细胞的特性。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.提高蛋白质的编码基因表达的物质在下任一种中的应用；
A1)提高永生化细胞增殖活性中的应用和/或制备提高永生化细胞增殖活性产品中的应用；
A2)提高永生化细胞生长能力中的应用和/或制备提高永生化细胞生长能力产品中的应用；
A3)减少或消除永生化细胞成瘤率中的应用和/或制备减少或消除永生化细胞成瘤率产品中的应用；
所述蛋白为如下任一种蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列SEQ ID NO：12所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于羊。
3.核酸分子在下任一种中的应用；
A1)提高永生化细胞增殖活性中的应用和/或制备提高永生化细胞增殖活性产品中的应用；
A2)提高永生化细胞生长能力中的应用和/或制备提高永生化细胞生长能力产品中的应用；
A3)减少或消除永生化细胞成瘤率中的应用和/或制备减少或消除永生化细胞成瘤率产品中的应用；
所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
4.表达盒在下任一种中的应用；
A1)提高永生化细胞增殖活性中的应用和/或制备提高永生化细胞增殖活性产品中的应用；
A2)提高永生化细胞生长能力中的应用和/或制备提高永生化细胞生长能力产品中的应用；
A3)减少或消除永生化细胞成瘤率中的应用和/或制备减少或消除永生化细胞成瘤率产品中的应用；
所述表达盒含有权利要求3所述的核酸分子。
5.重组载体在下任一种中的应用；
A1)提高永生化细胞增殖活性中的应用和/或制备提高永生化细胞增殖活性产品中的应用；
A2)提高永生化细胞生长能力中的应用和/或制备提高永生化细胞生长能力产品中的应用；
A3)减少或消除永生化细胞成瘤率中的应用和/或制备减少或消除永生化细胞成瘤率产品中的应用；
所述重组载体含有权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述表达盒。
6.重组微生物在下任一种中的应用；
A1)提高永生化细胞增殖活性中的应用和/或制备提高永生化细胞增殖活性产品中的应用；
A2)提高永生化细胞生长能力中的应用和/或制备提高永生化细胞生长能力产品中的应用；
A3)减少或消除永生化细胞成瘤率中的应用和/或制备减少或消除永生化细胞成瘤率产品中的应用；
所述含重组微生物含有权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述表达盒或权利要求5所述的重组载体。
7.一种高增殖活性永生化细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括提高原代细胞中权利要求1或2所述蛋白质编码基因的表达量，获得过表达原代细胞，将过表达原代细胞获得高增殖活性永生化细胞。
8.一种高生长能力永生化细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括提高目的永生化细胞中权利要求1或2所述蛋白质编码基因的表达量，获得高生长能力永生化细胞。
9.一种低成瘤率永生化细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括提高目的永生化细胞中权利要求1或2所述蛋白质编码基因的表达量，获得低成瘤率永生化细胞。
10.根据权利要求7-9任一项所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括提高原代细胞中权利要求1或2所述蛋白质编码基因的表达量，获得过表达原代细胞，将过表达原代细胞进行传代，获得高增殖活性永生化细胞。
CN202311777831.5A 2023-12-22 2023-12-22 一种绵羊永生化ⅱ型肺泡上皮细胞系及其构建方法 Pending CN117887665A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311777831.5A CN117887665A (zh) 2023-12-22 2023-12-22 一种绵羊永生化ⅱ型肺泡上皮细胞系及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311777831.5A CN117887665A (zh) 2023-12-22 2023-12-22 一种绵羊永生化ⅱ型肺泡上皮细胞系及其构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117887665A true CN117887665A (zh) 2024-04-16

Family

ID=90649863

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311777831.5A Pending CN117887665A (zh) 2023-12-22 2023-12-22 一种绵羊永生化ⅱ型肺泡上皮细胞系及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117887665A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5345391B2 (ja) ヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクター及びヒト人工染色体（ｈａｃ）ベクターを有するヒト細胞医薬
CN114231533B (zh) 一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法
EA028902B1 (ru) Способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и дифференцированных клеток
CN101413012B (zh) 诱导间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法及其应用
WO2019154437A1 (zh) CRISPR/Cas9载体组合及其在基因敲除中的应用
CN101497872A (zh) 诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法及专用培养基
WO2022012512A1 (zh) 敲除猪异种抗原的基因的gRNA及其应用
CN114480457A (zh) 一种基于pCAG-flox-neo载体的高效稳定的定点整合基因敲入方法
CN117417964A (zh) 一种绵羊乳腺上皮细胞系及其构建方法、用途
CN117887665A (zh) 一种绵羊永生化ⅱ型肺泡上皮细胞系及其构建方法
Demello et al. Generation and characterization of a conditionally immortalized lung clara cell line from the H-2Kb-tsA58 transgenic mouse
EP4079765A1 (en) Fusion protein that improves gene editing efficiency and application thereof
CN115786237A (zh) 一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法
US20210386915A1 (en) Compositions and methods for airway tissue regeneration
CN104726490A (zh) 表达人血清白蛋白的靶向载体及其构建方法
CN114934066A (zh) 石骨症的基因编辑体系及其应用
Mizuno et al. Successful culture and sustainability in vivo of gene-modified human oral mucosal epithelium
WO2024183423A1 (zh) CRISPR/Cas9-gRNA打靶质粒、供体质粒以及永生化小鼠细胞系的制备方法
CN112646780A (zh) 一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞
CN114196703B (zh) 一种提高牦牛克隆胚胎发育率的载体、细胞和方法
CN114807011B (zh) 一种暗纹东方鲀精巢细胞系及其构建方法和应用
CN113999816B (zh) 一种表达hoxa10的人脐带间充质干细胞系及其制备方法和应用
CN116064660B (zh) 绵羊诱导性多能干细胞及其制备方法
JP2018201499A (ja) 安全性と抗炎症作用を高めた間葉系幹細胞
CN116445528B (zh) 重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法及其感染性克隆和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination