CN117417964A - 一种绵羊乳腺上皮细胞系及其构建方法、用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞工程技术和细胞生物学领域，具体涉及一种绵羊乳腺上皮细胞系及其构建方法、用途。该构建方法保包括以下步骤：取绵羊离体乳房组织，分离培养并纯化后得到绵羊原代乳腺上皮细胞；传代培养绵羊原代乳腺上皮细胞，待培养至至少F2代时，用携带SV40large T抗原的病毒侵染绵羊原代乳腺上皮细胞，得到绵羊乳腺上皮细胞系。利用该方法构建得到的绵羊乳腺上皮细胞系具有稳定无限传代的功能，且能维持奶绵羊乳腺上皮细胞的特性。

Description

一种绵羊乳腺上皮细胞系及其构建方法、用途
技术领域
本发明属于细胞工程技术和细胞生物学领域，具体涉及一种绵羊乳腺上皮细胞系及其构建方法、用途。
背景技术
羊奶产品是重要的优质蛋白来源之一，但是目前羊奶产量的市场供需严重不平衡，因此，提高奶产品产量及质量对提高人民生活水平有重要意义。近年来，羊奶凭借其丰富的营养价值和优良特性逐渐成为人们补充蛋白质的选择之一。与山羊奶相比，绵羊奶营养价值更高，总固形物在各种乳源中含量也最高，除了具有较高含量的蛋白质、脂肪、矿物质和维生素以外，绵羊奶还具有许多独特的活性功能因子。目前，我国的绵羊品种主要包括小尾寒羊、滩羊、湖羊等，但是本土的绵羊产奶量较低、产奶时间短。为此，我国引进了优质奶绵羊品种：东佛里生奶绵羊，并且与本地的湖羊杂交，培育出优良的乳肉兼用的东湖杂交奶绵羊。但是目前我国的奶绵羊产业整体水平还处在初级阶段，与奶绵羊泌乳相关的研究还不充分，而在奶绵羊泌乳的研究过程中，乳腺上皮细胞是必不可少的实验材料，一般情况下，其获取来源主要是泌乳高峰期健康的奶绵羊乳腺组织。而此类实验材料的获取过程繁琐、成本高，获取的乳腺上皮细胞还存在传代次数有限的问题，不利于促进奶绵羊泌乳的相关研究。因此，建立不朽的奶绵羊乳腺上皮细胞系，突破原代乳腺上皮细胞的生理极限，克服终分化，为研究牛奶的生理特性和开发功能性乳制品提供了方便的体外生物学模型，具有重要的价值。
将SV40(猿猴液泡化病毒40)感染原代细胞，从而激活端粒酶活性，将病毒整合到细胞基因组中进行永久表达，实现细胞永生。这是一种常见的永生化原代细胞的方式，也是最早用于建立人乳腺上皮细胞系的方式。后来，水牛、奶牛、牦牛、山羊、猪的乳腺上皮细胞系的细胞库在体外逐渐有效地建立，但是乳腺上皮细胞功能各有不同。目前为止，不同物种的乳腺上皮细胞系的细胞库还未被完全建立完全，尤其是绵羊乳腺上皮细胞系还尚未在体外构建。而且多种乳腺上皮细胞系在后期传代过程中可能存在不稳定、染色体突变、部分上皮细胞功能丧失的情况。因此，在体外构建永生化细胞系的方法还有待改进。
发明内容
为了解决现有技术尚未在体外成功构建绵羊乳腺上皮细胞系的问题，本发明提供一种能稳定传代的分泌型奶绵羊乳腺上皮细胞系和构建方法。本发明所构建的绵羊乳腺上皮细胞系具有稳定无限传代的功能，且能维持绵羊乳腺上皮细胞的特性，能分泌甘油三酯，还具有合成和分泌乳蛋白和脂肪酸的功能；在传代过程中能够保持核型正常，不存在染色体结构和数目的改变，不存在致瘤性。
为了达到上述目的，本发明提供的具体技术方案如下：
本发明第一方面，提供一种绵羊乳腺上皮细胞系的构建方法，包括以下步骤：
取绵羊离体乳房组织，分离培养并纯化后得到绵羊原代乳腺上皮细胞；
传代培养绵羊原代乳腺上皮细胞，待培养至至少F2代时，用携带SV40 large T抗原的病毒侵染绵羊原代乳腺上皮细胞，得到绵羊乳腺上皮细胞系。
优选地，用携带SV40 large T抗原的病毒侵染绵羊原代乳腺上皮细胞的具体操作过程为：
以pLOX-Ttag-iresTK为目标质粒、pMD2.G和psPAX2为慢病毒包装质粒，与转染试剂混合后转染工具细胞，转染16～24h后更换培养基为含HEPES的包毒培养基继续培养，收集上清，浓缩，得到慢病毒；
使用所述慢病毒转染所述绵羊原代乳腺上皮细胞，之后进行传代培养，得到所述绵羊乳腺上皮细胞系。
优选地，pLOX-Ttag-iresTK、pMD2.G和psPAX2的混合质量比为4～6∶1～2∶3～5。
优选地，所述转染试剂为Tuborfect；以转染工具细胞时培养体系的总体积计，每1ml培养体系中添加0.5～2μg质粒、2～9μLTuborfect转染试剂。
优选地，所述工具细胞为HEK-293T细胞。
优选地，所述离体乳房组织取自绵羊泌乳高峰期；如绵羊泌乳高峰期在产后20天到产后4个月。
分离培养绵羊原代乳腺上皮细胞是使用组织块贴壁培养法进行；
纯化绵羊原代乳腺上皮细胞是采用差时消化法或差速贴壁法进行。
优选地，所述差时消化法的具体操作过程为：利用胰蛋白酶消化绵羊原代乳腺上皮细胞，当观察到细胞开始变圆时终止消化，更换培养基继续培养生长，连续操作2～3次；
所述差速贴壁法的具体操作过程为：利用胰蛋白酶消化绵羊原代乳腺上皮细胞，消化4～6min后终止消化，离心，收集沉淀，加入培养基继续培养生长，连续操作2～3次。
本发明第二方面，提供一种根据上述方法构建得到的绵羊乳腺上皮细胞系。
本发明第三方面，提供一种所述绵羊乳腺上皮细胞系在合成和分泌甘油三酯、乳蛋白或脂肪酸中的用途。
本发明第四方面，提供一种所述绵羊乳腺上皮细胞系在作为相关疾病研究的动物模型中的用途。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明提供一种绵羊乳腺上皮细胞系的构建方法，通过该方法构建得到的绵羊乳腺上皮细胞系培养至50代后仍旧传代稳定，且未出现形态分化或衰老情况，在S/G2期分裂加快，染色体数量为27对，纯度为99％以上，能够维持奶绵羊乳腺上皮细胞的特性。
2、本发明构建得到的绵羊乳腺上皮细胞系能合成和分泌甘油三酯，还具有合成和分泌乳蛋白和脂肪酸的功能。
3、本发明构建得到的绵羊乳腺上皮细胞系在传代过程中能够保持核型正常，不存在染色体结构和数目的改变，不存在致瘤性。本发明构建的绵羊乳腺上皮细胞系可作为动物模型，用于相关疾病的研究。
4、本发明在构建过程中使用了差时消化法和差速贴壁法，分离纯化得到较纯的原代乳腺上皮细胞。
附图说明
图1是原代乳腺上皮细胞的F1及F3代细胞形态图；
图2是pLOX-Ttag-iresTK质粒载体；
图3是不同传代T-tag SMECs细胞系的形态；
图4是RT-qPCR分析结果；
图5是Westernblot分析结果；
图6是绵羊原代乳腺上皮细胞的细胞免疫荧光分析结果；
图7是细胞免疫荧光分析绵羊原代乳腺上皮细胞特异性蛋白的表达量；
图8是T-tag SMECs细胞系的细胞免疫荧光分析结果；
图9是T-tag SMECs细胞系特异性蛋白的表达量；
图10是原代乳腺上皮细胞合成和分泌甘油三酯的能力；
图11是T-tag SMECs细胞系合成和分泌甘油三酯的能力；
图12是绵羊原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的生长曲线；
图13是绵羊原代乳腺上皮细胞(A)和T-tag SMECs细胞系(B)的细胞周期检测；
图14是绵羊原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的细胞周期分布；
图15是T-tag SMECs细胞系的染色体核型分析；
图16是T-tag SMECs细胞系的致瘤性检测；A肿瘤形成情况；B、HE染色；
图17是小鼠体重(A)及体内肿瘤形态(B)；
图18是小鼠体内肿瘤重量(A)及细胞划痕试验中迁移面积大小(B)；
图19是细胞划痕试验中细胞迁移状况；图中不同竖排表示3次重复。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。本发明实施例中所使用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例1
原代绵羊乳腺上皮细胞的分离培养
1、原代乳腺上皮细胞的培养液
培养液由DMEM-F12基础培养液、10％FBS、1％青霉素和链霉素、1μg/mL氢化可的松、10ng/mL EGF、5μg/mL胰岛素组成。
2、原代乳腺上皮细胞的分离培养
采集东湖杂交奶绵羊泌乳高峰期的乳房组织样本(在泌乳高峰期的乳腺组织更容易获得具有较好泌乳性能的乳腺上皮细胞，在其他时期获得的乳腺上皮细胞需要在体外进行泌乳过程诱导)，加入75％酒精浸泡消毒，用PBS冲洗干净后，去除脂肪组织和结缔组织，再使用PBS冲洗至溶液不再浑浊。使用组织块贴壁培养法，将采集的乳腺组织剪成糜状置于培养皿上，加入原代乳腺上皮细胞培养液进行培养，待组织块贴壁后，细胞会在组织块周围贴壁生长，当在显微镜下看到细胞铺满皿底90％左右时进行分离培养，具体方法为：移除培养皿中的培养液后，加入2mL PBS冲洗1～2min，重复两次。然后向培养皿中加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，放入37℃、含5％CO2的细胞培养箱中消化4～6min，在显微镜下观察到细胞出现变圆后立即加与消化液等体积的含血清培养基终止消化，收集混合液于10mL离心管中，放入离心机中以1000r/min离心5min，然后弃掉上层液体保留沉淀，加入培养液吹打混匀后，铺于新的培养皿中，每两天更换一次培养液，当细胞再次铺满皿底90％时，进行细胞传代。
实施例2
采用差时消化法纯化原代乳腺上皮细胞，具体操作过程为：
当实施例1中的细胞铺展至皿底约90％时进行传代，根据乳腺上皮细胞对胰蛋白酶的敏感度不同，先向培养皿中加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，消化2～3min，当在显微镜下观察到细胞开始变圆时，终止消化，弃去培养基，再次向皿中加入培养液，放入37℃、含5％CO2的细胞培养箱中继续生长。连续操作2～3次以去除大部分其他细胞，最终获得较纯的乳腺上皮细胞。
实施例3
采用差速贴壁法纯化原代乳腺上皮细胞，具体操作过程为：
待实施例1培养皿中的细胞密度达90％时进行传代，弃去培养基，向培养皿中加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，消化4～6min后终止消化，收集混合液于离心管中，放入离心机中以1000r/min离心5min，然后弃掉上层液体保留沉淀，加入培养液吹打混匀后，铺于新的培养皿中，放入37℃、含5％CO2的细胞培养箱中继续生长，由于成纤维细胞的贴壁速度快于乳腺上皮细胞，因此当大部分成纤维细胞已经贴壁时，乳腺上皮细胞尚未贴壁，仍悬浮在培养液中。培养约6～8小时后，吸取培养皿中的培养液重新铺于新培养皿中，继续培养。连续传代2～3次以去除大部分成纤维细胞，最终可以获得较纯的乳腺上皮细胞。
实施例4
原代乳腺上皮细胞的传代培养
当纯化后的细胞铺满皿底90％左右时，进行传代培养，移除培养皿中的培养液后，加入PBS冲洗1～2min，重复两次。然后向培养皿中加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，消化4～6min，在显微镜下观察到细胞出现变圆后立即加与消化液等体积的原代乳腺上皮细胞的培养液终止消化，收集混合液于10mL离心管中，放入离心机中以1000r/min离心5min，然后弃掉上层液体保留沉淀，加入培养液吹打混匀后，均匀铺于两个新的培养皿中，每两天更换一次培养液，当细胞再次铺满皿底90％时，进行细胞传代。一般情况下，原代乳腺上皮细胞传代数量为一传二，传代周期为3～4天。绵羊原代乳腺细胞实际上是乳腺上皮细胞和成纤维细胞的混合物，生长在组织块周围。成纤维细胞通常呈长纺锤形。在低密度条件下，乳腺上皮细胞形成分散的岛状结构。随着细胞大量增殖，乳腺上皮细胞发育成短梭状或多边形，呈典型的鹅卵石状，直至细胞间距离达到汇合处。经过3次传代纯化后，细长纺锤形细胞基本被清除，残留细胞主要为鹅卵石乳腺上皮细胞，如图1所示。
实施例5
东湖杂交奶绵羊乳腺上皮细胞系的建立
1、永生化慢病毒包装及病毒转导
1.1、材料及主要试剂
纯化后的奶绵羊原代乳腺上皮细胞、HEK-293T细胞、慢病毒包装骨架质粒psPAX2和pMD2.G、永生化质粒SV40大T抗原(pLOX-Ttag-iresTK)、转染试剂Turbofect。pLOX-Ttag-iresTK质粒载体如图2所示。
1.2、永生化慢病毒包装
(1)每孔接种8×106个HEK-293T细胞至6孔板。待细胞密度至85％，将转染试剂Tuborfect与pLOX-Ttag-iresTK、pMD2.G和psPAX2三种质粒涡旋混匀，室温静置30分钟，得到转染体系。其中，pLOX-Ttag-iresTK、pMD2.G和psPAX2三种质粒的质量比为4∶1∶3。需要说明的是，pLOX-Ttag-iresTK、pMD2.G和psPAX2三种质粒的质量比可以选择为4～6∶1～2∶3～5，本领域技术人员在实施时可根据实际需要具体选择。
(2)将转染体系逐滴加入至培养基中，轻轻混匀，继续放入培养箱培养。按照细胞密度和孔板的体积，每1ml培养基中添加2μg质粒、6μLTuborfect转染试剂。每1ml培养基添加转染试剂的可选择范围是3～9μL，质粒添加量的可选择范围为0.5～2μg。
(3)转染16小时后，在10cm皿中更换10mL包毒培养基，内含终浓度20mmol/L的HEPES。培养24小时后，收集细胞培养基上清液于50mL管中，4℃保存，同时给细胞补充新鲜的10mL包毒培养基。其中，包毒培养基由高糖培养基、10％胎牛血清、100U/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素组成。转染时间控制在16h～24h，病毒的侵染时间太长容易将全部细胞杀死。
(4)继续培养24小时后，收集细胞培养基上清液于50mL管中，3000r/min、4℃离心10分钟，去除细胞碎屑，转移上清至高速离心管中，30000r/min，4℃的条件下，离心2小时。离心结束，标记出浓缩病毒沉淀的位置。
(5)弃掉上清，使用500μL的DMEM+1％BSA稀释液溶解病毒，于4℃过夜浸泡病毒沉淀。
(6)将病毒粒子吹打混匀，使用慢病毒滴度检测卡按照使用说明测定慢病毒滴度。
(7)将浓缩后的病毒液分装至1.5mL的EP管中，保存于-80℃冰箱，避免反复冻融降低病毒滴度。
1.3、永生化慢病毒转导奶绵羊乳腺上皮细胞
(1)将MOI值设置为1×106PFU/mL感染原代乳腺上皮细胞，一个孔中加入终浓度为5μg/ml的聚凝胺polybrene以清除未获得永生化的细胞。
(2)病毒感染16小时后，给细胞更换培养基继续培养直至细胞传代至50代以上。在传代培养过程中用显微镜观察细胞形态的变化。
在长期培养过程中，永生化绵羊乳腺上皮细胞(标记为T-tag SMECs)的形态逐渐发生变化，细胞每传10代记录一次图像，直到超过50代。技术上，在T-tag转导后的P2，T-tagSMECs细胞系保持短梭状、蜂箱状多边形、典型鹅卵石状或圆形、扁平形状。P10和P20的细胞系形态基本保持不变。在T-tag转导后的P30，T-tag SMECs细胞系保持了短梭状、蜂窝状的形状，但有少数细长状的细胞。在T-tag转导后的P40时，T-tag SMECs细胞系以短梭状/蜂窝状形态占主导地位，但细胞呈扁平且薄的形态。如图3所示。
2、原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的鉴定
2.1、RT-qPCR检测奶绵羊原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的特异性基因的mRNA表达
将纯化后的F3原代乳腺上皮细胞，30代以及50代T-tag SMECs细胞系分别在12孔板中培养24h，待孔板密度达到90％左右时，分别提取细胞内总RNA。总RNA分别用TRIzolReagent(TaKaRa,China)提取。用Epoch微孔板分光光度计检测RNA纯度(1.8≦OD260/280≧2.1)及浓度后，去除基因组DNA，逆转录总RNA获得cDNA，用PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa，中国)分步操作。以cdna为模板进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶分离，并用Goldview标记，用紫外辐射分析。q-PCR分析使用CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad,CA,USA)，反应液为20μL，由TB GreenMIX、引物、cDNA和游离dH2O组成。用GAPDH归一化。结果采用2-△△Ct法计算。引物如表1所示，由上海生工生物科技有限公司合成。
表1RT-PCR and q-PCR引物
RT-qPCR的分析结果表明显示，广泛存在的上皮细胞标志物角蛋白8(KRT8)、角蛋白18(KRT18)、猿猴空泡病毒40(SV40)、增殖细胞核抗原(PCNA)以及脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、乙酰辅酶a羧化酶α(ACACA)、酪蛋白β(CSN2)在F2原代乳腺上皮细胞和T-tagSMECs细胞系P30、P50中均表达。这一结果表明了T-tag SMECs细胞系与原代乳腺上皮细胞在功能上具有强相似性，如图4所示。
2.2、Western blot检测奶绵羊原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的特异性基因的蛋白表达
首先，提取奶绵羊原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系总蛋白，通过以下步骤：
(1)当细胞密度达到90％左右时，弃培养液，用预冷的PBS冲洗2遍，吸净残留液体；加入150μL的含有1mM PMSF的RIPA裂解液，冰上放置30min；将裂解液吸入1.5mL离心管中，12000rpm 4℃离心15min；将上清转移至新的1.5mL离心管。
(2)蛋白变性：根据蛋白浓度，加入5×SDS-PAGE蛋白上样液，煮沸5min，使蛋白变性。将蛋白样品放在-80℃冰箱保存。
随后通过Westernblot进行蛋白表达的可视化并进行灰度分析，步骤如下：
(1)制胶：取相对应的四块玻璃板，按规格装配好电泳槽模具；按照说明书比例配制12.5％上层浓缩胶及下层分离胶。
(2)上样：先加入蛋白Marker，再按照需求计算每孔加入的蛋白样，并用溴酚蓝补齐。
(3)电泳：先用80V的电压进行电泳1h，待样品由浓缩胶进入分离胶，换120V的电压继续电泳2h。
(4)转膜：剪取与胶条大小一致的PVDF膜放入甲醇中浸泡30s活化，按由负到正，依次放好滤纸、胶、PVDF膜，冰浴80V转膜2:15h。
(5)封闭：将转好的PVDF膜放入40ml蛋白封闭液中，室温摇动封闭1h，可4℃过夜。
(6)切膜：根据目的蛋白大小，以预染蛋白Marker为参照切PVDF膜。
(7)一抗孵育：将切好的PVDF膜放入一抗稀释液中，室温摇动1h后，可4℃过夜孵育；回收一抗，用TBST摇床洗膜3次，每次10min。
(8)二抗孵育：加入4ml二抗稀释液，室温摇动孵育2h；弃二抗，用TBST洗膜3次，每次10min。
(9)照胶：将1:1混和均匀的ECL发光液滴到膜上，等待1min后即可用化学发光系统观察目的条带。
试验中一抗信息如表2所示。
表2一抗
Western blot分析结果与RT-qPCR结果一致。上皮细胞标志物角蛋白8(KRT8)、角蛋白18(KRT18)、猿猴空泡病毒40(SV40)、增殖细胞核抗原(PCNA)以及脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、乙酰辅酶a羧化酶α(ACACA)、酪蛋白β(CSN2)在F2原代乳腺上皮细胞和T-tagSMECs细胞系P30、P50中均表达。这一结果表明了T-tag SMECs细胞系与原代乳腺上皮细胞在功能上具有强相似性，结果如图5所示。
2.3、细胞免疫荧光检测奶绵羊原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的特异性蛋白
将乳腺上皮细胞消化后铺于96孔板，等到细胞密度达到70％左右时，使用细胞免疫荧光观察奶绵羊乳腺上皮细胞特异性蛋白的表达及定位。具体步骤如下：
(1)固定：移除培养液，每孔加入PBS100μL清洗3～5min，两次；加入100μL4％多聚甲醛，室温30min；移除4％多聚甲醛，每孔加入PBS100μL清洗两次。
(2)通透：每孔加入100μL PBST，室温通透5min；PBS清洗两次。
(3)封闭：每孔加入100μL BSA，37℃培养箱封闭1h，PBS清洗两次。
(4)一抗孵育：用PBST稀释一抗(1：200)，每孔加100μL；37℃孵育2h或2～8℃过夜。
(5)二抗孵育：用PBST稀释二抗(1：200)，每孔加100μL；37℃避光孵育30min或2～8℃过夜，回收二抗，PBS清洗两次。
(6)细胞核染色：按照1000：1的比例用Buffer稀释DAPI，每孔加100μL室温15min，回收DAPI后，PBS清洗两次。
(7)观察：使用荧光显微镜观察奶绵羊乳腺上皮细胞特异性蛋白的表达。
通过细胞免疫荧光分析结果发现，超过90％的原代乳腺上皮细胞都是表达KRT8、KRT18以及CSN2、COPS3的阳性乳腺上皮细胞，结果如图6～7所示。
同时，通过细胞免疫荧光分析结果发现，95％以上的T-tag SMECs细胞系(P50)表达角蛋白8(KRT8)、角蛋白18(KRT18)、猿猴空泡病毒40(SV40)、增殖细胞核抗原(PCNA)以及脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、乙酰辅酶a羧化酶α(ACACA)、酪蛋白β(CSN2)，这一结果表明T-tag SMECs细胞系仍保持了上皮细胞的广泛特性和乳蛋白、脂肪酸合成能力，以及细胞增殖力加强。并且T-tag SMECs细胞系与原代乳腺上皮细胞在功能上具有强相似性，结果如图8～9所示。
2.4、甘油三酯的分泌性检测
将乳腺上皮细胞消化后铺于6孔板，等到细胞密度达到80％左右时，通过油红O染色，检测甘油三酯的分泌情况，具体步骤如下：
(1)移除细胞培养基，用PBS洗两次，加油红0固定液固定20～30min。
(2)弃去固定液，用蒸馏水洗2次，加入60％异丙醇浸洗20～30s。
(3)弃去60％异丙醇后加入新配制好的油红O染色液，浸染10～20min。
(4)弃去染色液，60％异丙醇漂洗20～30s至间质清晰。水洗2～5次，直到无多余染液。
(5)加入Mayer苏木素染色液，复染核1～2min。弃去染液后水洗2～5次，加入油红O缓冲液孵育1min，弃去。
(6)加入蒸馏水覆盖细胞并在显微镜下观察。
油红O结果表明，纯化后的原代乳腺上皮细胞具有较强的合成和分泌甘油三酯的能力，如图10所示。
同时，T-tag SMECs细胞系也具有和原代乳腺上皮细胞相同的功能，即具有合成和分泌甘油三酯的能力，如图11所示。
2.5、奶绵羊原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的生长曲线测定
选择对数生长期的细胞，第一天将104个原代乳腺上皮细胞和104个T-tag SMECs细胞系分别作为初始数量在96孔板中播种。计算原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的数量，直至7d。绘制原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的生长曲线。
结果显示，在第3天T-tag SMECs细胞系的增殖速度明显高于原代乳腺上皮细胞。逐渐地，原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的增殖速度在第6天均达到峰值，并一直保持，结果如图12所示。
2.6、奶绵羊原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的细胞周期检测
选择对数生长期的细胞，纯化的原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系分别接种于6孔板，接种密度为3×105。消化后的细胞置于冷PBS中形成细胞悬浮液。1000g离心5分钟收集细胞沉淀，用预冷的70％乙醇重新悬浮细胞，4℃固定过夜。再次在1000g下离心5分钟，按照细胞周期测定试剂盒对细胞进行染色，试剂盒购买于碧云天。染色结果由FACSCalibur流式细胞仪检测。采用流式细胞术比较原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的细胞周期。
在原代乳腺上皮细胞中，细胞周期分析显示，原代乳腺上皮细胞系中G0/G1期为48.79％，S期为2.67％，G2/M期为48.53％。T-tag SMECs细胞系中G0/G1期占47.33％，S期占31.51％，G2/M期占21.16％。T-tag SMECs细胞系的S期明显高于原代乳腺上皮细胞，而G2/M明显低于原代乳腺上皮细胞。结果表明，T-tag SMECs细胞系的DNA复制和细胞有丝分裂效率优于原代乳腺上皮细胞，结果如图13～14所示。
2.7、奶绵羊乳腺上皮细胞系的染色体核型分析
选择对数生长期的细胞，将纯化的原代乳腺上皮细胞和第50代T-tag SMECs细胞系以3×105的密度铺于6孔板中，用秋水仙碱(1μg/ml)处理细胞8h后，收集细胞沉淀，用75mmol/LKCl重新悬浮15min，然后用预冷的甲醇-冰醋酸(V：V＝3:1)浸泡细胞，预固定后滴在载玻片上进行DAPI染色。使用日本NIKON ECLIPSE TI-SR荧光显微镜，观察细胞的染色体数量。
通过核型分析，发现SV40大T抗原诱导的绵羊永生化T-tag SMECs细胞系能保持正常核型，有27对染色体，维持正常染色体结构和数量，如图15所示。
2.8、奶绵羊原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的致瘤性检测
2.8.1、体内试验
收集原代乳腺上皮细胞和第50代T-tag SMECs细胞系，以HELA细胞作为阳性对照组。在4周龄雌性BALB/c裸鼠的侧背皮下注射500μL细胞悬液，即细胞与基质胶的混合物。每只裸鼠注射1.0×106或1.0×106HELA细胞。每两周观察并记录肿瘤体积和小鼠体重。小鼠于8周皮下注射后安乐死。最后，通过HE染色对肿瘤进行组织学评估。在本研究中，裸鼠生活在无特定病原体(SPF)动物室内，用灭菌食品和高压水喂养。每天仔细监测小鼠的健康状况和喂养环境。
虽然T-tag SMECs细胞系的生长曲线和细胞周期与永生化细胞的特征一致，但癌细胞也符合类似的生物学特征。因此，通过每组裸鼠侧腹皮下注射T-tag SMECs细胞系和HELA细胞(6个重复)建立裸鼠皮下肿瘤模型进行致瘤性检测。阳性对照HELA细胞在4周内在6只裸鼠体内形成肿瘤，T-tag SMECs细胞系均未形成肿瘤，如图16A所示。利用HE染色，T-tag SMECs细胞系组皮下切片表现正常。然而，HELA细胞皮下切片出现了异常的病理变化(图16B)。
此外，本发明分别记录了阳性对照组(HELA)和治疗组(T-tag SMECs细胞系)6只裸鼠在细胞注射后第一天(体重约17g)和第22天(体重约20g)的体重。经统计分析，两组小鼠在同一天的体重差异无统计学意义(图17A)。
随后记录了细胞注射后裸鼠体内形成的组织团块及其重量。图17B上层是注射T-tag SMECs细胞系的裸鼠皮下后残留的T-tag SMECs细胞系和基质凝胶的混合集团，而下层是注射HELA细胞的裸鼠皮下后形成的肿瘤(图17B)。并且，注射T-tag SMECs细胞系的组织团块质量显著低于注射HELA细胞后肿瘤的重量(图18A)。
2.8.2、体外试验
将原代乳腺上皮细胞，第50代T-tag SMECs细胞系和HELA细胞以约3×105的密度铺种在6孔板中，以HELA细胞作为阳性对照组，待细胞全部落在培养皿底部。用尖端划伤单层细胞，用PBS洗涤除去细胞上清液中的漂浮细胞。将培养液全部更换为无血清培养基。使用荧光显微镜(NIKON ECLIPSE TI-SR，日本)记录单层细胞在损伤后0h、12h和/或24h的图像观察细胞是否达到融合，并分析伤口闭合面积。
原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的细胞划痕试验结果表明，原代乳腺上皮细胞和T-tag SMECs细胞系的运动性均未发生变化，而HELA细胞在细胞划痕产生12h后的运动性增强，可通过迁移面积判断(图18B、图19)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种绵羊乳腺上皮细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
取绵羊离体乳房组织，分离培养并纯化后得到绵羊原代乳腺上皮细胞；
传代培养绵羊原代乳腺上皮细胞，待培养至至少F2代时，用携带SV40 large T抗原的病毒侵染绵羊原代乳腺上皮细胞，得到绵羊乳腺上皮细胞系。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，用携带SV40 large T抗原的病毒侵染绵羊原代乳腺上皮细胞的具体操作过程为：
以pLOX-Ttag-iresTK为目标质粒、pMD2.G和psPAX2为慢病毒包装质粒，与转染试剂混合后转染工具细胞，转染16～24h后更换培养基为含HEPES的包毒培养基继续培养，收集上清，浓缩，得到慢病毒；
使用所述慢病毒转染所述绵羊原代乳腺上皮细胞，传代培养，得到所述绵羊乳腺上皮细胞系。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，pLOX-Ttag-iresTK、pMD2.G和psPAX2的混合质量比为4～6∶1～2∶3～5。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述转染试剂为Tuborfect；以转染工具细胞时培养体系的总体积计，每1ml培养体系中添加0.5～2μg质粒、2～9μLTuborfect转染试剂。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述工具细胞为HEK-293T细胞。
6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，
所述离体乳房组织取自绵羊泌乳高峰期；
分离培养绵羊原代乳腺上皮细胞是使用组织块贴壁培养法进行；
纯化绵羊原代乳腺上皮细胞是采用差时消化法或差速贴壁法进行。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，
所述差时消化法的具体操作过程为：利用胰蛋白酶消化绵羊原代乳腺上皮细胞，当观察到细胞开始变圆时终止消化，更换培养基继续培养生长，连续操作2～3次；
所述差速贴壁法的具体操作过程为：利用胰蛋白酶消化绵羊原代乳腺上皮细胞，消化4～6min后终止消化，离心，收集沉淀，加入培养基继续培养生长，连续操作2～3次。
8.一种根据权利要求1～7任一项所述的方法构建得到的绵羊乳腺上皮细胞系。
9.一种权利要求8所述的绵羊乳腺上皮细胞系在合成和分泌甘油三酯、乳蛋白或脂肪酸中的用途。
10.一种权利要求8所述的绵羊乳腺上皮细胞系在作为相关疾病研究的动物模型中的用途。
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