CN104099296B - 一种兔脐带间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，选用兔脐带为原材料，包括以下步骤，兔脐带组织的清洗、兔脐带组织的消化、细胞接种、传代培养、即时使用或冷冻保存备用。按照本发明获得的兔脐带间充质干细胞经表面抗原检测及多向分化鉴定，符合间充质干细胞产品合格标准，具有较高的增殖及分化潜力。按照本发明获得的兔脐带间充质干细胞为以兔为实验动物的干细胞相关应用研究提供了一种新的同种异体移植的种子细胞，极大程度上保证了脐带间充质干细胞的低免疫原性，极大地丰富了现有的种子细胞库。

Description

一种兔脐带间充质干细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及从脐带中分离、扩增、鉴定间充质干细胞的方法，尤其涉及了一种兔脐带间充质干细胞的制备方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因细胞数量及增殖分化潜能随供体年龄的增加而下降，病毒感染率较高，异体移植可能引起免疫反应，以及采集需行有创操作，带来新的伤害等缺点，其应用受到一定限制。而从生产“废弃物”脐带中提取的脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)因其成本较低，来源丰富，不会造成新的创伤和痛苦，不涉及伦理问题，具有极强的可塑性，无致瘤活性和低免疫原性等优点，在疾病治疗和生物修复等方面得到广泛的应用。有研究表明，脐带中干细胞含量丰富，平均每厘米脐带组织中可高达4×105个，远远高于骨髓中的含量；UCMSCs与BMSCs相比，具有更强的扩增能力，并且增殖和分化潜能不会随着传代次数的增加和机体年龄的增长而降低。

人UCMSCs之所以成为公认的极富潜力的种子细胞，主要源于其多向分化潜能及低免疫原性等独特优势。人UCMSCs的低免疫原性在同种异体移植时已获公认，然而在异种异体移植时却存在争议。已有研究表明，直接将人UCMSCs应用于非人物种的体内模型，实验结果有时并不理想，其原因可能是种属间的差异导致实验动物对人UCMSCs产生了免疫反应。而这种免疫反应恰是干细胞应用研究中需极力避免和排除的干扰因素。因此，同种异体移植以维持干细胞的低免疫原性极为重要。

尽管人UCMSCs已在多种实验研究中广泛应用，然而，由于伦理限制，大多数在体实验不可能在人体内进行，而是以动物作为模型，这种异种异体移植中，非人物种对人UCMSCs产生的免疫反应，严重干扰了实验结果，极不利于干细胞应用研究的发展。

兔因其易获得、价格便宜、容易饲养、可操作性强等优势，是目前最为常见的实验动物之一。但目前尚未发现有关兔脐带间充质干细胞制备的相关研究。因此，分离、扩增、鉴定兔脐带间充质干细胞(rabbit umbilical cord mesenchymal stem cells，rUCMSCs)可有效保证UCMSCs在同种异体移植中的低免疫原性，对于干细胞应用研究的发展具有极其重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术中的缺点，提供了一种兔脐带间充质干细胞的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，选用兔脐带为原材料，包括以下步骤，

A.兔脐带组织的清洗：在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水或无菌PBS液体冲洗3-5次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血；

B.兔脐带组织的消化：将兔脐带组织放到100ml的无菌烧杯中，用无菌组织剪将兔脐带组织剪成1mm³的兔脐带组织块后，加入兔脐带组织块体积3-4倍的0.1％无菌胶原酶，无菌封装后，置于37-39℃、体积分数为4.5-5.5％CO₂培养箱中消化，直至兔脐带组织块消化完全；兔脐带组织块消化完全后，用含体积分数为10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基中止消化；本发明中并不剔除脐带血管，而选择将所有脐带组织剪成大小约1mm³组织块进行消化，达到了减少脐带组织损耗的有益效果，解决了兔脐带较为细小、很难获取足够的脐带的技术问题。本发明选用质量体积分数为0.1％的II型胶原酶单酶消化，尽量减小组织块以缩短消化时间，达到了避免酶消化过程对细胞损伤的有益效果。本发明未使用100目细胞筛过滤，将消化离心后沉淀组织直接接种培养，达到了降低操作过程中细胞损失的有益效果。

C.细胞接种：将中止后的混合液置于低温离心机内离心后去除上清液，保留沉淀物，用含10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基吹匀；将重悬液接种于培养瓶或培养皿中，静置于37-39℃、4.5-5.5％CO₂、92-96％饱和湿度的恒温培箱中培养；培养24h后全量换液，去除残存组织和未贴壁细胞，之后3天换液一次，至细胞融合达到80％时，传代培养，即时使用或冷冻保存备用。经表面抗原检测及多向分化鉴定，获得的兔脐带间充质干细胞符合间充质干细胞产品合格标准，具有较高的增殖及分化潜力。可快速冻存，为以兔为实验动物的干细胞相关应用研究提供了一种新的司种异体移植的种子细胞，极大程度上保证了脐带间充质干细胞的低免疫原性，达到了丰富现有种子细胞库的有益效果。培养24h后全量换液是指：更换含10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基溶液。

本发明通过以上方法成功分离、提取出大量的富有活性的兔脐带间充质干细胞。本发明解决了现有设计中兔脐带间充质干细胞的制备尚无报道的技术问题。

作为优选，兔脐带组织从脐带沃顿胶、脐带血管周围或脐带血管内皮下的任何一处或多处选取。兔脐带较为细小，因此需获取足够量的脐带，本发明共采集了12条兔脐带。本发明中，兔脐带组织可以从脐带沃顿胶、脐带血管周围或脐带血管内皮下中选取，达到丰富兔脐带组织来源的有益效果，解决了现有技术中兔脐带细小、比较难获取足够量脐带的技术问题。

作为优选，步骤A中，在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水冲洗3次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血。本发明选用无菌生理盐水冲洗兔脐带组织，在冲洗兔血的同时，没有引入病毒或者杂菌，为后期无菌操作提供了条件。用无菌生理盐水冲洗3次，即节约了试剂、缩短实验时间和实验周期，又清洗干净了兔血。

作为优选，步骤B中，低温离心机内以2500rmp的转速离心20分钟。选用低温离心机，有利于中止消化，避免了在离心过程中继续进行消化。在2500rmp的转速离心20分钟时，在达到最佳沉降的效果的前提下，不仅可以保证细胞不会因过度离心而遭到破坏，而且可以缩短实验时间、缩短实验周期、节约能源。

作为优选，步骤B中，无菌封装后，置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中消化，直至兔脐带组织块消化完全。培养箱中温度保持在37℃为防生环境，可维持酶的最高消化活性，利于进行兔脐带组织块的消化。经过实验发现，培养箱中CO₂的体积分数为5％时，兔脐带组织块能够完全消化，且缩短了完全消化的时间，节约了实验时间、缩短了实验周期。

作为优选，步骤B中，L-DMEM培养基的用量为5～10ml；1ml的L-DMEM培养基中，FBS的用量为0.05-0.2ml，青霉素的用量为80-115U，链霉素的用量为95-120U。

作为优选，步骤C中，将重悬液接种于培养瓶或培养皿中，静置于37℃、5％CO₂、95％饱和湿度的恒温培箱中培养。培养箱中温度保持在37℃为防生环境，适宜细胞生长，极利于细胞贴壁与增殖。经过实验发现，恒温培箱保持在37℃、5％CO₂、95％饱和湿度时，细胞贴壁时间短，贴壁细胞成活率高；且在体外成集落样生长，形态均一，生长状态稳定，增殖速度快。

本发明通过以上方法成功分离、提取出大量的富有活性的兔脐带间充质干细胞。本发明解决了现有设计中兔脐带间充质干细胞的制备尚无报道的技术问题。本发明中并不剔除脐带血管，而选择将所有脐带组织剪成大小约1mm³组织块进行消化，达到了减少脐带组织损耗的有益效果，解决了兔脐带较为细小、很难获取足够的脐带的技术问题。本发明中，兔脐带组织可以从脐带沃顿胶、脐带血管周围或脐带血管内皮下中选取，达到丰富兔脐带组织来源的有益效果，解决了现有技术中兔脐带细小、比较难获取足够量脐带的技术问题。本发明选用质量体积分数为0.1％的II型胶原酶单酶消化，尽量减小组织块以缩短消化时间，达到了避免酶消化过程对细胞损伤的有益效果。

本发明制备的兔脐带间充质干细胞贴壁时间短，贴壁细胞成活率高；在体外成集落样生长，形态均一，生长状态稳定，增殖速度快；并且经表面抗原检测及多向分化鉴定，获得的兔脐带间充质干细胞符合间充质干细胞产品合格标准，具有较高的增殖及分化潜力；可快速冻存，建立干细胞库；为以兔为实验动物的干细胞相关应用研究提供了一种新的同种异体移植的种子细胞，极大程度上保证了脐带间充质干细胞的低免疫原性，极大地丰富了现有的种子细胞库。

附图说明

图1为兔原代脐带间充质干细胞形态图，其中，1A为接种12h细胞形态图；1B为接种24h细胞形态图；1C为培养5d细胞形态图。

图2为兔传代脐带间充质干细胞形态图，其中，2A为第4代兔脐带间充质干细胞形态图；2B为第10代兔脐带间充质于细胞形态图。

图3为第四代间充质干细胞流式细胞仪检测的免疫表型细胞含量图。

图4为PCR检测细胞表面标记mRNA表达电泳图，泳道1-Marker，泳道2-内参GAPDH，泳道3-CD73，泳道4-CD90，泳道5-CD105，泳道6-CD34，泳道7-CD45；Marker片段大小从下往上依次为：20bp，40bp，60bp，80bp，100bp，120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，300bp，400bp，500bp。

图5为兔脐带间充质干细胞诱导分化为成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞的免疫组化染色图，其中，5A为成骨诱导后茜素红染色；5B为成脂诱导后油红O染色；5C为成软骨诱导后形态观察。

图6A为PCR检测兔脐带间充质干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化相关基因表达电泳图，成骨诱导Runx2基因、成脂诱导PPARγ基因、成软骨诱导Sox9基因表达电泳图。

图6B为PCR检测兔脐带间充质干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化相关基因表达定量图，成骨诱导Runx2基因、成脂诱导PPARγ基因、成软骨诱导Sox9基因表达定量图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，选用兔脐带为原材料，包括以下步骤，

A.兔脐带组织采集：取孕21～23d的普通级孕兔，空气栓塞处死；体积分数为75％乙醇浸泡消毒10分钟后，仰卧位固定于清洁的解剖台上；减去孕兔腹部兔毛，碘伏消毒孕兔腹部，依次剪开皮肤、皮下组织、肌层、腹膜后，找到狭长子宫，可见有成串胎囊；用无菌纱布将子宫与腹腔内其他器官隔开，从一侧依次剖开胎囊，剪开羊膜，提起胎兔，小心剔除脐带周围羊膜，轻柔挤出脐带内兔血，将脐带胎盘端和胎兔端离断，放入无菌等渗生理盐水中备用；重复以上操作，收集足够量的脐带；

B.兔脐带组织的清洗：在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水或无菌PBS液体冲洗3次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血；

C.兔脐带组织的消化：将兔脐带组织放到100ml的无菌烧杯中，用无菌组织剪将兔脐带组织剪成1mm³的兔脐带组织块后，加入兔脐带组织块体积3倍的0.1％无菌胶原酶，无菌封装后，置于37℃、体积分数为4.5％CO₂培养箱中消化，直至兔脐带组织块消化完全；兔脐带组织块消化完全后，用含体积分数为10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基中止消化；

D.细胞接种：将中止后的混合液置于低温离心机内离心后去除上清液，保留沉淀物，用含10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基吹匀；将重悬液接种于培养瓶或培养皿中，静置于37℃、4.5％CO₂、92％饱和湿度的恒温培箱中培养；培养24h后全量换液，去除残存组织和未贴壁细胞，之后3天换液一次，至细胞融合达到80％时，传代培养，即时使用或冷冻保存备用。

兔脐带组织从脐带沃顿胶、脐带血管周围或脐带血管内皮下的任何一处或多处选取。

步骤B中，在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水冲洗3次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血。

步骤B中，L-DMEM培养基的用量为5ml；1ml的L-DMEM培养基中，FBS的用量为0.1ml，青霉素的用量为100U，链霉素的用量为100U。

步骤C中，低温离心机内以2500rmp的转速离心20分钟。

对于按照本发明上述方法制备的兔脐带间充质干细胞，按照“国际细胞疗法协会”(ISCT)制定的标准进行鉴定，表现出以下技术特征：

(1)在最佳培养体系条件下细胞贴壁生长，可形成CFU-F集落，形态相对均一，呈平行排列生长或旋涡状生长的梭形细胞；

(2)表达间质细胞标记CD73、CD105，干细胞标记物CD90；而不表达造血干细胞标志CD34和白细胞共同抗原CD45；

(3)体外可诱导分化为成骨细胞、成脂细胞及成软骨细胞。

上述鉴定结果表明制备的兔脐带间充质干细胞不是造血干细胞，并且具有上述技术特征，符合间充质干细胞产品合格标准。

实施例2

一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，选用兔脐带为原材料，包括以下步骤，

A.兔脐带组织采集：取孕21～23d的普通级孕兔，空气栓塞处死；体积分数为75％乙醇浸泡消毒10分钟后，仰卧位固定于清洁的解剖台上；减去孕兔腹部兔毛，碘伏消毒孕兔腹部，依次剪开皮肤、皮下组织、肌层、腹膜后，找到狭长子宫，可见有成串胎囊；用无菌纱布将子宫与腹腔内其他器官隔开，从一侧依次剖开胎囊，剪开羊膜，提起胎兔，小心剔除脐带周围羊膜，轻柔挤出脐带内兔血，将脐带胎盘端和胎兔端离断，放入无菌等渗生理盐水中备用；重复以上操作，收集足够量的脐带；

B.兔脐带组织的清洗：在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水或无菌PBS液体冲洗5次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血；

C.兔脐带组织的消化：将兔脐带组织放到100ml的无菌烧杯中，用无菌组织剪将兔脐带组织剪成1mm³的兔脐带组织块后，加入兔脐带组织块体积4倍的0.1％无菌胶原酶，无菌封装后，置于39℃、体积分数为5.5％CO₂培养箱中消化，直至兔脐带组织块消化完全；兔脐带组织块消化完全后，用含体积分数为10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基中止消化；

D.细胞接种：将中止后的混合液置于低温离心机内离心后去除上清液，保留沉淀物，用含10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基吹匀；将重悬液接种于培养瓶或培养皿中，静置于39℃、5.5％CO₂、96％饱和湿度的恒温培箱中培养；培养24h后全量换液，去除残存组织和未贴壁细胞，之后3天换液一次，至细胞融合达到80％时，传代培养，即时使用或冷冻保存备用。

兔脐带组织从脐带沃顿胶、脐带血管周围或脐带血管内皮下的任何一处或多处选取。

步骤B中，在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水冲洗3次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血。

步骤B中，L-DMEM培养基的用量为10ml；1ml的L-DMEM培养基中，FBS的用量为0.05ml，青霉素的用量为80U，链霉素的用量为95U。

步骤C中，低温离心机内以2500rmp的转速离心20分钟。

对于按照本发明上述方法制备的兔脐带间充质干细胞，按照“国际细胞疗法协会”(ISCT)制定的标准进行鉴定，表现出以下技术特征：

(1)在最佳培养体系条件下细胞贴壁生长，可形成CFU-F集落，形态相对均一，呈平行排列生长或旋涡状生长的梭形细胞；

(2)表达间质细胞标记CD73、CD105，干细胞标记物CD90；而不表达造血干细胞标志CD34和白细胞共同抗原CD45；

(3)体外可诱导分化为成骨细胞、成脂细胞及成软骨细胞。

上述鉴定结果表明制备的兔脐带间充质干细胞不是造血干细胞，并且具有上述技术特征，符合间充质干细胞产品合格标准。

实施例3

一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，选用兔脐带为原材料，包括以下步骤，

A.兔脐带组织采集：取孕21～23d的普通级孕兔，空气栓塞处死；体积分数为75％乙醇浸泡消毒10分钟后，仰卧位固定于清洁的解剖台上；减去孕兔腹部兔毛，碘伏消毒孕兔腹部，依次剪开皮肤、皮下组织、肌层、腹膜后，找到狭长子宫，可见有成串胎囊；用无菌纱布将子宫与腹腔内其他器官隔开，从一侧依次剖开胎囊，剪开羊膜，提起胎兔，小心剔除脐带周围羊膜，轻柔挤出脐带内兔血，将脐带胎盘端和胎兔端离断，放入无菌等渗生理盐水中备用；重复以上操作，收集足够量的脐带；

B.兔脐带组织的清洗：在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水或无菌PBS液体冲洗3-5次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血；

C.兔脐带组织的消化：将兔脐带组织放到100ml的无菌烧杯中，用无菌组织剪将兔脐带组织剪成1mm³的兔脐带组织块后，加入兔脐带组织块体积3-4倍的0.1％无菌胶原酶，无菌封装后，置于38℃、体积分数为5％CO₂培养箱中消化，直至兔脐带组织块消化完全；兔脐带组织块消化完全后，用含体积分数为10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基中止消化；

D.细胞接种：将中止后的混合液置于低温离心机内离心后去除上清液，保留沉淀物，用含10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基吹匀；将重悬液接种于培养瓶或培养皿中，静置于38℃、5％CO₂、95％饱和湿度的恒温培箱中培养；培养24h后全量换液，去除残存组织和未贴壁细胞，之后3天换液一次，至细胞融合达到80％时，传代培养，即时使用或冷冻保存备用。

兔脐带组织从脐带沃顿胶、脐带血管周围或脐带血管内皮下的任何一处或多处选取。

步骤B中，在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水冲洗3次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血。

步骤B中，L-DMEM培养基的用量为5ml；FBS的用量为0.05-0.2ml，青霉素的用量为80-115U，链霉素的用量为95-120U。

步骤C中，低温离心机内以2500rmp的转速离心20分钟。

对于按照本发明上述方法制备的兔脐带间充质干细胞，按照“国际细胞疗法协会”(ISCT)制定的标准进行鉴定，表现出以下技术特征：

(1)在最佳培养体系条件下细胞贴壁生长，可形成CFU-F集落，形态相对均一，呈平行排列生长或旋涡状生长的梭形细胞；

(2)表达间质细胞标记CD73、CD105，干细胞标记物CD90；而不表达造血干细胞标志CD34和白细胞共同抗原CD45；

(3)体外可诱导分化为成骨细胞、成脂细胞及成软骨细胞。

上述鉴定结果表明制备的兔脐带间充质干细胞不是造血干细胞，并且具有上述技术特征，符合间充质干细胞产品合格标准。

实施例4

一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，选用兔脐带为原材料，包括以下步骤，

A.兔脐带组织采集：取孕21～23d的普通级孕兔，空气栓塞处死；体积分数为75％乙醇浸泡消毒10分钟后，仰卧位固定于清洁的解剖台上；减去孕兔腹部兔毛，碘伏消毒孕兔腹部，依次剪开皮肤、皮下组织、肌层、腹膜后，找到狄长子宫，可见有成串胎囊；用无菌纱布将子宫与腹腔内其他器官隔开，从一侧依次剖开胎囊，剪开羊膜，提起胎兔，小心剔除脐带周围羊膜，轻柔挤出脐带内兔血，将脐带胎盘端和胎兔端离断，放入无菌等渗生理盐水中备用；重复以上操作，收集足够量的脐带；

B.兔脐带组织的清洗：在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水或无菌PBS液体冲洗3次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血；

C.兔脐带组织的消化：将兔脐带组织放到100ml的无菌烧杯中，用无菌组织剪将兔脐带组织剪成1mm³的兔脐带组织块后，加入兔脐带组织块体积3倍的0.1％无菌胶原酶，无菌封装后，置于37.5℃、体积分数为4.9％CO₂培养箱中消化，直至兔脐带组织块消化完全；兔脐带组织块消化完全后，用含体积分数为10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基中止消化；

D.细胞接种：将中止后的混合液置于低温离心机内离心后去除上清液，保留沉淀物，用含10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基吹匀；将重悬液接种于培养瓶或培养皿中，静置于37.5℃、4.9％CO₂、93％饱和湿度的恒温培箱中培养；培养24h后全量换液，去除残存组织和未贴壁细胞，之后3天换液一次，至细胞融合达到80％时，传代培养，即时使用或冷冻保存备用。

兔脐带组织从脐带沃顿胶、脐带血管周围或脐带血管内皮下的任何一处或多处选取。

步骤B中，在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水冲洗3次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血。

步骤B中，L-DMEM培养基的用量为9.5ml；1ml的L-DMEM培养基中，FBS的用量为0.1ml，青霉素的用量为100U，链霉素的用量为100U。

步骤C中，低温离心机内以2500rmp的转速离心20分钟。

对于按照本发明上述方法制备的兔脐带间充质干细胞，按照“国际细胞疗法协会”(ISCT)制定的标准进行鉴定，表现出以下技术特征：

(1)在最佳培养体系条件下细胞贴壁生长，可形成CFU-F集落，形态相对均一，呈平行排列生长或旋涡状生长的梭形细胞；

(2)表达间质细胞标记CD73、CD105，干细胞标记物CD90；而不表达造血干细胞标志CD34和白细胞共同抗原CD45；

(3)体外可诱导分化为成骨细胞、成脂细胞及成软骨细胞。

上述鉴定结果表明制备的兔脐带间充质干细胞不是造血干细胞，并且具有上述技术特征，符合间充质干细胞产品合格标准。

实施例5

一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，选用兔脐带为原材料，包括以下步骤，

A.兔脐带组织采集：取孕21～23d的普通级孕兔，空气栓塞处死；体积分数为75％乙醇浸泡消毒10分钟后，仰卧位固定于清洁的解剖台上；减去孕兔腹部兔毛，碘伏消毒孕兔腹部，依次剪开皮肤、皮下组织、肌层、腹膜后，找到狭长子宫，可见有成串胎囊；用无菌纱布将子宫与腹腔内其他器官隔开，从一侧依次剖开胎囊，剪开羊膜，提起胎兔，小心剔除脐带周围羊膜，轻柔挤出脐带内兔血，将脐带胎盘端和胎兔端离断，放入无菌等渗生理盐水中备用；重复以上操作，收集足够量的脐带；

B.兔脐带组织的清洗：在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水或无菌PBS液体冲洗3次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血；

C.兔脐带组织的消化：将兔脐带组织放到100ml的无菌烧杯中，用无菌组织剪将兔脐带组织剪成1mm³的兔脐带组织块后，加入兔脐带组织块体积3倍的0.1％无菌胶原酶，无菌封装后，置于38.9℃、体积分数为5.2％CO₂培养箱中消化，直至兔脐带组织块消化完全；兔脐带组织块消化完全后，用含体积分数为10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基中止消化；

D.细胞接种：将中止后的混合液置于低温离心机内离心后去除上清液，保留沉淀物，用含10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基吹匀；将重悬液接种于培养瓶或培养皿中，静置于38.9℃、5.2％CO₂、95％饱和湿度的恒温培箱中培养；培养24h后全量换液，去除残存组织和未贴壁细胞，之后3天换液一次，至细胞融合达到80％时，传代培养，即时使用或冷冻保存备用。

兔脐带组织从脐带沃顿胶、脐带血管周围或脐带血管内皮下的任何一处或多处选取。

步骤B中，在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水冲洗3次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血。

步骤B中，L-DMEM培养基的用量为9.5ml；1ml的L-DMEM培养基中，FBS的用量为0.18ml，青霉素的用量为114U，链霉素的用量为115U。

步骤C中，低温离心机内以2500rmp的转速离心20分钟。

对于按照本发明上述方法制备的兔脐带间充质干细胞，按照“国际细胞疗法协会”(ISCT)制定的标准进行鉴定，表现出以下技术特征：

(1)在最佳培养体系条件下细胞贴壁生长，可形成CFU-F集落，形态相对均一，呈平行排列生长或旋涡状生长的梭形细胞；

(2)表达间质细胞标记CD73、CD105，干细胞标记物CD90；而不表达造血干细胞标志CD34和白细胞共同抗原CD45；

(3)体外可诱导分化为成骨细胞、成脂细胞及成软骨细胞。

上述鉴定结果表明制备的兔脐带间充质干细胞不是造血干细胞，并且具有上述技术特征，符合间充质干细胞产品合格标准。

实施例6

兔脐带间充质干细胞的细胞特征：

(1)流式细胞仪检测细胞免疫表型：选取P4代生长状态良好的细胞，0.25％胰酶消化，1000rpm离心5min，PBS清洗细胞2遍，细胞计数，分5组，为I组(CD90组)、II组(CD105组)、III组(CD73组)、IV组(CD34组)、V组(CD45组)，每组各含3管，分别为A管(相应阳性抗体管)、B管(同型对照抗体管)、C管(不加任何抗体的空白对照管)，共计15管，每管加入的细胞总数相同，为1×106个细胞/管，离心后弃上清，用4℃PBS重悬，各组的A管中加入相应阳性抗体5ul，B管中加入同型对照抗体5ul，C管中不加入任何抗体和试剂，同时在4℃下孵育30min。因考虑到人和兔表面抗原具有较高同源性，流式检测抗体选用抗人流式抗体。孵育完成后，每管加入1mlPBS300g离心5min，弃上清，加入500ulPBS重悬。封好流式管口，置于泡沫冰盒中，迅速进行流式仪检测分析。CD73、CD105、CD90为阳性标记，CD34、CD45为阴性标记，图3。

(2)PCR检测细胞表面标记mRNA表达：

①引物设计：从美国国立生物技术信息中心(National Center ofBiotechnology Information，NCBI)中查询兔CD90、CD73、CD105、CD45、CD34mRNA序列进行引物设计，管家基因为GAPDH基因，引物序列、产物大小见表1。

表1 RT-PCR和qPCR引物信息

②RNA提取：当P4代细胞80％-90％融合后，采集1×106个细胞，采用Trizol法进行总RNA提取：取1ml Trizol固定的细胞样本，加200ul氯仿剧烈震荡20sec，12000rpm离心8分钟，吸出上清。加入等体积80％乙醇及50ul混匀后的磁珠(beads)，震荡混匀，室温放置3分钟。5000rpm离心1分钟，置于磁力架上1分钟，吸去上清。加入200ul80％乙醇，中速震荡，静置1分钟，5000rpm离心30秒，磁力架上放置1分钟，吸去上清。重复上述操作一次然后尽量吸干残余液体，室温放置5分钟晾干。加入30-70ul水，吹打混匀beads，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，取出置于磁力架上。尽量吸出上清，避免吸入beads，将液体转移至新EP管中备用。

③逆转录：在Microtube管中配制模板RNA/引物混合液。70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。在上述Microtube管中配制反转录反应液。42℃保温1小时。70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液用于PCR扩增。

④PCR反应：PCR反应体系50μL：10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture(各10mM)1μL，TaKaRa HS Taq(5U/μl)0.25μL，上、下游引物(10μM)各1μL，cDNA各2μL，dH2O配平至50μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，最佳退火温度65℃25s，72℃延伸20s，35个循环；72.0℃延伸5min，4℃保存。反应结束后取PCR产物，用0.5×TAE缓冲液制备3％琼脂糖凝胶，电泳条件为130伏，30min，用凝胶成像仪检测目的基因的表达情况，图4。

(3)细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化及鉴定：事先按说明书配制好成骨诱导液培养基、成脂诱导液和成软骨诱导液(广州赛业公司，详细成分及浓度参见说明书)，取P4代生长良好的细胞，按常规方法消化间充质干细胞，制成细胞悬液待用。

①成骨诱导分化：将6孔板分为诱导组和对照组，每组3孔，共6孔，将事先制备好的悬液按分组接种于相应孔中，细胞数为3×104/孔，接种之后，加入足够的完全培养液，放在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。当细胞达到50％-70％融合，小心的吸去旧的完全培养液，诱导组中每孔加入2ml的成骨分化诱导液进行诱导，对照组仍用完全培养液培养。此后，每隔3天更换新鲜的成骨分化完全培养基及完全培养基。当分化诱导达4周时，固定诱导组和对照组，均用茜素红进行钙结节染色，显微镜下观察并拍照记录，图5A。

②成脂诱导分化：分组及诱导前细胞接种培养同成骨诱导分化。待细胞完全融合后，继续常规培养3-5天后，小心的吸去旧的完全培养液，诱导组中每孔加入2ml的成脂分化诱导完全培养基A进行诱导。三天后，将分化诱导液换为成脂分化诱导完全培养基B。24小时后，再换回成脂分化诱导完全培养基A进行诱导。如此循环3到5次后，用成脂分化诱导完全培养基B继续维持7天，每三天进行换液。对照组一直用完全培养液培养。分化诱导完成后，同时固定各组细胞并用油红O进行染色显微镜下观察并拍照记录，图5B。

③成软骨诱导分化：实验分为诱导组和对照组，用事先制备的2.5×105个细胞的悬液，离心后去上清，按7.5×105/ml的量加入软骨诱导基础培养液重悬细胞，然后150g离心5分钟；去上清，按5.0×105/ml的量加入软骨诱导完全培养液(即配即用)重悬细胞；吸取500ul细胞悬液(即2.5×105个细胞)转入15ml离心管中，150g离心5分钟；离心后不可摇动或吹打细胞团，小心地将离心管盖拧松，以便于气体交换。放入37℃，5％CO₂中孵育。24小时内不要摇动细胞团。每2～3天换新鲜的软骨分化诱导液，每管0.5ml，换液后轻弹细胞团使其能脱壁漂浮；拧松管盖，放入37℃，5％CO₂中继续诱导。诱导4周后，观察诱导细胞团形态，图5C。

④PCR检测兔脐带间充质干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化相关基因表达：细胞制备及分组同细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化步骤，细胞培养采用连续培养，中间不传代，在各自诱导组和相应对照组的第4周将细胞消化后进行相关基因RT-PCR分析，并将各组第1周、第4周的细胞进行qRT-PCR荧光定量分析。采集后各组的细胞数量均为1×105个，采用Trizol法进行总RNA提取。从NCBI中查询兔Runx2、PPAR-γ、Sox9、GAPDH进行引物设计，引物序列、产物大小见表1。定性PCR检测上述基因表达时，RNA提取、逆转录、PCR检测步骤都同上“PCR检测细胞表面标记mRNA表达”，而实时荧光定量PCR检测中基因逆转引物用的是Oligod(T)引物，其余操作也上“PCR检测细胞表面标记mRNA表达”。其中实时荧光定量PCR反应体系15μL：

SensiFASTTM SYBR(Bioline)7.5μL，上、下游引物(10μM)各0.25μL，cDNA各0.5μL，dH2O6.5μL。PCR条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，最佳退火温度65℃50s，40个循环，4℃保存。反应结束后取PCR产物，用EcoTM Real-Time PCR system进行荧光定量检测，并计算2^-ΔΔCt数值进行对比研究。图6。

上述方法制备的兔脐带间充质干细胞贴壁时间短，贴壁细胞成活率高；在体外成集落样生长，形态均一，增殖速度快，4代以内5d即可传一代；细胞的生长状态稳定，传至10代以上(本发明最高传至15代)细胞仍呈现梭形，旋涡状排列，细胞折光度仍然良好；并且经表面抗原检测及多向分化鉴定，获得的兔脐带间充质干细胞符合间充质干细胞产品合格标准，具有较高的增殖及分化潜力；可快速冻存，建立干细胞库；可直接应用于为以兔为实验动物的干细胞相关应用研究，同种异体移植极大程度上保证了脐带间充质干细胞的低免疫原性，降低异种异体移植中受体对干细胞的免疫反应，减少该因素对实验结果的干扰，在干细胞研究方面具有极为广阔的应用前景。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：选用兔脐带为原材料，包括以下步骤，

A.兔脐带组织的清洗：在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水或无菌PBS液体冲洗3-5次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血；

B.兔脐带组织的消化：将兔脐带组织放到100ml的无菌烧杯中，不剔除脐带血管，用无菌组织剪将兔脐带组织剪成1mm³的兔脐带组织块后，加入兔脐带组织块体积3-4倍的0.1％无菌胶原酶，无菌封装后，置于37-39℃、体积分数为4.5-5.5％CO₂培养箱中消化，直至兔脐带组织块消化完全；

兔脐带组织块消化完全后，用含体积分数为10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基中止消化，消化后不过滤；

C.细胞接种：将中止后的混合液置于低温离心机内离心后去除上清液，保留沉淀物，用含10％FBS、100U/ml青霉素和链霉素的L-DMEM培养基吹匀；将重悬液接种于培养瓶或培养皿中，静置于37-39℃、4.5-5.5％CO₂、92-96％饱和湿度的恒温培箱中培养；培养24h后全量换液，去除残存组织和未贴壁细胞，之后3天换液一次，至细胞融合达到80％时，传代培养，即时使用或冷冻保存备用。

2.根据权利要求1所述的一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：兔脐带组织从脐带沃顿胶、脐带血管周围或脐带血管内皮下的任何一处或多处选取。

3.根据权利要求1所述的一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤A中，在无菌条件下，收集兔脐带组织，用无菌生理盐水冲洗3次兔脐带组织，直至兔脐带组织内无兔血。

4.根据权利要求1所述的一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤C中，低温离心机以2500rmp的转速离心20分钟。

5.根据权利要求1所述的一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤B中，无菌封装后，置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中消化，直至兔脐带组织块消化完全。

6.根据权利要求1所述的一种兔脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤C中，将重悬液接种于培养瓶或培养皿中，静置于37℃、5％CO₂、95％饱和湿度的恒温培箱中培养。