CN114807011B - 一种暗纹东方鲀精巢细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种暗纹东方鲀精巢细胞系及其构建方法和应用，采用物理剪切配合胰酶消化法分离精巢组织细胞，进行原代培养，并在传代培养中，利用富营养培养基传代培养，继而成功构建了暗纹东方鲀精巢细胞系。本发明提供的暗纹东方鲀精巢细胞呈现上皮细胞形态，已连续培养超过100代，可提供大量的暗纹东方鲀精巢细胞，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。本发明提供的暗纹东方鲀精巢细胞系可直接用于暗纹东方鲀性别分化和发育相关基因表达调控研究，还可以作为暗纹东方鲀功能基因的体外研究平台。建立暗纹东方鲀精巢细胞系的应用价值显著，不仅有利于河鲀性别分化和发育相关领域的科学研究，也有利于促进暗纹东方鲀养殖产业的发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种暗纹东方鲀精巢细胞系及其构建方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）俗称河鲀，属于硬骨鱼纲、鲀形目(Tetrodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、东方鲀属(Takifugu)，主要分布在东海、黄海、渤海和长江中下游水域，是海淡水洄游性鱼类，可在淡水环境养殖。暗纹东方鲀肉质鲜美，是我国著名的“长江三鲜”之一，但野生河鲀的卵巢、肝、肾、血液等有毒，而精巢、肌肉和皮肤无毒。目前野生河鲀资源日趋枯竭，养殖河鲀已成为主要来源。暗纹东方鲀作为长江中下游特有的优质渔业种质资源，是全国主要的淡水养殖河鲀品种。随着2016年国家有条件放开红鳍东方鲀和暗纹东方鲀的养殖与加工，暗纹东方鲀的养殖产业迎来大规模增长。2020年全国河鲀养殖总产量比2014年增加了42%；其中淡水养殖河鲀总产量比2014年增加了104%。
除了肉质鲜美，雄性河鲀的精巢（俗称“白子”）更是补身之极品，含有丰富的蛋白质，口感爽滑细腻，深受消费者喜爱，具有重要的经济价值，雄性河鲀养殖效益更高。然而，由于河鲀性腺来源细胞系的缺乏，针对河鲀性别发育调控机制等方面的研究相对贫乏，尚无有效手段改善养殖群体的性别比。构建体外培养的性腺细胞系将成为研究暗纹东方鲀性别分化和发育调控机制的重要平台，为河鲀性别控制育种技术开发奠定基础。
目前，国内外尚未见有暗纹东方鲀稳定细胞系建立的报道，暗纹东方鲀精巢细胞系是首次建立的暗纹东方鲀细胞系，将成为暗纹东方鲀基因功能体外研究的重要平台。因此，建立暗纹东方鲀精巢细胞系的应用价值显著，不仅有利于河鲀性别分化和发育相关领域的科学研究，也有利于促进暗纹东方鲀养殖产业的发展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种暗纹东方鲀精巢细胞系及其构建方法和应用，为首次在体外成功培养，并可以稳定连续传代，是成功建立的第一株暗纹东方鲀体外培养细胞系，可提供大量的暗纹东方鲀精巢来源细胞，其细胞生长曲线正常、状态良好、特性稳定，可以冷冻保存，可以应用于性别分化和发育相关基因表达调控研究和外源基因功能研究。
为达到上述目的，本发明是采用下述技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种暗纹东方鲀精巢细胞系，为暗纹东方鲀精巢组织中分离的暗纹东方鲀精巢组织细胞，所述暗纹东方鲀精巢细胞系的保藏号为CCTCC NO：C2021144，于2021年10月20日保存于中国典型培养物保藏中心。
优选地，所述暗纹东方鲀精巢细胞系能稳定连续传代至少100代。
第二方面，本发明提供一种暗纹东方鲀精巢细胞系的构建方法，包括如下步骤：
配制暗纹东方鲀精巢细胞培养液；
将暗纹东方鲀精巢组织剪成小块，再加入胰酶继续剪碎成糜状并消化，收集消化后的细胞，将收集到的细胞加入暗纹东方鲀精巢细胞培养液中，在25~28℃下进行原代培养；
当原代培养细胞长满瓶底时，去除培养液，用胰酶消化，消化后去除胰酶，加入暗纹东方鲀精巢细胞培养液重悬细胞，分瓶加入暗纹东方鲀精巢细胞传代培养液中进行传代培养，直至细胞系建成。
在一些实施例中，将暗纹东方鲀精巢组织剪成小块前，还包括：将所述暗纹东方鲀精巢组织用含400 U/ml青霉素和400 μg/ml链霉素双抗的PBS溶液漂洗。
在一些实施例中，所述胰酶的浓度为0.1%~0.25 % w/v，消化时间为15~30 min，消化温度为24~28 ℃。
在一些实施例中，优选地，所述胰酶的浓度为0.25 % w/v，消化时间为15 min，消化温度为25 ℃。
在一些实施例中，所述暗纹东方鲀精巢细胞培养液为DFL培养液(需要说明的是，所述DFL培养液为实验室自制培养液)，所述DFL培养液包括终浓度为100 U/ml青霉素和100μg/mL链霉素的双抗溶液、10 ng/ml的人碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/ml的鼠表皮生长因子和15 ﹪胎牛血清，所述DFL培养液的pH为7.2。
在一些实施例中，当原代培养细胞长满瓶底时，去除培养液，用胰酶消化，消化后去除胰酶后，以1：2的比例加入新鲜的暗纹东方鲀精巢细胞培养液，并分瓶进行传代培养，每隔4~6天传代一次，直至细胞系建成。
第三方面，本发明提供一种暗纹东方鲀精巢细胞系在性别分化和发育相关基因表达调控研究中的应用。
第四方面，本发明提供一种暗纹东方鲀精巢细胞系在外源基因功能研究中的应用。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
1、本发明提供的暗纹东方鲀精巢细胞系为首次在体外成功培养，并可以稳定连续传代，是成功建立的第一株暗纹东方鲀体外培养细胞系，可提供大量的暗纹东方鲀精巢来源细胞。
2、本发明提供暗纹东方鲀精巢细胞呈现典型的上皮细胞形态，细胞生长温度为28℃，具有较强的增殖能力，已连续培养超过100代，细胞生长曲线正常、状态良好、特性稳定，可以冷冻保存。
3、本发明暗纹东方鲀精巢细胞显著表达雄性相关基因，可以应用于性别分化和发育相关基因表达调控研究；外源转染绿色荧光蛋白质粒可以观察到明显的绿色荧光，表明暗纹东方鲀精巢细胞系可以应用于外源基因功能研究。
附图说明
图1是本发明实施例提供的暗纹东方鲀精巢细胞系在相差显微镜下的暗纹东方鲀精巢细胞系的形态，其中，A为暗纹东方鲀精巢原代细胞；B为20代暗纹东方鲀精巢细胞；C为50代暗纹东方鲀精巢细胞；D为90代暗纹东方鲀精巢细胞；
图2是本发明实施例提供的暗纹东方鲀精巢细胞系在不同培养条件下的生长曲线图，其中，A为不同血清浓度的培养基；B为不同培养温度条件；
图3是本发明实施例提供的暗纹东方鲀精巢细胞系的染色体，其中，A为染色体数目分布；B为染色体中期分裂相；
图4是本发明实施例提供的暗纹东方鲀精巢细胞系的分子鉴定，其中，A为雄性性别分子鉴定图；B为性别相关基因表达鉴定图；
图5是本发明实施例提供的暗纹东方鲀精巢细胞系转染绿色荧光质粒后的荧光显微图片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要说明的是，以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供一种暗纹东方鲀精巢细胞系，为暗纹东方鲀精巢组织中分离的暗纹东方鲀精巢组织细胞，所述暗纹东方鲀精巢细胞系的保藏号为CCTCC NO：C2021144，于2021年10月20日保存于中国典型培养物保藏中心。
本发明提供的暗纹东方鲀精巢细胞系，能稳定连续传代至少100代。
本发明还提供一种所述的暗纹东方鲀精巢细胞系的构建方法，包括如下步骤：
配制暗纹东方鲀精巢细胞培养液；
将暗纹东方鲀精巢组织剪成小块，再加入胰酶继续剪碎成糜状并消化，收集消化后的细胞，将收集到的细胞加入暗纹东方鲀精巢细胞培养液中，在25~28℃下进行原代培养；需要说明的是，将暗纹东方鲀精巢组织剪成小块前，还包括：将所述暗纹东方鲀精巢组织用含400 U/ml青霉素和400 μg/ml链霉素双抗的PBS溶液漂洗。
本发明中，所述胰酶的浓度可以为0.1%~0.25 % w/v，消化时间为15~30 min，消化温度为25~28 ℃。
优选地，所述胰酶的浓度为0.25 % w/v胰酶，消化时间为15 min，消化温度为25℃。
在一些实施例中，所述暗纹东方鲀精巢细胞培养液为DFL培养液，所述DFL培养液包括终浓度为100 U/ml青霉素和100 μg/mL链霉素的双抗溶液、10 ng/ml的人碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/ml的鼠表皮生长因子和15 ﹪胎牛血清，所述DFL培养液的pH为7.2。
需要说明的是，所述暗纹东方鲀精巢细胞培养液在原代培养时，可以选用18 ﹪胎牛血清或者20 ﹪胎牛血清，所述培养液的pH可以为7.2~7.4，本发明不限于此，只要能够使得细胞保持正常生长即可。
在一些实施例中，当原代培养细胞长满瓶底时，去除培养液，用胰酶消化，消化后去除胰酶后，以1：2的比例加入新鲜的暗纹东方鲀精巢细胞培养液，并分瓶进行传代培养，每隔4~6天传代一次，直至细胞系建成。
当原代培养细胞长满瓶底时，去除培养液，用胰酶消化，消化后去除胰酶，加入暗纹东方鲀精巢细胞培养液重悬细胞，分瓶加入暗纹东方鲀精巢细胞传代培养液中进行传代培养，直至细胞系建成。
本领域技术人员可以将所述的暗纹东方鲀精巢细胞系在性别分化和发育相关基因表达调控研究中进行应用。
本领域技术人员还可以将所述的暗纹东方鲀精巢细胞系在外源基因功能研究中进行应用。
下面结合实施例对本发明中的技术方案做出详细的说明，但并不局限于此。
实施例1 暗纹东方鲀精巢细胞的分离培养和传代
（1）细胞的分离与原代培养：取体重80~100 g的健康暗纹东方鲀，先将暗纹东方鲀放入75%酒精中浸泡3 min。取出后放入超净台，无菌条件下取出精巢组织，置于含400 U/ml青霉素和400 μg /ml链霉素的胎牛血清FBS中漂洗3次。随后取出精巢组织置于烧杯中，用灭菌剪刀将组织剪成小块，再加入1 ml的0.25% 胰酶，继续剪碎成糜状。置于室温条件下静置消化15 min后，利用40 μm细胞筛过滤胰酶消化的细胞悬液，将过滤后的细胞悬液离心去上清，收集细胞沉淀，加入5 ml暗纹东方鲀精巢细胞培养液，移入25 cm2细胞培养瓶，置于28℃培养箱中培养。培养48 h后，观察细胞贴壁情况；培养4天后，将培养瓶中的半量培养液吸出，更换新鲜培养基继续培养，此后每隔4天更换一次。
（2）细胞的传代培养：当原代培养细胞生长至铺满培养瓶底90%以上面积时，吸出旧的培养液；向瓶中加入胎牛血清FBS，清洗细胞1次，吸出胎牛血清FBS后加入1 ml的0.25%胰酶；待显微镜下观察到细胞收缩时吸出胰酶，加入2 ml新鲜细胞培养液，轻轻吸打使细胞脱离培养瓶底，按1：1（v/v）比例分入两个细胞瓶。分别将每个细胞瓶的细胞培养液补足至5ml，吸打混匀细胞悬液后置于28℃培养箱中培养，此后每隔5~6天传代一次。
图1为暗纹东方鲀精巢细胞系传代培养不同代数后，在相差显微镜下观察的形态，呈现典型的上皮样细胞形态。其中，A为暗纹东方鲀精巢原代细胞；B为20代暗纹东方鲀精巢细胞；C为50代暗纹东方鲀精巢细胞；D为90代暗纹东方鲀精巢细胞。
实施例2 暗纹东方鲀精巢细胞系的冻存与复苏
（1）细胞的冻存：选取不同代数的细胞，待细胞生长密度达到90﹪时，按常规方法，吸弃旧培养基，加入1ml胰酶消化液消化；观察到细胞收缩时吸出胰酶，加入2 ml新鲜细胞培养液。再将细胞移入5 ml离心管，1000 g离心5 min，去上清。加入1 ml细胞冻存液，重悬细胞后移入冻存管。将冻存管放入程序降温盒中，-80℃放置24 h，随后转移至液氮中长期保存。
（2）细胞的复苏：将液氮中保存的细胞取出，迅速置于37℃水浴中，不断晃动冻存管，使细胞快速融化。1000 g离心5 min，去上清。加入1 ml新鲜细胞培养液，重悬细胞后移入25 cm2细胞培养瓶。补足培养基至5 ml，置于28℃培养箱中培养。待细胞贴壁后更换新鲜细胞培养液继续培养，4~6天后正常传代培养。复苏后的细胞存活率达60%以上，可传代培养，细胞形态和生长特性无改变。
实施例3 暗纹东方鲀精巢细胞系生长特性测定
（1）最适血清浓度的确定：分别配制含有胎牛血清FBS浓度为5%、10%、15%、20%的细胞培养液，图2为暗纹东方鲀精巢细胞系在不同培养条件下的生长曲线图：A为不同血清浓度的培养基；B为不同培养温度条件。
取第45代精巢细胞，以2.5×104个细胞/mL的密度分别配制四种血清浓度的细胞悬液，接种于12孔板，置于28℃的培养箱中培养。此后每天同一时间，取每种血清浓度的3孔细胞，按常规胰酶消化方法消化，收集细胞，用细胞计数板计数，连续计数7天。以培养时间为横坐标，每ml培养液中的细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。如图2A所示，细胞在15%以上血清浓度的细胞培养液中生长状态比较稳定，细胞增殖速度随血清浓度上升而加快。
（2）最适培养温度的确定：取第48代精巢细胞，选择20℃、24℃、28℃、32℃、37℃五个不同培养温度，使用含15％胎牛血清FBS的细胞培养液，以1.5×105个细胞/mL的密度配制细胞悬液，接种于12孔板，分别置于20℃、24℃、28℃、32℃、37℃五种不同温度的培养箱中培养。此后每天同一时间，取每种培养温度的3孔细胞，按常规胰酶消化方法消化，收集细胞，用细胞计数板计数，连续计数7天。以培养时间为横坐标，每ml培养液中的细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。如图2B所示，细胞在24℃和28℃下生长状态良好，其中28℃下细胞生长速度相对快些。
实施例4 暗纹东方鲀精巢细胞的染色体分析
取第55代精巢细胞，28℃培养48 h，在培养基中加入终浓度为10 μg/mL的秋水仙素，继续培养6 h后去除培养液，胎牛血清FBS冲洗后，加入胰酶消化，消化后1000 g离心5min收集细胞，用0.075 mol/L的KCl在37℃低渗处理30 min。加入1 mL预冷的卡诺固定液，预固定 2 min。1000 g离心5 min去上清后，再加入预冷的卡诺固定液37℃水浴固定20min，重复3次。用冷滴片法进行滴片，干燥后用10％的Giemsa染色，10 min后清水冲洗，自然晾干。显微镜下观察，选择100个分裂相进行分析和统计。图3为暗纹东方鲀精巢细胞系的染色体，其中，A为染色体数目分布；B为染色体中期分裂相。从图3中可以看出，暗纹东方鲀精巢细胞的染色体众数为44条，染色体核型为2n=44t。
实施例5 暗纹东方鲀精巢细胞的分子鉴定
图4为暗纹东方鲀精巢细胞系的分子鉴定，其中，A为雄性性别分子鉴定图；B为性别相关基因表达鉴定图。
（1）暗纹东方鲀amhr2基因的SNP位点检测：收集培养的暗纹东方鲀精巢细胞，使用DNA提取试剂盒(Promega)按照操作规程分离细胞总DNA。利用amhr2基因的SNP差异位点设计引物进行PCR扩增。PCR产物经纯化后测序，结果显示精巢细胞amhr2基因的SNP位点为杂合基因型(C/G)，符合暗纹东方鲀雄性遗传性状（图4A）。
（2）暗纹东方鲀性别相关基因的表达检测：收集培养的暗纹东方鲀精巢细胞，去除培养液后，用Trizol方法提取细胞总RNA，使用 Takara PrimeScript™ RT reagent Kitwith gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒按照操作步骤进行逆转录，合成cDNA模板。再利用qPCR技术检测与鱼类性别分化相关的基因gsd、foxl2、amhr2、dmtr1、gdf6、sox3、cyp19a1的表达。结果显示与雄性性别相关的基因amhr2、dmtr1、gdf6在暗纹东方鲀精巢细胞中表达显著，而与雌性相关的基因在暗纹东方鲀精巢细胞中的表达不明显（图4B）。
实施例6 暗纹东方鲀精巢细胞的外源质粒转染实验
取生长旺盛的暗纹东方鲀精巢细胞，按常规方法消化传代，调整细胞浓度至106个细胞/ml，接种于24孔板中，28℃培养过夜。待细胞铺板密度达80%-90%时，用Lipofectamine2000 （Invitrogen）进行转染，将0.8 μg pEGFP-N3质粒和2 μl Lipofectamine 2000分别用50μl Opti-MEI培养基稀释，室温孵育5 min。再将稀释后的pEGFP-N3质粒和Lipofectamine 2000混合，混匀后室温放置20 min。去除24孔板中细胞培养液，换成不含血清的新鲜培养液，将100 μl转染液加入细胞中，28℃培养5 h，再更换成含血清的普通细胞培养液，继续培养18 h后，在荧光显微镜下观察拍照。
图5为暗纹东方鲀精巢细胞系转染绿色荧光质粒后的荧光显微图片，从图5中可以看出，pEGFP-N3质粒转染到暗纹东方鲀精巢细胞后可明显观察到绿色荧光，转染效率较高，表明暗纹东方鲀精巢细胞可以高效表达外源基因，能应用于外源基因的体外表达实验及基因功能研究。
综上，本发明提供的暗纹东方鲀精巢细胞系为首次在体外成功培养，采用物理剪切配合胰酶消化法分离精巢组织细胞，进行原代培养，并在传代培养中利用富营养培养基传代培养，继而成功构建了暗纹东方鲀精巢细胞系，是成功建立的第一株暗纹东方鲀体外培养细胞系，可提供大量的暗纹东方鲀精巢来源细胞。所述暗纹东方鲀精巢细胞呈现典型的上皮细胞形态，细胞生长温度为28℃，具有较强的增殖能力，已连续培养超过100代，细胞生长曲线正常、状态良好、特性稳定，可以冷冻保存。
所述暗纹东方鲀精巢细胞显著表达雄性相关基因，可以应用于性别分化和发育相关基因表达调控研究；外源转染绿色荧光蛋白质粒可以观察到明显的绿色荧光，表明暗纹东方鲀精巢细胞系可以应用于外源基因功能研究。
因此，建立暗纹东方鲀精巢细胞系的应用价值显著，不仅有利于河鲀性别分化和发育相关领域的科学研究，也有利于促进暗纹东方鲀养殖产业的发展。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1. 一种暗纹东方鲀精巢细胞系，为暗纹东方鲀精巢组织中分离的暗纹东方鲀精巢组织细胞，所述暗纹东方鲀精巢细胞系的保藏号为CCTCC NO：C2021144。
2.一种权利要求1所述的暗纹东方鲀精巢细胞系在性别分化和发育相关基因表达调控研究中的应用。
3.一种权利要求1所述的暗纹东方鲀精巢细胞系在外源基因功能研究中的应用。
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