CN104630133A - 一种牙鲆精巢细胞系的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及海水鱼类细胞培养技术，具体说是一种牙鲆精巢细胞系的构建方法。是采用组织块胰酶消化法进行精巢组织原代培养，并在传代培养中采用富于营养的培养基和温和的胰酶消化传代方法，继而构建细胞系。建立的牙鲆精巢细胞系细胞形态为成纤维样，该细胞系能提供大量精巢细胞。不仅可直接用于牙鲆性别分化相关功能基因的研究，而且可望成为牙鲆分子细胞水平理论研究的平台。本发明所述的牙鲆精巢细胞系的构建方法可以应用于其他鱼类精巢细胞离体培养。

Description

一种牙鲆精巢细胞系的构建方法

技术领域

本发明涉及海水鱼类细胞培养技术，具体说是一种牙鲆精巢细胞系的构建方法。

背景技术

构建与培养动物细胞系早已成为研究内分泌学、毒理学、遗传学、病毒学、免疫学、肿瘤治疗的有力工具。截至目前已有近280余株不同的鱼类细胞系相继建立起来，而海水鱼类及咸水鱼类的细胞系仅有约100株，远远不能满足其在生理学、病毒学、毒理学、肿瘤及基因工程等多个领域的应用需求。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)，属硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、鲽形目、鲽亚目、牙鲆科、牙鲆属。其肉质鲜嫩，是重要的海水增养殖鱼类之一。与大多数鲆鲽鱼相似，雌性鱼个体比相应的雄性个体大的特性使得全雌养殖倍受重视。牙鲆的性染色体属于XX-XY型，至今未找到性染色体和性别决定基因(Fujiwara等，2007)，其性别表型的形成是由遗传和环境因子协同作用而致(GSD+TSD，Luckenbach等，2009)。有关牙鲆性别分化分子生物学的研究，目前国内外学者研究多注重于性别相关基因的克隆和表达谱分析，缺乏深入地探讨。其中，牙鲆性腺来源细胞系的缺乏，限制了其性别相关基因的功能研究以及性别表达调控机制的揭示。同时，近年来，随着环境污染日益加剧和养殖业过度膨胀，病害问题造成严重的经济损失，极大影响了牙鲆养殖业的健康发展。因此，伴随着性别控制和病害防治研究的深入，体外分离培养牙鲆细胞的应用意义日益凸显。但是，迄今为止，国内外仅有牙鲆鳍条细胞系(中国海洋大学，童裳亮，Aquaculture,1997,156:327-333)、胚胎细胞系(中国水产研究院黄海水产研究所，陈松林，Diseases of Aquatic Organisms,2004,60:241-246)、肾脏细胞系(中国水产研究院黄海水产研究所，王娜，Journal of Fish Diseases,2011,34:81-85)和申请人所在实验室建立的脑细胞系、肌卫星细胞系等5个细胞系，未见有该鱼种性腺组织细胞系建立的报道。因此，体外培养的精巢细胞将成为研究牙鲆性别相关基因功能、性别分化及病害防治的重要研究平台。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培养操作简便的牙鲆精巢细胞系的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种牙鲆精巢细胞系的构建方法：

(1)原代培养：取健康雄鱼精巢于DF12培养基(含400U/mL青霉素，400μg/mL链霉素)中，PBS清洗后将精巢组织充分剪碎，并加入胰蛋白酶消化，而后用细胞培养液充分悬浮，离心收集沉淀，向沉淀中加入细胞培养液使其悬浮，25±0.2℃培养箱正置培养；次日，待组织块完成贴壁后小心补加细胞培养液；

(2)传代培养：待原代培养组织块周围细胞迁出、增殖至形成巢式细胞晕时，加入0.25％胰蛋白酶消化悬起细胞，利用细胞培养液进行原瓶初次传代培养,待原瓶传代细胞长满瓶底后，以1:1-1:2(v/v)分瓶传代，以后7-10d传代一次；传至10代后将细胞培养液中的血清含量减为细胞培养液总体积的10％，目前，该细胞已经传至40余代(42-47代)，细胞系建立成功；

所述细胞培养液为在DF12培养液中加入占细胞培养液总体积20％的胎牛血清，10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant HumanFGFb，bFGF)，15ng/ml重组人表皮生长因子(Recombinant Human EGF，EGF)，pH值为7.2-7.4，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，4℃存放，备用。

步骤(1)中清洗后精巢组织剪成糜状。

在步骤(1)中精巢组织剪成糜状后，加入0.25(wt)％胰蛋白酶消化10min。

在步骤(1)培养中的精巢组织外植体小块经短暂消化和离心收集后，先用细胞培养液悬浮后在培养箱中正置过夜培养，待组织块贴壁，第二天再补加细胞培养液。

在步骤(2)中，细胞初次传代时将吸出的旧培养基转入一备用离心管内，待细胞消化完成后在新鲜培养液中加入备用离心管内的旧培养液制备1:1(v/v)比例细胞悬液进行传代。

本发明所具有的优点和积极效果如下：

采用本发明方法构建的牙鲆精巢细胞系可以进行连续传代，目前已传40余代，能提供大量的牙鲆精巢细胞，细胞生长温度为25℃，细胞形态为成纤维样，生长曲线正常，染色体众数为正常的48条，也检测到雄性相关基因dmrt1的表达，可以应用于性别分化和病理学研究；而且，以pEGFP-N3进行基因转染实验，观察到较强的绿色荧光，证实牙鲆精巢细胞系可以直接应用于外源基因功能研究。

附图说明

图1A、图1B为本发明实施例提供的相差显微镜下传代培养的牙鲆精巢细胞系图，其中A为牙鲆精巢细胞原代培养第13天图(100×)；B为牙鲆精巢细胞第25代图(100×)。

图2为本发明实施例提供的牙鲆精巢细胞系第27代的生长曲线图。

图3为本发明实施例提供的牙鲆精巢细胞系的第31代染色体中期分裂相(200×)。

图4为本发明实施例提供的dmrt1基因对牙鲆精巢细胞分子鉴定图。其中M为天根公司DS^TM2000Marker；A为dmrt1；B为以ddW代替cDNA作为模板的阴性对照。

图5为本发明实施例提供的牙鲆精巢细胞系转染pEGFP-N3后的荧光显微图片(100×)。

具体实施方式：

本发明建立了鱼类精巢细胞的分离及离体培养体系，操作方法简单，重复性强，较之前报道的其他鱼类的精巢细胞的分离及培养方法更容易掌握和操作，应用价值极大，为进一步的实验研究提供了材料和技术支持。

下面结合实施例详述本发明的构建、鉴定和应用方法。

实施例1

牙鲆精巢细胞系的建立方法，步骤如下：

1)配制细胞培养液：取Hyclone公司DF12培养液，向培养液中加入占细胞培养液总体积20％的胎牛血清，10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant Human FGFb，bFGF)，15ng/ml重组人表皮生长因子(Recombinant Human EGF，EGF)，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，pH值为7.2，4℃存放，备用。

2)原代培养：无菌条件下取体重为347.5g健康牙鲆的精巢组织，置于添加了400U/mL青霉素和400μg/mL链霉素的4mL Hyclone公司DF12培养液的无菌玻璃平皿中浸泡5min后，吸弃培养液，用2mL PBS(pH 7.2)冲洗精巢组织两次，吸出PBS，将精巢组织剪成糜状小块，加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化10min，再加入3mL上述步骤1)细胞培养液充分悬浮，2200g快速离心2min,吸弃上清，向组织小块沉淀中加入1mL上述步骤1)细胞培养液用枪轻轻吸打悬浮后接种于25cm²培养瓶，于25±0.2℃培养箱正置培养。次日，待组织块完成贴壁后小心补加1mL细胞培养液，然后每隔4d半量更换培养瓶中细胞培养液一次。

3)传代培养：待步骤2)原代培养细胞不断从组织块周围迁出并快速增殖，当组织块周围细胞晕形成并停止生长后，将旧的培养液移入一备用无菌离心管内，用PBS(pH 7.2)冲洗细胞1次，吸弃PBS，加入1mL的0.25％胰蛋白酶液消化。显微镜下观察到细胞收缩即吸弃胰蛋白酶液，继续在显微镜下观察，待细胞消化完全，在原瓶中加入新鲜培养液与旧的培养液按照1：1(v/v)比例混合得到的培养液悬浮细胞后进行传代。在后续继代培养期间，当细胞长满瓶底时，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，加入2mL新鲜细胞培养液轻轻吸打使细胞悬浮，按1：1(v/v)的比例进行分瓶传代；根据细胞生长状态，约7-10d传代一次；传至10代后，进行1：1-1：2(v/v)分瓶传代，每3-5d传代一次，进而细胞系建立成功。目前，该细胞已经传至42代。细胞已能稳定增殖，细胞系命名为POTC。该细胞系主要细胞类型为成纤维样细胞(如图1A、B所示)。

实施例2

牙鲆精巢细胞系的鉴定和应用

1)细胞的冻存与复苏

细胞的冻存：

选取不同代数上述处于指数生长期、细胞密度达到90％以上的传代培养精巢细胞，按常规方法消化，消化后显微镜下观察到细胞收缩即吸弃胰蛋白酶液，继续在显微镜下观察，待细胞消化完全，在原瓶中加入2mL新鲜的上述实施例步骤1)配制细胞培养液制备细胞悬液。将细胞悬液转移至15mL离心管中，以2200g离心3min，弃上清。用2mL预冷的冻存液(含10％二甲基亚砜的Hyclone公司DF12细胞培养液)悬浮细胞，并移至2mL冻存管中，将冻存管放入程序降温盒中依次于4℃放置30min，-20℃放置2h，-80℃放置过夜，然后移至液氮中保存，并做好记录。

细胞的复苏：

自液氮中取出保存的冻存管，迅速置于42℃水浴中融化，2200g离心3min，弃上清，于沉淀中加入2mL上述实施例步骤1)配制的细胞培养液悬浮上述冻存细胞，转至25cm²培养瓶，放置于培养箱中25±0.2℃培养，次日待细胞贴壁后更换新鲜细胞培养液，复苏后细胞存活率为55-65％，复苏细胞生长速度、形态无明显差异。

2)细胞生长曲线绘制

为了分析牙鲆精巢细胞系的生长情况，取27代精巢细胞，按照3.5×10⁴个细胞/mL的密度接种12孔板，将细胞培养板置于25℃培养箱中培养。分别在接种后的8d中每天同一时间按照常规胰蛋白酶液消化法消化，收集3孔细胞，用细胞计数板计数。以培养时间为横坐标，以每mL培养液中的细胞数量为纵坐标，绘制生长曲线，如图2所示。

3)染色体分析

取31代牙鲆精巢细胞，按照1×10⁶个细胞/mL的密度接种于25cm²的培养瓶中，25±0.2℃下培养24h，加入终浓度1μg/mL的秋水仙素3.5h后，按照常规胰蛋白酶液消化法消化，消化后以2200g离心3min收集细胞，细胞沉淀中加入5mL 0.075mol/L KCl溶液37℃水浴低渗处理30min后，加入1mL预冷的卡诺固定液(甲醇：乙酸＝3：1(v/v))预固定2min，固定后以1000g离心6min后弃上清，细胞沉淀用5mL预冷卡诺固定液固定15min后以1000g离心6min收集细胞，重复操作三次。然后将细胞重悬于0.5mL预冷卡诺固定液中，将细胞悬液以冷滴法滴片，迅速酒精灯外焰上方10cm处过火，风干，10％吉姆萨染色30min，用Nikon显微镜观察。结果显示牙鲆精巢细胞的染色体众数为48条(图3)，均为端部着丝粒染色体，染色体核型为2n＝48t。

4)精巢细胞的分子鉴定

为了验证所得到的细胞系是精巢细胞，进行了精巢细胞相关基因dmrt1的RT-PCR检测：用Trizol法提取精巢细胞总RNA，使用Promega公司M-MLV反转录酶反转录合成cDNA第一链作为模板。PCR反应体系：2×Es TaqMasterMix 12.5μL,dmrt1正向引物(Dm1qpF，GCTTCTGCAACTGGAGGGACTG)和反向引物(Dm1qpR，GAGGATGATGCCGAGCGACT)各1μL(10μmol/L),cDNA模板1μL，RNase-Free Water 9.5μL总体积为25.0μL。PCR反应条件为94℃5min，然后94℃30s,60℃30s，72℃25s,35个循环，72℃7min再延伸，最后15℃保存。琼脂糖凝胶电泳结果显示细胞中dmrt1表达很强，条带大小与预期大小结果相同，测序结果比对与牙鲆dmrt1序列一致，证明所培养的细胞为精巢细胞(图4)。

5)GFP报告基因在精巢细胞中的表达

转染前一天，取第25代精巢细胞，用2mL上述实施例步骤1)配制的2mL细胞培养液悬浮，以5×10⁵个细胞/孔的密度接种于24孔板中，25±0.2℃培养。转染时，细胞密度超过80％，以Invitrogen公司的Lipofectamine 2000转染pEGFP-N3。具体步骤为将2μL pEGFP-N3(400ng/μL)溶于48μL Hyclone公司的DF12细胞培养液，在另一个离心管中将1μL Lipofectamine 2000溶于49μL Hyclone公司的DF12细胞培养液，5min后，将上述两管溶液混合，室温孵育25min。将上述100μL混合液加入到包含500μL不含血清的上述实施例步骤1)配制细胞培养液的24孔板的一孔中，25±0.2℃培养4.5h后，吸出培养液，加500μL按照上述实施例步骤1)配制的细胞培养液，72h后，用Nikon ECLIPSE TE2000-U荧光显微镜观察绿色荧光的表达，发现约有10％以上的细胞表达较强荧光(图5)。

上述实施例表明，用本发明方法建立的牙鲆精巢细胞系，生长曲线正常，染色体众数为正常的48条，可以进行连续传代，也可以对其进行冷冻保存。以pEGFP-N3进行基因转染实验，也观察到较强的绿色荧光，证实牙鲆精巢细胞系可以直接应用于外源基因功能研究。

本发明牙鲆精巢细胞系的建立方法重复性强，经染色体鉴定结果可信，取材的牙鲆体重恰当，操作方法简便，也可以适用于构建其他鱼类精巢细胞系。

Claims (5)

1.一种牙鲆精巢细胞系的构建方法，其特征在于：

(1)原代培养：取健康雄鱼精巢于DF12培养基(含400U/mL青霉素，400μg/mL链霉素)中，PBS清洗后将精巢组织充分剪碎，并加入胰蛋白酶消化，而后用细胞培养液充分悬浮，离心收集沉淀，向沉淀中加入细胞培养液使其悬浮，25±0.2℃培养箱正置培养；次日，待组织块完成贴壁后小心补加细胞培养液；

(2)传代培养：待原代培养组织块周围细胞迁出、增殖至形成巢式细胞晕时，加入0.25％胰蛋白酶消化悬起细胞，利用细胞培养液进行原瓶初次传代培养,待原瓶传代细胞长满瓶底后，以1:1-1:2(v/v)分瓶传代，以后7-10d传代一次；传至10代后将细胞培养液中的血清含量减为细胞培养液总体积的10％，目前，该细胞已经传至40余代，细胞系建立成功；

所述细胞培养液为在DF12培养液中加入占细胞培养液总体积20％的胎牛血清，10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant HumanFGFb，bFGF)，15ng/ml重组人表皮生长因子(Recombinant Human EGF，EGF)，pH值为7.2-7.4，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，4℃存放，备用。

2.按照权利要求1所述的鱼类精巢组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：步骤(1)中清洗后精巢组织剪成糜状。

3.按照权利要求1所述的一种牙鲆精巢组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：在步骤(1)中精巢组织剪成糜状后，加入0.25(wt)％胰蛋白酶消化10min。

4.按照权利要求1所述的一种牙鲆精巢组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：在步骤(1)培养中的精巢组织外植体小块经短暂消化和离心收集后，先用细胞培养液悬浮后在培养箱中正置过夜培养，待组织块贴壁，第二天再补加细胞培养液。

5.按照权利要求1所述的一种牙鲆精巢组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：在步骤(2)中，细胞初次传代时将吸出的旧培养基转入一备用离心管内，待细胞消化完成后在新鲜培养液中加入备用离心管内的旧培养液制备1:1(v/v)比例细胞悬液进行传代。