CN104152402A

CN104152402A - 一种半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系的构建与应用方法

Info

Publication number: CN104152402A
Application number: CN201410422656.2A
Authority: CN
Inventors: 孙爱; 陈松林; 沙珍霞; 王娜
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2014-08-26
Filing date: 2014-08-26
Publication date: 2014-11-19

Abstract

本发明的目的在于提供一种海水经济鱼类半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织细胞系的建立方法，从而建立半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织细胞系，为研究半滑舌鳎性别分化和性别反转调控机制提供基础。本发明的构建方法是利用半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织成功建立了半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系，建立的细胞系可以连续传代，经过这种方法所获得的传代细胞可传60代以上，能提供大量的伪雄鱼性腺细胞。可广泛用于外源基因、质粒的转染，性别相关基因功能的研究，也可用于鱼类常见病毒的繁殖及病毒与细胞相互作用机制的研究，还可以进行环境污染物检测等，具有重要的实际应用价值。

Description

一种半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系的构建与应用方法

技术领域

本发明属于海水鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种海水鱼类半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)伪雄鱼性腺组织细胞系的构建与应用方法。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国北方沿海经济海水鱼类，其雌雄个体间存在明显的生长速度差异，雌鱼生长速度为雄鱼的2～4倍。研究表明半滑舌鳎属于ZW/ZZ型性别决定机制，雌鱼具有异型W染色体。此外，经研究发现半滑舌鳎中存在自然性逆转现象，自然性逆转鱼的遗传性别为雌性，而表现出的生理性别为雄性，其染色体为异型(ZW型)，被称为伪雄鱼。据检测半滑舌鳎伪雄鱼占总数的比例约为14％。性逆转的伪雄鱼(ZW)与雌鱼交配(ZW)会得到75％的雌性个体和25％的雄性个体，因此研究半滑舌鳎自然性逆转现象具有重要的经济意义和理论研究价值。

经组织学观察发现伪雄鱼性腺组织中有大量的精母细胞，细胞形态与正常雄鱼的一致，但数量比正常雄鱼的略少。且伪雄鱼精巢组织中除生殖细胞外，还有大量的体细胞。生殖细胞和体细胞之间的相互作用在鱼类早期的性别决定和精巢发育中起着重要作用。精巢中serdoli细胞的主要作用是为生殖细胞提供支持、营养以及合成大量的类固醇激素来调节精细胞的自我更新及发育分化为成熟的精子。

半滑舌鳎伪雄鱼性腺体细胞系能够正常表达性腺特异功能基因，从而可应用于性别相关基因的功能研究，对于研究鱼类性别分化及性别决定具有重要的实际意义。此外半滑舌鳎伪雄鱼性腺体细胞系的建立对于研究生殖细胞与体细胞相互关系以及精原细胞分化为成熟精子的调控机制具有重要的应用价值。性腺体细胞系还可广泛应用到病毒学、免疫学、基因组学、发育生物学及环境毒理学等研究领域。

传统细胞培养方法并不适合半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织细胞系的建立，例如酶消化方法处理组织后获得的细胞数量很少，无法启动原代培养；而传统组织块法启动原代培养时，组织块难于贴壁且培养瓶底部杂质太多细胞无法从组织块中迁出。鲆鲽鱼类性腺组织细胞系的建立一直是鱼类细胞培养中的难点，到目前为止半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织细胞系仍未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种海水经济鱼类半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织细胞系的建立方法，从而建立半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织细胞系，为研究半滑舌鳎性别分化和性腺成熟调控机制提供基础。

本发明的半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织细胞系的构建，包括如下的步骤：

1)在无菌条件下取下半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织，在培养液中将组织剪成小块，将组织块用PBS溶液反复冲洗5次以上；

所述培养液为5％FBS-DMEM/F12完全培养液；

2)离心去掉PBS溶液后，用DMEM/F12无血清培养基悬浮组织块后，均匀接种到培养瓶中，不添加培养液倒置于24℃生化培养箱中；

3)然后补加专用培养液，并将细胞培养瓶正置，添加DMEM/F12专用培养液。

4)原代培养过程中每2天更换一半专用培养液，细胞长满单层后进行传代培养，传至60代完成伪雄鱼性腺细胞系的构建。

其中，专用培养液为含有20％胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、30μg/ml盐酸四环素、5～10ng/ml的人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20～40ng/ml的类胰岛素样细胞生长因子Ⅰ(IGF-1)、80～100IU/ml人绒毛膜促性腺激素(HCG)和10～20IU/ml孕马血清促性腺激素(PMSG)的DMEM/F12完全培养液。

步骤1)的PBS溶液冲洗次数为5～7次；

步骤2)的组织块均匀接种后，将细胞培养瓶倒置放在培养箱中培养，使组织块干贴，倒置干贴的最适时间为6～8小时；

步骤3)干贴结束后先补加培养液2～2.5ml，再将培养瓶正置，正置过程需缓慢进行，持续时间约1～3min，否则培养液容易冲击组织块，将组织块冲掉；

步骤4)的传代培养，其步骤为：卵巢细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化后；吸去胰蛋白酶溶液，每个培养瓶中加入培养液，吹打培养瓶底钟制成卵巢细胞悬液；取出卵巢细胞悬液，加入到新的培养孔中，每个培养孔补加培养液进行培养。

本发明的构建方法是利用半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织成功建立了半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系，建立的细胞系可以连续传代，经过这种方法所获得的传代细胞可传60代以上，能提供大量的伪雄鱼性腺细胞。可广泛用于外源基因、质粒的转染，性别相关基因功能的研究，也可用于鱼类常见病毒的繁殖及病毒与细胞相互作用机制的研究，还可以进行环境污染物检测等，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1：半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系细胞原代及传代光镜照片：

其中：A，原代半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞长成单层；B，半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞第15代；C，半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞第30代；D，半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞第60代。标尺＝100μm；

图2：半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系细胞生长曲线；

图3：半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系核型分析；

图4：半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系冻存与复苏；

图5：半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织生理性别鉴定；

其中：A，建系所用半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织HE切片(40倍)；B，建系所用半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织HE切片(100倍)。标尺＝100μm。

图6：半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系细胞遗传性别鉴定；

其中OV为卵巢，TE为精巢，pmGO为伪雄鱼性腺，pmCSG为伪雄鱼性腺细胞系。

图7：半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系细胞转染pEGFP-N3质粒的光镜及荧光照片；

其中，A，转染pEGFP-N3质粒后性腺细胞光镜照片；B，同一视野下转染pEGFP-N3质粒后细胞荧光照片。

图8：半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系细胞转染带有cy3荧光标记的siRNA后光镜及荧光照片；

A，转染siRNA后性腺细胞光镜照片；D，同一视野下转染siRNA后细胞荧光照片。

图9：半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系细胞功能基因的表达分析。

具体实施方式

由于半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织在生理结构和生长代谢上存在一定特殊性，已有的细胞培养添加物和原代培养方法无法启动细胞原代培养并进行传代。因此申请人在长期研究该细胞生长规律的基础上对培养液添加物进行了优化，对组织块培养法进行了改进，从而获得了本发明。

本发明构建方法的总体步骤如下：

1.健康半滑舌鳎在70％乙醇中消毒1分钟，无菌超净台中取下伪雄鱼性腺组织，剥离组织最外层膜，在5％FBS-DMEM/F12完全培养液中将组织剪成1mm³的小块，PBS冲洗5～7遍，性腺组织中粘液及杂质较多，如果清洗不干净则不利于组织块贴壁及细胞迁出。用1ml不含血清的DMEM/F12培养基悬浮组织块，(如果添加血清不利于组织块贴壁)，接种到25cm²细胞培养瓶中，倒置于生化培养箱中培养。

2.6～8小时后补加专用培养液2～2.5ml，并缓慢将细胞培养瓶正置，48小时后补加专用培养液1ml，此后每2天更换一半培养液。细胞长成单层后用胰酶消化法传代培养，传代至60代以上完成了半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织细胞系的构建。

3.伪雄鱼性腺细胞系专用培养液的配制：取DMEM/F12培养基粉末三蒸水溶解后调pH值为7.0，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌备用；取80ml配好的DMEM/F12液体培养基，加入胎牛血清20ml、10000IU青霉素、10mg链霉素、1～5mg盐酸四环素、1～2μg的人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、1～2μg的类胰岛素样细胞生长因子Ⅰ(IGF-1)、8000～10000IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)和1000～2000IU孕马血清促性腺激素即为本发明的伪雄鱼性腺细胞专用培养液。

4、半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞的继代培养：待伪雄鱼性腺细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1ml浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化0.5～1.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养瓶中加入2毫升的上述专用培养液，用移液器吹打培养瓶底1～3分钟制成伪雄鱼性腺细胞悬液；从培养瓶中取出1毫升伪雄鱼性腺细胞悬液，加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2毫升，使之最终体积至3毫升；待伪雄鱼性腺细胞再次长成单层后，仍以上述方法进行传代培养。

实施例1

健康半滑舌鳎在70％乙醇中消毒1分钟，无菌超净台中取下伪雄鱼性腺组织，剥离伪雄鱼性腺组织最外层膜，在5％FBS-DMEM/F12完全培养液中将组织剪成1mm³的小块，PBS冲洗5遍，用1ml不含血清的DMEM/F12培养基悬浮组织块，均匀接种到25cm²细胞培养瓶中，倒置于生化培养箱中培养。

配制100ml专用培养液，取DMEM/F12液体培养基80ml，加入胎牛血清20ml，10000IU青霉素、10mg链霉素、1mg盐酸四环素、0.5μg的人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、2μg的类胰岛素样细胞生长因子Ⅰ(IGF-1)、1000IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)和8000IU孕马血清促性腺激素(PMSG)。

6小时后,添加2ml专用培养液，并将细胞培养瓶以1分钟/每瓶的速度正置过来，平放在培养箱中继续培养。

待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1ml浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化0.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养瓶中加入2毫升的上述专用培养液，用移液器吹打培养瓶底2分钟制成伪雄鱼性腺细胞悬液；从培养瓶中取出1毫升伪雄鱼性腺细胞悬液，加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2毫升，使之最终体积至3毫升；待伪雄鱼性腺细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养。

实施例2

健康半滑舌鳎在70％乙醇中消毒1分钟，无菌超净台中取下伪雄鱼性腺组织，剥离伪雄鱼性腺组织最外层膜，在5％FBS-DMEM/F12完全培养液中将组织剪成1mm³的小块，PBS冲洗6遍，用1ml不含血清的DMEM/F12培养基悬浮组织块，均匀接种到25cm²细胞培养瓶中，倒置于生化培养箱中培养。

配制100ml专用培养液，取DMEM/F12液体培养基80ml，加入胎牛血清20ml，10000IU青霉素、10mg链霉素、3mg盐酸四环素、0.8μg的人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、3μg的类胰岛素样细胞生长因子Ⅰ(IGF-1)、1500IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)和9000IU孕马血清促性腺激素(PMSG)。

7小时后,添加2ml专用培养液，并将细胞培养瓶以2分钟/每瓶的速度正置过来，平放在培养箱中继续培养。

待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1ml浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化1分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养瓶中加入2毫升的上述专用培养液，用移液器吹打培养瓶底3分钟制成伪雄鱼性腺细胞悬液；从培养瓶中取出1毫升伪雄鱼性腺细胞悬液，加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2毫升，使之最终体积至3毫升；待伪雄鱼性腺细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养。

实施例2建立的半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系传至76代，生长分裂依然很旺盛(如图1、2所示)；染色体虽然出现了非整倍体和异倍体，但具有正常的二倍体核型的细胞占50％，并且具有一条典型的雌性特有的W染色体(如图3所示)；细胞每2～3天传代一次，冻存复苏后形态活性基本不变(如图4所示)；细胞系原代培养启动所用的性腺组织在生理性别上为雄性，遗传性别上为雌性(如图5，6所示)；细胞系转染pEGFP-N3质粒的效率可达30％，转染小RNA的效率可达90％以上(如图7,8所示)；可正常表达伪雄鱼性腺组织的sox9a等功能基因(如图9所示)。

实施例3

健康半滑舌鳎在70％乙醇中消毒1分钟，无菌超净台中取下伪雄鱼性腺组织，剥离伪雄鱼性腺组织最外层膜，在5％FBS-DMEM/F12完全培养液中将组织剪成1mm³的小块，PBS冲洗7遍，用1ml不含血清的DMEM/F12培养基悬浮组织块，均匀接种到25cm²细胞培养瓶中，倒置于生化培养箱中培养。

配制100ml专用培养液，取DMEM/F12l液体培养基80ml，加入胎牛血清20ml，10000IU青霉素、10mg链霉素、5mg盐酸四环素、1μg的人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、4μg的类胰岛素样细胞生长因子Ⅰ(IGF-1)、10000IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)和2000IU孕马血清促性腺激素(PMSG)。

8小时后,添加2ml专用培养液，并将细胞培养瓶以3分钟/每瓶的速度正置过来，平放在培养箱中继续培养。

待细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入1ml浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化1.5分钟；吸去胰蛋白酶溶液，每培养瓶中加入2毫升的上述专用培养液，用移液器吹打培养瓶底4分钟制成伪雄鱼性腺细胞悬液；从培养瓶中取出1毫升伪雄鱼性腺细胞悬液，加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加上述专用培养液2毫升，使之最终体积至3毫升；待伪雄鱼性腺细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养。

本研究细胞专用培养液中盐酸四环素能够有效保证半滑舌鳎伪雄鱼性的增殖能力，且能够补充青链霉素对微生物的抗性缺失部分。经过实验发现培养液中缺少其中任何一种生长因子时细胞生长速度均减慢，尤其是PMSG能极大的促进细胞增殖分裂。且DMEM/F12培养基营养成分丰富，比MEM、L15培养基更适合性腺细胞生长。

构建的半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系，对于外源质粒和siRNA的转染效率较高，可广泛用于外源基因、质粒的转染，应用于RNA干扰技术中，对于研究性别相关功能基因和性反转重要功能基因具有重要意义，此外也可用于鱼类常见病毒的繁殖及病毒与细胞相互作用机制的研究，还可进行环境污染物检测等，具有重要的实际应用价值。

Claims

1.一种半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织细胞系的构建方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

3)干贴结束后补加专用培养液，并将细胞培养瓶正置；

4)原代培养过程中每2天更换一半专用培养液，细胞长满单层后进行传代培养，传至60代完成伪雄鱼性腺组织细胞系的构建。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤1)中的培养液为5％FBS-DMEM/F12完全培养液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤1)的PBS溶液冲洗次数为5～7次。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2)中的专用培养液为含有20％胎牛血清FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、5～10ng/ml的人重组碱性成纤维细胞生长因子bFGF、20～40ng/ml的类胰岛素样细胞生长因子Ⅰ(IGF-1)、80～100IU/ml人绒毛膜促性腺激素HCG和10～20IU/ml孕马血清促性腺激素PMSG的DMEM/F12完全培养液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2)的组织块均匀接种后，将细胞培养瓶倒置放在培养箱中培养，使组织块干贴，倒置干贴时间为6～8小时。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3)干贴结束后先补加培养液2～2.5ml，再将培养瓶正置，正置过程需缓慢进行，持续时间1～3min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤4)的传代培养，其步骤如下：卵巢细胞长成单层后，吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入0.25％的胰蛋白酶溶液，静置消化后；吸去胰蛋白酶溶液，每个培养瓶中加入培养液，吹打培养瓶底钟制成卵巢细胞悬液；取出卵巢细胞悬液，加入到新的培养孔中，每个培养孔补加培养液进行培养。

8.一种半滑舌鳎伪雄鱼性腺组织细胞系，其特征在于，所述的细胞系是由权利要求1所述的方法构建的。