CN114381422A - 一种制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液的方法，属于细胞生物学领域，所述方法为取半滑舌鳎精巢组织，并用DMEM‑Nacl溶液冲洗组织，然后切碎匀浆；将酶混合溶液加入组织匀浆中，30℃水浴酶解消化5‑10min,显微镜下观察直至组织块基本消失；将消化后的细胞悬液用40μm细胞筛过滤；对滤过液进行第一次离心,收集细胞沉淀物，再加入PBS‑Nacl溶液重悬细胞，第二次离心，重复两次；将体积比0.1％BSA‑PBS‑Nacl溶液加入洗涤后的细胞沉淀中，重新悬浮细胞，即获得半滑舌鳎精巢单细胞悬液。本发明方法获得半滑舌鳎精巢单细胞悬液，并保证解离的细胞浓度为1000‑2000个/μL，活率大于80％。

Description

一种制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液的方法
技术领域
本发明属于海洋鱼类细胞生物学技术领域，涉及一种制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液的方法。
背景技术
半滑舌鳎是分布在我国渤海、黄海、东海、南海近海海域的一种大型底栖暖温性动物。半滑舌鳎个体大，生长快，适应性强，活动范围小，营养价值高，味道鲜美，是我国海水养殖的重要品种之一，具有较高的市场价值。目前，我国已实现半滑舌鳎的工厂化养殖和全人工繁殖。半滑舌鳎具有明显的性别二态性，不同性别个体之间大小差异明显，成年雌性个体的体重和体长约为同一时期成年雄性的2-4倍。因此，提高养殖群体中的雌性比例，能够极大的提高半滑舌鳎养殖的经济效益。在50-120日龄之间，部分遗传雌鱼会性逆转为伪雄鱼。伪雄鱼和雄鱼虽然体型大小相似，但在伪雄鱼生长速度，体重，大小等方面显著高于雄鱼。
然而，在养殖过程中，养殖户往往喜欢选择个体较大的雄鱼作为亲本。由于自然群体中的性逆转现象导致错误的选择伪雄鱼作为亲本，使后代雌性的比率下降，严重制约了半滑舌鳎养殖效益的提高。目前，通过人工诱导雌核发育来实现单性化养殖，从而提高群体生长速率，提高养殖质量，是半滑舌鳎育种研究中的关键方向之一。而解析半滑舌鳎伪雄鱼配子产生的机制有助于回答自然界长期存在的问题，即雌性到雄性的性逆转物种是如何繁殖的。
精巢是半滑舌鳎精子发生的场所，精巢中具有不同发育状态的生殖细胞和体细胞，在形态，大小和功能上存在较大差异，具有明显的细胞异质性。因为半滑舌鳎整个精子发生过程受到生殖腺体细胞的调控，因此成鱼中精子发生是研究干细胞更新和分化的理想系统，也是研究生殖细胞与体细胞相互作用的理想载体。然而，目前仍然缺乏较好的实验方法，获得细胞浓度适宜，活力较好的半滑舌鳎精巢单细胞悬液，制约着对半滑舌鳎精子发生过程的深入研究。因此，高效制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液不仅有助于优化海水鱼类成体组织细胞的体外培养技术，而且对在鱼类中开展单细胞转录组测序研究具有重要的参考意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种适用于制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液的方法，有助于快速、高效解离半滑舌鳎精巢单细胞，制备高质量的单细胞悬液，对于海洋鱼类精巢细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立具有重要的应用价值。
一种制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下：
步骤一，取半滑舌鳎精巢组织，并用DMEM-Nacl溶液冲洗组织，将组织切碎形成组织匀浆；
步骤二，将酶混合溶液加入组织匀浆中，30℃水浴酶解消化5-10min,显微镜下观察直至组织块基本消失；
步骤三，将消化后的细胞悬液用40μm细胞筛过滤；
步骤四，将步骤三过滤后的滤过液第一次离心,收集细胞沉淀物，再加入PBS-Nacl溶液重悬细胞，第二次离心，重复两次；
步骤五，将体积比0.1％BSA-PBS-Nacl溶液加入洗涤后的细胞沉淀中，重新悬浮细胞，即获得半滑舌鳎精巢单细胞悬液。
进一步，步骤一中的DMEM-Nacl溶液为DMEM溶液中含有0.03g/ml的Nacl。
进一步，步骤二中所述混合酶溶液为所述的DMEM-Nacl溶液中含有终浓度质量体积比为0.05％的胰蛋白酶和终浓度质量体积比0.1mg/ml的胶原酶Ⅳ；
进一步，步骤四中的PBS-Nacl混合溶液为PBS溶液中含有0.03g/ml的Nacl。
进一步，所述步骤四中的第一次离心条件为4℃下200-300×g离心3-5min；
进一步，所述步骤四的第二次离心条件为4℃下400-500×g离心3-5min；
进一步，步骤五中所述0.1％BSA-DMEM-Nacl溶液配制方法如下：所述的DMEM-Nacl溶液与体积比1％BSA溶液以体积比9:1混合得到。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液的方法，能够实现低成本、快速、高效获得半滑舌鳎精巢单细胞悬液，并保证解离的细胞浓度为1000-2000个/μL，活率大于80％，可应用于为其他海洋鱼类细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立，为半滑舌鳎雄鱼和伪雄鱼的精巢细胞基因表达研究及遗传育种研究提供重要参考资料。
附图说明
图1半滑舌鳎精巢单细胞悬液的台盼蓝染色结果(10倍物镜)；
图2半滑舌鳎精巢单细胞悬液的台盼蓝染色结果(20倍物镜)。
注：台盼蓝染色，呈现蓝色的为死细胞或细胞碎片，无色的代表活细胞。
具体实施方式
为更加清楚的解释本发明的技术方案，结合附图对本发明进行进一步的详细说明。此处描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定发明。
实施例1一种制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液的方法，具体步骤如下：
步骤一，解剖取出半滑舌鳎精巢，并将其放在无菌培养皿上，用镊子将粘附在精巢组织上的其他组织剥离后，用5ml DMEM-Nacl溶液冲洗精巢组织5遍，并用刀片在培养皿上将组织切碎，形成组织匀浆。所述的半滑舌鳎精巢组织冲洗液DMEM-Nacl溶液配制方法如下：向50ml DMEM中加入1.5g Nacl，震荡混匀，直到Nacl完全溶解，用孔径为0.22μm的过滤器过滤后使用。
步骤二，将组织匀浆转移到含有2-4ml酶混合液的5ml离心管中，上下颠倒混匀，防止组织块相互粘连，并将离心管放置在30℃水浴锅中酶解消化5min，每分钟取出离心管上下颠倒摇动5-10次，确保酶接触到所有组织匀浆。消化5min后,用移液器从离心管中吸取10μL的细胞悬浮液于载玻片上，在显微镜下观察。如果细胞未与组织分离，则需要延长消化时间，每间隔1分钟，取出10μL在显微镜下观察，直至组织块基本消失。所述的酶混合液配制方法如下：在DMEM-Nacl溶液中加入胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ，胰蛋白酶的终浓度为0.05％(0.05g胰酶溶于100ml溶液)，胶原酶Ⅳ终浓度为0.1mg/ml。
步骤三，将一个40μm的细胞筛放置在新的培养皿中，用移液器吸取1ml DMEM-Nacl溶液润洗细胞筛，然后用宽口无菌枪头将消化后的细胞悬液用细胞筛过滤，并将滤液转移至15ml离心管中，随后继续向细胞筛中加入7-8ml DMEM-Nacl溶液，并将滤液转移至上述15ml离心管中。步骤四，在4℃条件下，采用离心机的水平转子以300×g的速度离心(第一次离心)3min,离心后，离心管底部应可见细胞沉淀物，除去上清液后加入7-8mL PBS-Nacl溶液重新悬浮细胞，以500×g的速度离心3min,收集细胞沉淀，并重复洗涤1-2次。所述的PBS-Nacl洗涤溶液配制方法如下：向50ml PBS中加入1.5g Nacl，震荡混匀，直到Nacl完全溶解，用孔径为0.22μm的过滤器过滤后使用。
步骤五，去除最后一次离心后的上清液，用移液器吸取1-2mL 0.1％BSA-DMEM-Nacl混合溶液，轻轻吹打细胞，使细胞充分悬浮，并将细胞悬液转移至2ml低吸附的离心管中，放置在冰上。所述的0.1％BSA-DMEM-Nacl混合溶液配制方法如下：在9ml DMEM-Nacl溶液中，加入1ml 1％BSA溶液，得到0.1％BSA-DMEM-Nacl混合溶液。
步骤六，用移液器吸取9μL细胞悬液至50μL PCR管中，加入1μL的0.4％台盼蓝染料溶液，采用细胞计数板检测细胞浓度为1000-2000个/μl，活细胞比率大于80％，重复两次，计算共三次检测的平均值即为最终获得的细胞浓度，见附图1和附图2。
实施例2一种制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液的方法，具体步骤如下：
步骤一，解剖取出半滑舌鳎精巢，并将其放在无菌培养皿上，用镊子将粘附在精巢组织上的其他组织剥离后，用5ml DMEM-Nacl溶液冲洗精巢组织5遍，并用刀片在培养皿上将组织切碎，形成组织匀浆。所述的半滑舌鳎精巢组织冲洗液DMEM-Nacl溶液配制方法如下：向50ml DMEM中加入1.5g Nacl，震荡混匀，直到Nacl完全溶解，用孔径为0.22μm的过滤器过滤后使用。
步骤二，将组织匀浆转移到含有2-4ml酶混合液的5ml离心管中，上下颠倒混匀，防止组织块相互粘连，并将离心管放置在37℃水浴锅中酶解消化10min，每分钟取出离心管上下颠倒摇动5-10次，直至组织块基本消失，确保酶接触到所有组织匀浆。所述的酶混合液配制方法如下：在DMEM-Nacl溶液中加入胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ，胰蛋白酶的终浓度为0.05％，胶原酶Ⅳ终浓度为0.1mg/ml。
步骤三，将一个40μm的细胞筛放置在新的培养皿中，用移液器吸取1ml DMEM-Nacl溶液润洗细胞筛，然后用宽口无菌枪头将消化后的细胞悬液用细胞筛过滤，并将滤液转移至15ml离心管中，随后继续向细胞筛中加入7-8ml DMEM-Nacl溶液，并将滤液转移至上述15ml离心管中。
步骤四，在4℃条件下，采用离心机的水平转子以300×g的速度离心(第一次离心)3min,离心后，离心管底部应可见细胞沉淀物，除去上清液后加入7-8mL PBS-Nacl溶液重新悬浮细胞，以500×g的速度离心3min,收集细胞沉淀，并重复洗涤1-2次。所述的PBS-Nacl洗涤溶液配制方法如下：向50ml PBS中加入1.5g Nacl，震荡混匀，直到Nacl完全溶解，用孔径为0.22μm的过滤器过滤后使用。
步骤五，去除最后一次离心后的上清液，用移液器吸取1-2mL 0.1％BSA-DMEM-Nacl混合溶液，轻轻吹打细胞，使细胞充分悬浮，并将细胞悬液转移至2ml低吸附的离心管中，放置在冰上。所述的0.1％BSA-DMEM-Nacl混合溶液配制方法如下：在9ml DMEM-Nacl溶液中，加入1ml 1％BSA溶液，得到0.1％BSA-DMEM-Nacl混合溶液。
步骤六，用移液器吸取9μL细胞悬液至50μL PCR管中，加入1μL的0.4％台盼蓝染料溶液，采用细胞计数板检测细胞悬液，发现大量细胞碎片，细胞浓度低于500个/μL，且活性 较低。
实施例3一种制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液的方法，具体步骤如下：
步骤一，解剖取出半滑舌鳎精巢，并将其放在无菌培养皿上，用镊子将粘附在精巢组织上的其他组织剥离后，用5ml DMEM-Nacl溶液冲洗精巢组织5遍，并用刀片在培养皿上将组织切碎，形成组织匀浆。所述的半滑舌鳎精巢组织冲洗液DMEM-Nacl溶液配制方法如下：向50ml DMEM中加入1.5g Nacl，震荡混匀，直到Nacl完全溶解，用孔径为0.22μm的过滤器过滤后使用。
步骤二，将组织匀浆转移到含有2-4ml酶混合液的5ml离心管中，上下颠倒混匀，防止组织块相互粘连，并将离心管放置在30℃水浴锅中酶解消化5min，每分钟取出离心管上下颠倒摇动5-10次，确保酶接触到所有组织匀浆。消化5min后,用移液器从离心管中吸取10μL的细胞悬浮液于载玻片上，在显微镜下观察。如果细胞未与组织分离，则需要延长消化时间，每间隔1分钟，取出10μL在显微镜下观察，直至组织块基本消失。所述的酶混合液配制方法如下：在DMEM-Nacl溶液中加入胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ，胰蛋白酶的终浓度为0.25％，胶原 酶Ⅳ终浓度为1mg/ml。
步骤三，将一个40μm的细胞筛放置在新的培养皿中，用移液器吸取1ml DMEM-Nacl溶液润洗细胞筛，然后用宽口无菌枪头将消化后的细胞悬液用细胞筛过滤，并将滤液转移至15ml离心管中，随后继续向细胞筛中加入7-8ml DMEM-Nacl溶液，并将滤液转移至上述15ml离心管中。
步骤四，在4℃条件下，采用离心机的水平转子以300×g的速度离心(第一次离心)3min,离心后，离心管底部应可见细胞沉淀物，除去上清液后加入7-8mL PBS-Nacl溶液重新悬浮细胞，以500×g的速度离心3min,收集细胞沉淀，并重复洗涤1-2次。所述的PBS-Nacl洗涤溶液配制方法如下：向50ml PBS中加入1.5g Nacl，震荡混匀，直到Nacl完全溶解，用孔径为0.22μm的过滤器过滤后使用。
步骤五，去除最后一次离心后的上清液，用移液器吸取1-2mL 0.1％BSA-DMEM-Nacl混合溶液，轻轻吹打细胞，使细胞充分悬浮，并将细胞悬液转移至2ml低吸附的离心管中，放置在冰上。所述的0.1％BSA-DMEM-Nacl混合溶液配制方法如下：在9ml DMEM-Nacl溶液中，加入1ml 1％BSA溶液，得到0.1％BSA-DMEM-Nacl混合溶液。
步骤六，用移液器吸取9μL细胞悬液至50μL PCR管中，加入1μL的0.4％台盼蓝染料溶液，采用细胞计数板检测细胞悬液，发现细胞浓度大于1000个/μL，但存在较多细胞碎片， 且活性低于50％。

Claims (6)

1.一种制备半滑舌鳎精巢单细胞悬液的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下：
步骤一，取半滑舌鳎精巢组织，用DMEM-Nacl溶液冲洗组织，将组织切碎、匀浆；
步骤二，将酶混合溶液加入步骤一的组织匀浆中，30℃水浴酶解消化5-10min,显微镜下观察直至组织块基本消失；所述混合酶溶液为所述DMEM-Nacl溶液中含有终浓度质量体积比为0.05％的胰蛋白酶和终浓度质量体积比0.1mg/ml的胶原酶Ⅳ；
步骤三，将消化后的细胞悬液用40μm细胞筛过滤；
步骤四，将步骤三获得的滤过液第一次离心,收集细胞沉淀物，再加入PBS-Nacl溶液重悬细胞，第二次离心，重复两次；
步骤五，将体积比0.1％BSA-PBS-Nacl溶液加入洗涤后的细胞沉淀中，重新悬浮细胞，即获得半滑舌鳎精巢单细胞悬液。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述步骤一中的DMEM-Nacl溶液为DMEM溶液中含有0.03g/ml的Nacl。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤四中的PBS-Nacl混合溶液为PBS溶液中含有0.03g/ml的Nacl。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述步骤四中的第一次离心条件为4℃下200-300×g，离心3-5min。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述步骤四的第二次离心条件为4℃下400-500×g，离心3-5min。
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤五中所述0.1％BSA-DMEM-Nacl溶液配制方法如下：所述的DMEM-Nacl溶液与体积比1％BSA溶液以体积比9:1混合得到。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1644040A (zh) * 2005-01-13 2005-07-27 莱州明波水产有限公司 半滑舌鳎人工繁殖方法
JP2011200169A (ja) * 2010-03-25 2011-10-13 Tokyo Univ Of Marine Science & Technology 分離生殖細胞の移植による生殖細胞系列への分化誘導法における生着能の向上
CN102304491A (zh) * 2011-07-07 2012-01-04 中国水产科学研究院黄海水产研究所 半滑舌鳎精巢细胞系的构建与鉴定方法
CN104152402A (zh) * 2014-08-26 2014-11-19 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系的构建与应用方法
CN104830756A (zh) * 2015-05-07 2015-08-12 湖州师范学院 翘嘴红鲌精原干细胞分离培养方法
CN111534476A (zh) * 2020-06-03 2020-08-14 中国海洋大学 一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法
CN113403255A (zh) * 2021-06-03 2021-09-17 上海派森诺生物科技有限公司 一种鱼类组织单细胞悬液的制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1644040A (zh) * 2005-01-13 2005-07-27 莱州明波水产有限公司 半滑舌鳎人工繁殖方法
JP2011200169A (ja) * 2010-03-25 2011-10-13 Tokyo Univ Of Marine Science & Technology 分離生殖細胞の移植による生殖細胞系列への分化誘導法における生着能の向上
CN102304491A (zh) * 2011-07-07 2012-01-04 中国水产科学研究院黄海水产研究所 半滑舌鳎精巢细胞系的构建与鉴定方法
CN104152402A (zh) * 2014-08-26 2014-11-19 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系的构建与应用方法
CN104830756A (zh) * 2015-05-07 2015-08-12 湖州师范学院 翘嘴红鲌精原干细胞分离培养方法
CN111534476A (zh) * 2020-06-03 2020-08-14 中国海洋大学 一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法
CN113403255A (zh) * 2021-06-03 2021-09-17 上海派森诺生物科技有限公司 一种鱼类组织单细胞悬液的制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONG-YAN WANG等: "Single-cell-resolution transcriptome map revealed novel genes involved in testicular germ cell progression and somatic cells specification in Chinese tongue sole with sex reversal", 《SCI CHINA LIFE SCI》, pages 190 *
任玉芹 等: "红鳍东方鲀精原干细胞鉴定、分离及纯化", 《水生生物学报》 *
颉璇;厉萍;席萌丹;郭威;乔新美;杜浩;刘志刚;危起伟;: "达氏鲟精巢细胞消化分离和超低温冷冻保存", 淡水渔业, no. 05 *

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