CN106635956B - 一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，包括如下步骤：(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗，用剪刀剪碎至1mm2组织块，取适量组织块至分离液中，用吸管吹打、过滤，滤液离心，得黄色沉淀；(2)取黄色沉淀，加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基中，吹打均匀后接种至培养板，于CO2细胞培养箱中培养。本发明的方法可以稳定培养中华绒螯蟹肝胰腺细胞至72h存活率高于50％，为后续细胞系的建立提供理论依据，为细胞毒理、基因工程等相关领域研究提供细胞工具。

Description

一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体地说，是一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法。
背景技术
中华绒螯蟹(Eriocheir)属甲壳纲十足目，是我国水产养殖产业的主要养殖品种之一。随着养殖规模扩大，养殖年份增加，各类疾病，尤其是一些病毒病的爆发对中华绒螯蟹养殖产业造成了巨大影响。肝胰腺是蟹类重要的组织器官，肩负着许多生理功能，其中包括合成并分泌消化酶、吸收营养物质、存储无机物，代谢糖类物质，除此之外肝胰腺还参与排泄与蜕皮等生理活动。肝胰腺由多种细胞构成，根据细胞形态和功能可以分为四种，即胚细胞(E细胞)、分泌细胞(B细胞)、吸收细胞(F细胞)、储存细胞(R细胞)。其中R细胞主要形式储存功能，R细胞的胞质中具有圆形的小液泡，近圆形的细胞核靠近细胞基部，部分细胞具有大小不一的双核，两核或紧贴或分开。R细胞中具有大量的粗面内质网和噬碱性强的脂滴，胞质中游离核糖体的数量同样非常之多，除此之外还分布有少量的线粒体和一些小液泡。R细胞发达的脂肪体使其具有储藏功能，储存着河蟹生活必需的能量来源。
中国期刊《动物学杂志》2012年2月公开的论文《中华绒螯蟹血细胞原代培养条件的优化》，比较了几种常见血细胞培养基(L-15、2×L-15、3×L-15、M199和RMPI-1640)对中华绒螯蟹血细胞原代培养中细胞形态以及存活率的影响，在筛选获得的最佳培养基中添加不同比例胎牛血清，进一步观察血清对中华绒螯蟹血细胞培养效果的比较。河北大学2009年公开的硕士论文《中华绒螯蟹雄性生殖细胞体外培养的研究》，以中华绒鳌蟹雄性生殖细胞为研究对象，以细胞的贴壁率、存活率和RNA/DNA比值为生理和生化指标，分别测定了几种不同渗透压(600,700,800,900,1000,1100nunol/L)和pH值(6.5,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8)条件下体外培养雄性生殖细胞的生长状况，指出1000mmol/L为培养细胞的最适渗透压，在此渗透压条件下,培养细胞的贴壁率、存活率、RNA/DNA最大，培养细胞的适宜pH范围是7.2-7.4，在此pH条件下,细胞的贴壁率、存活率、RNA/DNA均较大。然而现有技术中，关于本发明的中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，包括如下步骤：
(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗，用剪刀剪碎至1mm2组织块，取适量组织块至分离液中，用吸管吹打、过滤，滤液离心，得黄色沉淀；
(2)取黄色沉淀，加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养基中，吹打均匀后接种至培养板，于CO2细胞培养箱中培养。
进一步，所述培养基为GIBCO公司的L-15培养基。
进一步，所述L-15培养基制备方法如下：取1L规格L-15干粉溶解于500ml蒸馏水中，在无菌环境下0.22μm滤膜过滤除菌。
进一步，所述细胞分离液为D-Hanks液。
进一步，所述中华绒螯蟹肝胰腺细胞至72h存活率高于50％。
进一步，所述具体方法如下：
(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗4-5次，用剪刀剪碎至1mm2组织块，再用吸管吸取适量的组织块至装有5ml分离液的离心管中，用吸管吹打50次，200目细胞筛过滤至培养皿中，滤液移至干净离心管中1200r/min离心4min，得黄色沉淀，所述细胞分离液为D-Hanks液；
(2)取黄色沉淀，加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的2×L-15培养基中，吹打均匀后接种至96孔板中,将培养板放置于CO2细胞培养箱中，培养箱保持恒温28℃,5％CO2。
本发明优点在于：
本发明通过比较6种甲壳动物细胞培养中常见培养基或缓冲液(2×L-15，3×L-15，M199，DMEM，Crab saline，D-Hanks)作为细胞分离液对中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离的效果，以及4种培养基(2×L-15，3×L-15，M199，DMEM)对中华绒螯蟹肝胰腺细胞贴壁率和存活率的影响，建立了一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，可以稳定培养中华绒螯蟹肝胰腺细胞至72h存活率高于50％，为后续细胞系的建立提供理论依据，为细胞毒理、基因工程等相关领域研究提供细胞工具。本发明的方法结合细胞培养技术、活体细胞染色技术、细胞形态学观察技术，对中华绒螯蟹肝胰腺细胞最佳的分离及原代培养条件进行探索。
附图说明
附图1为四种肝胰腺细胞形态。其中箭头所指分别是B细胞，R细胞，F细胞，E细胞。标尺＝20μm。
附图2为6种不同试剂条件下分离中华绒螯蟹肝胰腺细胞存活率。
附图3为接种2h后4中培养基下中华绒螯蟹肝胰腺细胞贴壁率。
附图4为培养24h不同培养基条件下肝胰腺细胞。a.2×L-15，b.2×L-15，c.DMEM，d.M199；黑色箭头表示肝胰腺细胞，白色箭头表示破裂的细胞。
附图5为4种不同培养基条件下肝胰腺细胞培养的存活率情况。不同字母标记表示组间差异性显著(P<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1材料与方法
1.1试验材料
中华绒螯蟹采自江苏省金坛市水产技术推广站，规格125g～135g/只，雌雄不限，暂养于75cm×50cm×45cm养殖箱内，光照周期12h：12h,每天换水1/3,早晚固定时间投喂配合饲料，每天吸出缸内残饵和粪便保证水质清晰。
Crab saline(蟹生理盐水)：NaCl(14.5g)，KCl(0.355g)，无水CaCl2(0.899g)，MgSO4·7H2O(1.58g)，NaHCO3(0.25g)，MgCl2·6H2O(0.85g)，HEPES(2.38g)，蒸馏水(500ml)。
2×L-15和3×L-15培养基：1L规格L-15干粉(Gibico)分别溶解于500ml，333ml蒸馏水中，在无菌环境下0.22μm滤膜过滤除菌然后分装于无菌蓝盖瓶内。
M199及DMEM培养基选用Gibico商用液体培养基。
1.2试验方法
将6种试剂(2×L-15，3×L-15，M199，DMEM，Crab saline，D-Hanks)作为细胞分离液，取足量的肝胰腺组织分别用以上分离液清洗4-5次，用剪刀剪碎至1mm2组织块，再用吸管吸取适量的组织至装有5ml分离液的6支离心管中，分别用吸管吹打50次，200目细胞筛过滤至培养皿中，滤液移至干净离心管中1200r/min离心4min。离心后，黄色沉淀部分取出分别分装于预先加入1ml分离液的离心管中，均匀重悬浮。细胞悬液台盼蓝染色，血球计数板计数计算其存活率。
根据分离液筛选结果，选取最佳分离液分离中华绒螯蟹肝胰腺细胞，分离过程同上述步骤。离心后得到黄色沉淀，分别取等量加入含双抗(100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素，购自Gibico公司)的2×L-15，3×L-15，DMEM以及M199四种培养基中，调整细胞密度一致，缓慢吹打均匀后接种至96孔板中。将培养板放置于CO2细胞培养箱(购自艾本德公司)中，培养箱保持恒温28℃,5％CO2。培养2h后，将培养板取出，轻微摇晃后在显微镜下观察拍照，发现细胞有不同程度贴壁脱落情况。在倒置显微镜下每孔随机选取5个视野计数脱落的细胞，并计算贴壁率。
接种后以后每2天换液一次，在24h、48h、72h、96h分别用台盼蓝排斥法测定肝胰腺细胞存活率。在Motic AE31倒置显微镜下从0h起至96h每隔24h观察细胞形态变化。
1.3统计分析
数据采用SPSS20.0单因素方差分析，组间差异采用Turkey’s比较。
2结果
2.1中华绒螯蟹肝胰腺细胞的形态观察
中华绒螯蟹的肝胰腺细胞由四种细胞组成，如图1所示：B细胞(泡状细胞)，R细胞(储存细胞)，E细胞(胚胎细胞)和F细胞(纤维细胞)。B细胞体积最大，细胞内充满大量的液泡，且液泡占据细胞80％-90％的空间，可见少量的脂滴。R细胞体积次之，内有小液泡，但数量最多，细胞内充满大量的脂滴。F细胞同R细胞大小相近，其胞内液泡较少，呈多边形，含少量脂滴。E细胞体积最小，几乎不含脂滴。
2.2不同分离液对中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离效果比较
分别用6种不同分离液进行细胞分离，结果表明：分离后各组细胞之间存活率差异不显著(P＞0.05)(图2)，均高于80％。其中，D-Hanks组所获得细胞数量更多，细胞成团情况更少，因此后续试验采用D-Hanks作为细胞分离液。
2.3不同培养基条件下肝胰腺细胞贴壁情况
肝胰腺细胞在2×L-l5培养基条件下2h贴壁率最高，达到97.69±3.72％，显著高于3×L-15组，但与DMEM和M199组差异不显著(图3)。
2.4不同培养基对肝胰腺细胞培养效果的比较
不同培养基培养条件下，分别在24h、48h、72h和96h对培养细胞按台盼蓝：培养液＝1:9进行染色，静置3min，计算细胞存活率。
培养24h后2×L-15组及3×L-15组细胞形态完整，仅见少数细胞出现破裂，有少量细胞碎片(图4a,b)；而DMEM，M199组肝胰腺细胞出现贴壁脱落，视野内细胞数量减少，且部分细胞出现破裂，大量颗粒物质从细胞溢出(图4c,d)。接种24h、48h、72h及96h后，2×L-15组存活率均高于其余三组，差异显著(p＜0.05)；而DMEM和M199组肝胰腺细胞存活率显著低于2×L-15和3×L-15组，24h存活率分别只有34.81±2.52％和26.70±3.44％，低于50％。随着培养时间的增加，各组存活率均有下降，96h时2×L-15组存活率为34.14％。(图5)
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种中华绒螯蟹肝胰腺细胞分离及原代培养方法，其特征在于，具体方法如下：
(1)取中华绒螯蟹胰腺组织用细胞分离液清洗4-5次，用剪刀剪碎至1mm2组织块，再用吸管吸取适量的组织块至装有5ml分离液的离心管中，用吸管吹打50次，200目细胞筛过滤至培养皿中，滤液移至干净离心管中1200r/min离心4min，得黄色沉淀，所述细胞分离液为D-Hanks液；
(2)取黄色沉淀，加入含100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素的2×L-15培养基中，吹打均匀后接种至96孔板中，将培养板放置于CO2细胞培养箱中，培养箱保持恒温28℃，5％CO2；
所述培养基为GIBCO公司的L-15培养基；所述2×L-15培养基制备方法如下：取1L规格L-15干粉溶解于500ml蒸馏水中，在无菌环境下0.22μm滤膜过滤除菌。
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Development of primary cell cultures from mud crab, Scylla serrata, and their potential as an in vitro model for the replication of white spot syndrome virus;A Deepika，M Makesh，K.V. Rajendran;《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal》;20131220;第50卷(第5期);第413页右栏第3-6行 *
Hepatopancreas cell cultures from mud crab, Scylla paramamosain;Hui Zeng等;《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal》;20091114;第46卷(第5期);第432页左栏倒数第3段、右栏倒数第2段 *
亚油酸对培养日本沼虾肝胰腺细胞的影响;王宏伟等;《河北大学学报（自然科学版）》;20050131;第25卷(第1期);第79页倒数第2行-第80页第4行 *
体外培养中硒对黄曲霉毒素B1损伤凡纳滨对虾肝胰腺细胞的影响;李赵嘉等;《动物营养学报》;20160330;第28卷(第1期);全文 *

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