CN114736847A - 一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法 - Google Patents

一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法，包括如下步骤：(1)麻醉后处死大鲵，大鲵体表消毒，取出性腺组织放置于双抗PBS溶液中备用；(2)用PBS溶液冲洗性腺至缓冲液清澈无明显浑浊，用完全培养基冲洗性腺；(3)将性腺剪碎，吸取剪碎的组织块于细胞筛上，研磨性腺组织块使其通过细胞筛成为单细胞。通过细胞网筛的方式直接获取性腺细胞单细胞，避免了由于传代培养导致细胞发生形态异质，从而引起实验数据产生偏差，建立了一种原代大鲵性腺单细胞获取方式以及处理方法，解决了目前缺少相应大鲵细胞系无法进行细胞水平实验的问题，也为后续大鲵性别控制和后续活体水平实验奠定基础。

Description

一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法。
背景技术
中国大鲵(Andrias davidianus)别名“娃娃鱼”、“人鱼”、“孩儿鱼”、“狗鱼”、“脚鱼”等，隶属脊索动物门(Chordata)，脊椎动物亚门(Vertebrata)，两栖纲(Amphibia)，有尾目(Urodela)，隐鳃鲵科(Cryptobranchidae)，大鲵属(Andrias)，为我国特有大型两栖物种。中国野生大鲵分布广泛，主要分布于我国中部地区，包括长江流域、黄河流域及珠江中上游地区。中国大鲵肉质细腻、口感独特、食味鲜美，同时兼具食用与药用价值，是具有较高的经济效益的经济动物。据《本草纲目》记载，大鲵可增食欲、补气血、养身心，对癫痫、痢疾、贫血、霍乱等均有一定的治疗效果，在《本草经集注》、《本草拾遗》等药典中也有能“治痴疾、治牛、治斑疾”的描述。目前大鲵产业在保健以及医疗等方面都有涉及。
二十世纪八十年代，由于过度捕杀，栖息地碎片化以及环境污染等因素的影响，野生大鲵种群数量锐减，几近灭绝。自二十世纪九十年代开始，由于对于大鲵人工繁殖技术的突破以及国家对于大鲵保护工作的支持，大鲵人工养殖技术迅速发展，大鲵养殖产业迅速兴起并快速发展。近年来，随着大鲵人工繁殖技术的不断成熟与完善，大鲵养殖成为中国特种水产养殖业的重点。陕西、重庆、浙江、湖南、湖北、广东和广西等地区，大鲵养殖业发展尤为迅速。
要做好大鲵的人工繁育工作，亲本培育是所有环节中的重中之重，因此，如何区别大鲵亲本性别进行针对性培养显得尤为重要。
原代细胞(primary culture cell)是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养，是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质。原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体叫做细胞系(cell line)。细胞培养很好的补充了体内实验的不足，它让细胞功能和进程的研究更具可操作性。细胞系的一个缺点是它们往往与原始的组织有不一样的遗传和表型。相比之下，原代细胞保持了细胞在体内的许多重要标志和功能。最早开始进行两栖动物细胞系建立的是WOLF在1964年进行的牛蛙FT细胞系(WOLF et al.1964)。目前大鲵所具有的细胞系有大鲵胸腺细胞系、大鲵脾细胞系和大鲵肾细胞系(Yuan et al.2015)等。值得注意的是Yuan在实验相应组织的原代细胞在一个月后从组织中移出并且在形态上是异质的，后续还需要长达60次的传代才建立相应细胞系。因此对于未建立细胞系的相关组织如何进行细胞水平的处理对于后续进行大鲵性别调控的相关研究显得十分重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法。
本发明的技术方案为：一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法，包括如下步骤：
(1)麻醉后处死大鲵，大鲵体表消毒，取出性腺组织放置于双抗PBS溶液中备用；
(2)用双抗PBS溶液冲洗性腺至缓冲液清澈无明显浑浊，用完全培养基冲洗性腺；
(3)将性腺剪碎，吸取剪碎的组织块于细胞筛上，研磨性腺组织块使其通过细胞筛成为单细胞，使用完全培养基将单细胞冲洗下来即得原代性腺细胞。
进一步地，所述双抗PBS溶液为含10％双抗的PBS溶液。
进一步地，所述完全培养基为：含10％双抗、10％胎牛血清的DMEM高糖培养基。
进一步地，所述性腺剪碎至组织块大小为1mm3～2mm3。
进一步地，所述细胞筛的孔径为70μm。
进一步地，所述大鲵为一龄的中国大鲵。
一种大鲵原代性腺细胞转染的方法，将上述所述的方法获取得到大鲵原代性腺细胞分置于细胞培养板中，27℃，贴壁培养6-12小时，吸取上层培养基，离心弃上清，收集下层细胞，使用opti-MEM培养基重悬细胞，同时将细胞培养板中的完全培养基更换为opti-MEM培养基，然后进行转染实验。
在以往对大鲵进行细胞水平的实验中，需要建立相应组织细胞系，相应细胞系的建立消耗时间较长，且成本较高。使用上述方法将大鲵性腺组织通过细胞筛处理为单细胞进行后续实验，减少了以往实验中建立相应细胞系所需要的时间，实验时间的缩短减少了在实验操作过程中由于操作失误引起污染的风险，同时降低实验成本。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的方法相较于建立相应细胞系的方式更加快捷、实验成本更低廉、获取原代细胞时间短且实验时间的缩短，进一步减少了在实验操作过程中由于操作步骤不当引起的污染。
2、通过细胞网筛的方式直接获取性腺细胞单细胞，避免了由于传代培养导致细胞发生形态异质，从而引起实验数据产生偏差，建立了一种原代大鲵性腺单细胞获取方式以及处理方法，解决了目前缺少相应大鲵细胞系无法进行细胞水平实验的问题，也为后续大鲵性别控制和后续活体水平实验奠定基础。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
中国大鲵均采自浙江金华永强大鲵养殖基地。
双抗PBS：Phosphate Buffered(Biological Industries)，含10％Penicillin-Streptomycin Solution(cytiva)
完全培养基：DMEM高糖培养基(Solarbio)，含10％Penicillin-StreptomycinSolution(cytiva)；10％Fetal Bovine Serum(VivaCell)
opti-MEM培养基：Opti-MEM(1×)(gibco)
实施例1
1、性腺组织收集及处理
对一龄的中国大鲵利用0.6g/L MS-222浸浴麻醉5分钟，利用眼科剪断颈椎处理，大鲵体表用75％乙醇进行消毒，取出性腺组织放置于双抗PBS(含10％双抗)中备用。用双抗PBS(含10％双抗)冲洗性腺至缓冲液清澈无明显浑浊。用完全培养基(10％双抗，10％胎牛血清，DMEM高糖培养基)冲洗性腺三次。
2、性腺单细胞收集
用眼科剪将性腺剪碎至组织块大小为1mm3～2mm3左右。将70μm细胞筛置于50ml离心管上，用移液枪吸取剪碎的组织块于细胞筛上，用研磨棒研磨性腺组织块使其通过细胞筛成为单细胞，使用完全培养基将单细胞冲洗下来获得含原代单细胞的悬浊。将原代单细胞悬浊液分置于6孔细胞培养板中，27℃贴壁6～12小时。
实施例2转染实验
1、性腺原代细胞转染siRNA
在ctbp1f与ctbp1m基因的差异区域采用BLOCK-iTTMRNAi Designer软件设计ctbp1f基因的3个RNA干扰位点RNAi-18，RNAi-101，RNAi-212以及采用FAM标记的siRNA作为对照，以LV5(EF1a-GFP--Puro)质粒为骨架，以载体中EF1a为启动子，利用In-Fusion克隆技术，构建LV5-ctbp1f/ctbp1m过表达慢病毒载体，进行慢病毒颗粒的包装制备。吸取上层培养基800rpm/s离心5min，弃上清，收集下层细胞。使用opti-MEM培养基重悬收集管中细胞，同时将细胞培养板中的完全高糖培养基更换为opti-MEM培养基。用Lipofectamine 3000转染siRNA/LV5-ctbp1f/ctbp1m(具体用量参考说明书)，处理完成后在37℃培养6小时，再将opti-MEM培养基置换成全培养基培养24～48小时，OLYMPUS IX73荧光显微镜下观察荧光，统计转染效率。
2、siRNA转染性腺原代细胞RNA提取
用细胞刮板刮取细胞培养板中原代细胞，将刮取后的细胞连同培养基置于1.5ml离心管中1500rpm/s离心10min，弃上清，收集下层细胞移入1000ul Trizol，移液枪吹打重悬细胞后室温静置5min，加入氯仿200ul，振摇5min，4℃12000rpm/s离心10min。吸取上清液移入新的1.5ml离心管，加入氯仿200ul重复上述操作。吸取上清液转至新的1.5ml离心管，加入500ul异丙醇充分混匀，静置10min，4℃12000rpm/s离心10min。用移液枪吸走液体，留下RNA沉淀，加入500ul 75％乙醇(无RNAase水配置)冲洗沉淀两次。吸去乙醇，开盖数分钟使乙醇彻底挥发。加入RNAase-free Water 50～100ul溶解沉淀。用NanoPhotometer-N60检测RNA浓度和纯度。
3、原代细胞RNA反转录处理
遵照TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒使用说明进行反转录。
4、荧光定量PCR分析siRNA干扰效果
选EF-1α作内参基因，cDNA作模板，每组3个重复。遵照2×T5 Fast qPCR Mix的使用说明，配成10ul反应体系。反应在Quant Studio 5实时定量PCR系统上进行，2-△△CT法计算相对表达量；所得数据在统计软件SPSS 22.0上进行单因素方差分析。检测ctbp1f与ctbp1m基因干扰效果以及性别分化相关基因的表达变化。

Claims (7)

1.一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)麻醉后处死大鲵，大鲵体表消毒，取出性腺组织放置于双抗PBS溶液中备用；
(2)用双抗PBS溶液冲洗性腺至缓冲液清澈无明显浑浊，用完全培养基冲洗性腺；
(3)将性腺剪碎，吸取剪碎的组织块于细胞筛上，研磨性腺组织块使其通过细胞筛成为单细胞，使用完全培养基将单细胞冲洗下来即得原代性腺细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双抗PBS溶液为含10％双抗的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述完全培养基为：含10％双抗、10％胎牛血清的DMEM高糖培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述性腺剪碎至组织块大小为1mm3～2mm3。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞筛的孔径为70μm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大鲵为一龄的中国大鲵。
7.一种大鲵原代性腺细胞转染的方法，其特征在于，将权利要求1-6任一项所述的方法获取得到大鲵原代性腺细胞分置于细胞培养板中，27℃，贴壁培养6-12小时，吸取上层培养基，离心弃上清，收集下层细胞，使用opti-MEM培养基重悬细胞，同时将细胞培养板中的完全培养基更换为opti-MEM培养基，然后进行转染实验。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468636A (zh) * 2013-09-26 2013-12-25 上海大学 一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法
CN104152402A (zh) * 2014-08-26 2014-11-19 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系的构建与应用方法
CN106754647A (zh) * 2017-01-12 2017-05-31 洛阳师范学院 一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法
CN112852711A (zh) * 2021-02-08 2021-05-28 上海海洋大学 刀鲚性腺体细胞系的建立及其应用
CN113403255A (zh) * 2021-06-03 2021-09-17 上海派森诺生物科技有限公司 一种鱼类组织单细胞悬液的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468636A (zh) * 2013-09-26 2013-12-25 上海大学 一种鲤鱼原代巨噬细胞的提取和鉴定方法
CN104152402A (zh) * 2014-08-26 2014-11-19 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种半滑舌鳎伪雄鱼性腺细胞系的构建与应用方法
CN106754647A (zh) * 2017-01-12 2017-05-31 洛阳师范学院 一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法
CN112852711A (zh) * 2021-02-08 2021-05-28 上海海洋大学 刀鲚性腺体细胞系的建立及其应用
CN113403255A (zh) * 2021-06-03 2021-09-17 上海派森诺生物科技有限公司 一种鱼类组织单细胞悬液的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JERZY F. GALAS: "Primary Culture of Ovarian Cells for Research on Cell Interactions in the Hormonal Control of Steroidogenesis（Chapter 16）", 《HUMAN CELL CUTURE PROTOCOLS》, pages 238 - 239 *
JIANKANG ZHANG 等: "Potential antagonistic relationship of fgf9 and rspo1 genes in WNT4 pathway to regulate the sex differentiation in Chinese giant salamander (Andrias davidianus)", FRONTIERS IN MOLECULAR BIOSCIENCES, pages 1 - 12 *

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