CN108624553A - 一种高效转染青鳉肌肉细胞系 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鱼类细胞培养技术，具体涉及建立一种高效转染青鳉肌肉细胞系，该细胞系和其他常见的鱼类细胞系相比，其外源基因由脂质体转染时候效率大幅度提高。所述高效转染青鳉肌肉细胞系为青鳉肌肉细胞系OLM，保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC NO：C201812。所述青鳉肌肉细胞系OLM在脂质体介导的转染法下可以使该细胞系在48小时后瞬时表达绿色荧光效率≥40%，可方便用于更多的鱼类基因功能的研究。相较于草鱼肾细胞系、斑马鱼胚胎细胞系等目前通用的鱼类细胞系，青鳉肌肉细胞系在脂质体转染法下的转染效率要高出很多，而且可快速获得稳定的转基因细胞系。

Description

一种高效转染青鳉肌肉细胞系
技术领域
本发明涉及鱼类细胞培养技术，具体涉及建立一种高效转染青鳉肌肉细胞系，该细胞系和其他常见的鱼类细胞系相比，其外源基因由脂质体转染时候效率大幅度提高。
背景技术
青鳉，隶属于辐鳍鱼纲，颌针鱼目，异鱂科，青鳉亚科，青鳉属，是近年来一种应用广泛的模式生物。相较于其它鱼类，它具有个体小，繁殖快，胚胎透明度高，环境耐受力强，遗传背景清晰和基因组信息完整等诸多优点，因此是进行脊椎动物发育生物学、干细胞和生殖细胞研究的理想材料。
近些年来，多种青鳉干细胞系如成体生殖干细胞系，二倍体胚胎干细胞系等已成功建立并为基因功能的研究提供了一个良好的平台。但是，体外培养和维持干细胞功能特性的难度较普通体细胞系来说比较大，而已经建立的一系列青鳉细胞系多是干细胞系，在基础研究方面涉较少。目前所建立的青鳉体细胞系多被用于病毒学等研究；因此，在青鳉现已存在的细胞系中进行一些外源基因的表达实验还比较困难。
目前，脂质体转染、电穿孔和病毒感染转染是将外源DNA导入细胞内的三种常规方法。虽然脂质体法操作简单，但很多实验证明脂质体法在鱼类细胞系中的有效性远不及哺乳动物的细胞系；电转法虽然会在一定程度上提高转染效率，但针对不同细胞需要优化实验条件且细胞致死率较高；而病毒感染转染法操作又相对复杂。现今较为通用的鱼类细胞系如草鱼肾细胞系(CIK)和斑马鱼胚胎成纤维细胞系(ZF4等都存在相对的转染效率不高，很难获得稳定转染细胞系的问题，这极大地限制了鱼类功能基因组学、鱼类细胞生物学和分子免疫学等领域的发展。因此，建立一种能便捷和高效转染的鱼类细胞系对于研究鱼类基因功能提供了非常有效的工具。
发明内容
基于此，本发明提供一种高效转染青鳉肌肉细胞系，为鱼类基因功能的研究提供一个有效的工具。
本发明技术方案为：
一种高效转染青鳉肌肉细胞系，所述高效转染青鳉肌肉细胞系为青鳉肌肉细胞系OLM，保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC NO：C201812。
所述高效转染青鳉肌肉细胞系为青鳉肌肉细胞系OLM，保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC NO：C201812。保藏单位的地址位于中国武汉大学，保藏日期为2018年1月22日，该青鳉肌肉细胞系OLM被命名为青鳉肌肉细胞系OLM。
优选地，所述青鳉肌肉细胞系OLM在脂质体介导的转染法下可以使该细胞系在48小时后瞬时表达绿色荧光效率≥40％。
所述高效转染青鳉肌肉细胞系的建立方法，所述方法为：将青鳉肌肉组织洗净、消毒、剪碎后接种，使青鳉肌肉组织先正置贴壁，再侧置后加入原代培养基，待其迁出细胞并长至培养瓶底的80％后，用胰酶消化，每3-5天按1:2或者1:3传代，进行传代培养得到青鳉肌肉细胞系OLM。
优选地，所述原代培养基每100mL组成成分为：75.6mL DMEM+HEPES培养液、1mL100×青链霉素、1mL100×NEAA、1mL 100×丙酮酸钠、0.4mL的100μmol/Lβ巯基乙醇、1mL100×谷氨酸、20mL Hyclone胎牛血清、1μL的2μmol/L亚硒酸钠、10μL的10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；
所述胰酶质量百分数为0.25％。
进一步优选地，DMEM+HEPES培养液配制方法为
所述DMEM+HEPES培养液每1L配制方法为：13.5g DMEM、4.764g 20mmol/L Hepes，10mM NaOH调节pH到7.7-7.8。
优选地，所述正置贴壁时间为1-2h，所述侧置时间为0.3-0.8h。
进一步优选地，所述测定方法为：
1)将处于对数生长期的青鳉肌肉细胞系OLM、草鱼肾细胞、斑马鱼胚胎成纤维细胞、胖头鱥肌肉细胞、石斑鱼胚胎细胞分别用胰酶消化，计数，将细胞分别铺至孔中进行培养；2)24小时后将pCVpf质粒用转染试剂进行转染后换上全培养基进行培养；
3)48小时后，先将细胞用PBS轻轻洗净(磷酸缓冲盐溶液)，拍照；再将细胞用300μL0.25％胰酶消化，用700μL全培养基终止后吹打下来过流式细胞仪来采集和记录细胞的瞬时转染效率；
完成高效转染青鳉肌肉细胞系的细胞瞬时转染效率测定。
进一步优选地，所述方法包括以下步骤：
A：将处于对数生长期的青鳉肌肉细胞系OLM用胰酶消化，计数，将细胞铺至孔中进行培养；
B：24小时后将pPuroRFP质粒用转染试剂进行转染，4小时后换上全培养基进行培养；
C：经过一个月药筛之后通过流式细胞仪检测获得了稳定转染的转基因细胞系；
完成稳定转染的转基因细胞系的获得。
进一步优选地，所述全培养基每100mL组成成分为：85.6mL DMEM+HEPES培养液、1mL100×青链霉素、1mL100×NEAA、1mL 100×丙酮酸钠、0.4mL的100μmol/Lβ巯基乙醇、1mL100×谷氨酸、10mL Hyclone胎牛血清、1μL的2μmol/L亚硒酸钠、10μL的10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；
所述转染试剂为Lipofectamine 2000；
所述胰酶的质量百分数为0.25％。
进一步优选地，所述药筛为全培养基中加入1.5ug/ml嘌呤霉素进行药筛。
本发明技术效果如下：
1、本发明构建的青鳉肌肉细胞系，在脂质体介导的转染法下可以使该细胞系在48小时后瞬时表达绿色荧光效率达到40％，可方便用于更多的鱼类基因功能的研究。
2、相较于草鱼肾细胞系、斑马鱼胚胎细胞系等目前通用的鱼类细胞系，青鳉肌肉细胞系在脂质体转染法下的转染效率要高出很多，而且可1个月获得稳定的转基因细胞系。
3、本发明所使用的脂质体转染方法，在保证青鳉肌肉细胞系的转染效率维持在比较高的基础上，相较于其它常规转染方法如电穿孔法、病毒感染转染法，操作更加简单，安全。对于研究鱼类基因功能提供了非常有效的工具。
4、本发明青鳉肌肉细胞系，是体细胞，用的是流式细胞仪分析的转染效率，可以用来分析肌肉相关基因的功能分析，对很多病毒不敏感。
附图说明
图1青鳉肌肉细胞系的获得和鉴定；
图2青鳉肌肉细胞系的瞬时转染和稳定传染。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
一种高效转染青鳉肌肉细胞系，所述高效转染青鳉肌肉细胞系为青鳉肌肉细胞系OLM，保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC NO：C201812。
所述高效转染青鳉肌肉细胞系为青鳉肌肉细胞系OLM，保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC NO：C201812。保藏单位的地址位于中国武汉大学，保藏日期为2018年1月22日，该青鳉肌肉细胞系OLM被命名为青鳉肌肉细胞系OLM。
优选地，所述青鳉肌肉细胞系OLM在脂质体介导的转染法下可以使该细胞系在48小时后瞬时表达绿色荧光效率≥40％。
所述高效转染青鳉肌肉细胞系的建立方法，所述方法为：
1)青鳉肌肉细胞系的建立
将鱼放在冰上冷冻死亡，随即用镊子夹入15mL离心管中75％的酒精消毒大概1-2分钟。再将鱼放入超净台，在干净的平皿中开始解剖，用镊子去皮，再用剪刀剪下肌肉组织。将取好的组织浸泡在事先准备好的12孔板中的PBS中，涮洗之后转入到新的PBS中，共洗涤两次。将组织表面的杂质洗干净后将其转移到双抗生素溶液中，共浸泡两次，每次30分钟。随后将组织块转入到12孔板中的培养基中，浸泡并剪碎。再用吸管吸出后将组织转移到25cm2瓶中，吸出培养基，使组织在培养箱中贴壁一个半小时，再将瓶子侧置半小时，最后小心加培养基。15天后，待其迁出细胞并长至培养瓶底的80％后，此后细胞用0.25％胰酶消化，每3-5天按1:3传代，进行传代培养。细胞的分离和培养、鉴定过程详见图1。
2)脂质体介导的青鳉肌肉细胞、草鱼肾细胞、斑马鱼胚胎成纤维细胞、胖头鱥肌肉细胞、石斑鱼胚胎细胞的转染
提前1天将5种处于对数生长期的细胞分别用0.25％胰酶消化，取20μL细胞悬液用细胞计数仪计数，根据细胞密度取约8×105的细胞室温离心(1000g，5min)，弃上清，加入2mL新鲜培养基，按每孔2×105的细胞分别铺至24孔板各四孔，其中3孔为实验组，1孔为对照组。24小时后，将24孔板中的培养基换成无血清的opti-MEM，此外，分别将4.5μg pcvpf质粒和13.5μL Lipofectamine 2000溶于225μL opti-MEM，各自室温孵育5分钟，随后，再将两管混合室温孵育10min之后均匀地滴加50μL混合液到每个实验孔中，4小时后换上全培养基。同时，按每孔1×106的细胞分别铺至6孔板2孔，其中1孔为实验组，1孔为对照组；24小时后将pPuroRFP质粒用Lipofectamine 2000按照上述方法进行转染，4小时后换上全培养基。
3)转染效率的测定与比较
48小时后，吸走培养基，用PBS将细胞轻轻将细胞表面洗净，加入新的培养基，拍照。再将对照细胞和3组实验组细胞分别用300μL 0.25％胰酶消化，用700μL全培养基终止后将细胞吹打下来分别吸入2mL离心管，用流式细胞仪采集和记录每管荧光细胞，每管记录5000个细胞，最后取平均值。一个月后，共转染pPuroRFP质粒的青鳉肌肉细胞系同样通过流式细胞仪按照上述方法进行荧光细胞的检测。
5)实验结果
最终获得了五种细胞系在此次实验条件下的瞬时转染效率，其中青鳉肌肉细胞瞬时转染效率高达40％，远超过其它四种细胞(图2.a-e)。同时，也获得了稳定的青鳉肌肉转基因细胞系(图2.f-j)。
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高效转染青鳉肌肉细胞系，其特征在于，所述高效转染青鳉肌肉细胞系为青鳉肌肉细胞系OLM，保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC NO：C201812。
2.根据权利要求1所述一种高效转染青鳉肌肉细胞系，其特征在于，所述青鳉肌肉细胞系OLM在脂质体介导的转染法下可以使该细胞系在48小时后瞬时表达绿色荧光效率≥40%。
3.权利要求1或2所述高效转染青鳉肌肉细胞系的建立方法，其特征在于，所述方法为：将青鳉肌肉组织洗净、消毒、剪碎后接种，使青鳉肌肉组织先正置贴壁，再侧置后加入原代培养基，待其迁出细胞并长至培养瓶底的80%后，用胰酶消化，每3-5天按1:2或者1:3传代，进行传代培养得到青鳉肌肉细胞系OLM。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述原代培养基每100mL组成成分为：75.6mL DMEM+HEPES 培养液、1 mL100×青链霉素、1 mL100×NEAA、1 mL 100×丙酮酸钠、0.4mL的100 µmol/Lβ巯基乙醇、1 mL100×谷氨酸、20 mL Hyclone胎牛血清、1 µL的2 µmol/L亚硒酸钠、10 µL的10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；所述胰酶质量百分数为0.25%。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述DMEM+HEPES培养液每1L配制方法为：13.5 g DMEM、4.764 g 20 mmol/L HEPES，10 mM NaOH调节pH 到7.7-7.8。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述正置贴壁时间为1-2h，所述侧置时间为0.3-0.8h。
7.权利要求1或2所述高效转染青鳉肌肉细胞系的细胞瞬时转染效率的测定方法，其特征在于，所述测定方法为：
1）将处于对数生长期的青鳉肌肉细胞系OLM、草鱼肾细胞、斑马鱼胚胎成纤维细胞、胖头鱥肌肉细胞、石斑鱼胚胎细胞分别用胰酶消化，计数，将细胞分别铺至孔中进行培养；
2）24小时后将pCVpf质粒用转染试剂进行转染后换上全培养基进行培养；
3）48小时后，先将细胞用PBS轻轻洗净（磷酸缓冲盐溶液），拍照；再将细胞用300 µL0.25%胰酶消化，用700 µL 全培养基终止后吹打下来过流式细胞仪来采集和记录细胞的瞬时转染效率；
完成高效转染青鳉肌肉细胞系的细胞瞬时转染效率测定。
8.权利要求1或2所述高效转染青鳉肌肉细胞系用于获得稳定转染的转基因细胞系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A：将处于对数生长期的青鳉肌肉细胞系OLM用胰酶消化，计数，将细胞铺至孔中进行培养；
B：24小时后将pPuroRFP质粒用转染试剂进行转染，4小时后换上全培养基进行培养；
C：经过一个月嘌呤霉素的药筛之后通过流式细胞仪检测获得了稳定转染的转基因细胞系；
完成稳定转染的转基因细胞系的获得。
9.权利要求8所述高效转染青鳉肌肉细胞系用于获得稳定转染的转基因细胞系的方法，其特征在于：所述全培养基每100mL组成成分为： 85.6 mL DMEM+Hepes 培养液、1mL100×青链霉素、1 mL100×NEAA、1 mL 100×丙酮酸钠、0.4 mL的100 µmol/Lβ巯基乙醇、1 mL100×谷氨酸、10 mL Hyclone胎牛血清、1 µL的2 µmol/L亚硒酸钠、10 µL的10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子；所述转染试剂为Lipofectamine 2000；所述胰酶的质量百分数为0.25%。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述药筛为全培养基中加入嘌呤霉素至浓度为1.5 µg/ml进行药筛。
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