CN105238742A - 斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法以及用于该诱导方法的诱导型培养基、iPS培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法，包括以下步骤：首先，取斑马鱼组织或斑马鱼胚胎，经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞，然后用病毒感染斑马鱼成纤维细胞，再对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导，经人工挑克隆及传代培养得到斑马鱼诱导性多能干细胞。基于同一个技术方案，同时还公开了用于该诱导方法的诱导型培养基和iPS培养基。RT-PCR分析表明，经本发明的胚胎成纤维诱导的iPS细胞具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能。本发明攻克了慢病毒在鱼类细胞中感染效率低的技术难点，为斑马鱼体细胞重编程机制研究提供了新的工具细胞来源以及新的思路来选择细胞材料。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及鱼类遗传育种领域，具体涉及一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法以及用于该方法的诱导型培养基、iPS培养基。
背景技术
自1981年Evans等人和Martin从鼠胚的内细胞团(innercellmass，ICM)细胞分别建立了胚胎干(embryonicstem，ES)细胞系以来，许多研究者尝试着建立各种哺乳动物和非哺乳动物的ES细胞系。然而，从鼠ES细胞系到人(Homosapiens)ES细胞系，前后花费了17年的时间，直到1998年人ES细胞系才得以建立。鱼类是脊椎动物中种类最多的一大类群，研究者也对其ES细胞做了大量的研究工作，鱼类ES细胞系的建立始于20世纪90年代，主要集中在青鳉(Oryziaslatipes)和斑马鱼(Daniorerio)这两种小型模式物种上。另外，从一些海水鱼中也得到了类似ES细胞的培养物，如金头鲷(Sparusaurata)，真鲷(Pagrosomusmajor)，鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)，金目鲈(Latescalcarifer)。最初，各种培养小鼠(Musmusculus)ES细胞的方法在鱼类中都进行了尝试。但是，正如这些方法不适用于其他哺乳动物一样，在鱼类ES细胞培养上也没有得到令人满意的结果，迄今尚未得到能传递给后代的生殖系嵌合体。
最近，Takahashi和Yamanaka选择24种在小鼠早期胚胎、ES细胞或者肿瘤细胞中丰富表达的转录因子，通过筛选、组合，发现用Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4这4个因子(这4个因子也被称为Yamanaka因子)可以有效地将胎鼠成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast，MEF细胞)和小鼠尾尖成纤维细胞诱导形成形态和生长特点类似ES细胞的克隆，即诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPS细胞)，这成为干细胞的又一新来源。如同其他的干细胞一样，iPS细胞同样具有自我更新和在体内、体外分化成多种细胞类型的能力。鱼类iPS的研究在2013年已经开启，使用的材料为斑马鱼囊胚期细胞，但是囊胚期细胞本身就是一种多能性的细胞，不是作为诱导iPS的理想的材料，因而该研究报道的学术价值是有限的。
目前有一种技术是通过DOX(Doxycyclinehyclate，简称Doxycycline，中文名称：盐酸强力霉素，是一种常用抗生素四环素tetracycline的类似物，在生物学实验中常用于tet-on系统的诱导性表达的诱导剂)调控的tet-on慢病毒体系表达oct4，sox2，klf4和c-myc(简称OSKM，TetO-FUW-OSKM为四因子四串联，解决了四因子随机插入拷贝数不一的问题，减少了病毒的制备及制备病毒过程中潜在的危害)。这是一种非常普遍的iPS诱导体系，在小鼠、猪和人等不同物种上都有先例，如中国专利CN103923877A中提供了一种建立DOX调控的猪体细胞诱导重编程体系的方法，但是目前这种技术仅限于哺乳动物iPS细胞的诱导，利用该诱导体系诱导鱼类细胞尤其是分化程度更高(发育潜能更低)的鱼类细胞(如尾鳍)则还没有先例。要实现在鱼类细胞中诱导出iPS细胞还需要攻克慢病毒在哺乳动物细胞中感染效率高而在鱼类细胞中感染效率低的技术难点，这也是本领域技术研究人员正在面临和需要解决的技术难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法以及用于该诱导方法的培养基。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法，包括以下步骤：首先，取斑马鱼组织或斑马鱼胚胎，经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞，然后用病毒感染斑马鱼成纤维细胞，再对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导，经人工挑克隆及传代培养得到斑马鱼诱导性多能干细胞；所述诱导是指用含有盐酸强力霉素的诱导型培养基对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导；所述传代培养是指用iPS培养基对挑克隆后的诱导性多能干细胞进行传代培养。
上述的诱导方法，优选的，所述斑马鱼组织为斑马鱼成体尾鳍；所述斑马鱼胚胎为体节前期胚胎。
上述的诱导方法，优选的，所述经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞的具体操作包括：取斑马鱼的尾鳍或胚胎置于酒精溶液中漂洗，然后放入含双抗的磷酸盐缓冲液中反复漂洗，将漂洗后的尾鳍或胚胎剪碎成组织块贴于含有双抗的磷酸盐缓冲液培养皿中，然后置于饱和湿度培养箱中培养，当组织块边缘发干时添加培养基A继续培养，48～72h后换液，当组织块迁出的成纤维细胞达到80～90％时，经胰酶进行消化处理后过滤除去组织块，将得到的斑马鱼成纤维细胞计数传代并冻存备用；所述培养基A的成分为90％DMEM、10％胎牛血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇和1％的青霉素/链霉素。
优选的，所述斑马鱼成纤维细胞计数传代是取第2～20代的斑马鱼尾鳍成纤维细胞或第2～5代处于对数增长期的斑马鱼胚胎成纤维细胞。
优选的，所述用病毒感染斑马鱼成纤维细胞的具体操作包括：选择生长状况良好无支原体污染的293T细胞接种于含有培养基A的培养皿中，按9μgTetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA/TetO-FUW-GFP、6μgpSPAX2、3μgpMD2.G添加质粒，按照转染操作处理后放置于饱和湿度培养箱中转染，转染至少48h后进行病毒液的收集，病毒液经低温高速浓缩滤器过滤后添加入聚凝胺(解决了慢病毒在鱼类细胞中感染效率低的难题)，然后将含有聚凝胺的病毒液感染斑马鱼成纤维细胞；所述培养基A的成分为90％DMEM、10％胎牛血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇和1％的青霉素/链霉素。
优选的，所述对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导的具体操作包括：将感染后的斑马鱼成纤维细胞重铺于培养皿中计数传代，用添加盐酸强力霉素的诱导型培养基进行诱导，诱导15～20d后细胞出现典型的诱导性多能干细胞克隆，此时采用机械法或者胰酶消化挑取生长状况良好的克隆消化成单细胞，然后接于含有iPS培养基的feeder或明胶上，用胰酶传代扩增并冻存得到斑马鱼诱导性多能干细胞。
一种可用上述诱导方法的诱导型培养基，包括以下成分：90％DMEM、7.5％胎牛血清、2.5％鱼血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1％的青霉素/链霉素和10ng/mlbFGF；所述诱导型培养基中添加有盐酸强力霉素；诱导型培养基能够诱导鱼类成纤维细胞产生iPS细胞。
上述的诱导性培养基，优选的，所述盐酸强力霉素的浓度为2ug/mL。
本发明还提供一种可用于上述诱导方法的iPS培养基，包括以下成分：DMEM、7.5％胎牛血清、2.5％鱼血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸0.1mMβ-巯基乙醇、1％的青霉素/链霉素、10ng/mlbFGF、0.5μMPD0325901、0.5μMALK5inhibitorA-83-01、3μMGSK3βinhibitorCHIR99021和1000U/mlLIF；iPS培养基能够维持iPS的生长形态并且能促进iPS的生长增殖。
与现有技术相比，本发明有以下有益效果：
1.本发明首次采用DOX调控的诱导重编程体系从斑马鱼体细胞(尤其是是分化程度更高的斑马鱼尾鳍细胞)中诱导出iPS细胞，通过低温高速浓缩病毒液提高病毒滴度从而提高感染效率，攻克了慢病毒在哺乳动物细胞中感染效率高而在鱼类细胞中感染效率低的技术难点，这是一种新型快速的诱导重编程方法，便于研究斑马鱼体细胞体重编程体系。
2.本发明为斑马鱼体细胞重编程机制研究提供新的工具细胞来源以及新的思路来选择细胞材料。
3.本发明还公开了新的鱼类诱导性多能干细胞的诱导型培养基和iPS培养基，其中，诱导型培养基能够诱导鱼类成纤维细胞产生iPS细胞，而iPS培养基则能够维持iPS的生长形态并且能促进iPS的生长增殖。
4.本发明获得的iPS经免疫荧光细胞化学染色、RT-PCR鉴定表明，由斑马鱼胚胎成纤维细胞诱导所得到的斑马iPS表达多能干细胞标志基因Oct-4、Sox2、SSEA-1等，而由尾鳍成纤维诱导得到的iPS只表达Oct4；碱性磷酸酶活性两者都检测呈阳性；RT-PCR分析表明胚胎成纤维诱导的iPS细胞具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是由斑马鱼尾鳍成纤维(a和b)和胚胎成纤维(c和d)感染对照绿色荧光蛋白病毒的荧光图。
图2是诱导斑马鱼成纤维细胞为iPS的流程图。
图3是由斑马鱼尾鳍成纤维(a)和胚胎成纤维(c)感染TetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA/TetO-FUW-GFP病毒后诱导得到的斑马鱼尾鳍成纤维iPS(b)和胚胎成纤维iPS(d)图。
图4是斑马鱼尾鳍成纤维(a)和胚胎成纤维(c)感染TetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA/TetO-FUW-GFP病毒后的iPS分化为斑马鱼尾鳍成纤维拟胚体(Embryoidbodies，EBs)图(b)和具有内、中、外三胚层类似早期三胚层胚胎结构的斑马鱼胚胎成纤维拟胚体图(d)。
图5为由斑马鱼尾鳍成纤维和胚胎成纤维感染TetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA/TetO-FUW-GFP病毒后诱导得到的斑马鱼尾鳍成纤维iPS碱性磷酸酶活性图(左图)和斑马鱼胚胎成纤维iPS碱性磷酸酶活性图(右图)。
图6为由斑马鱼尾鳍成纤维和胚胎成纤维感染TetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA/TetO-FUW-GFP病毒后诱导得到的斑马鱼尾鳍成纤维iPS免疫荧光检测Oct-4和斑马鱼胚胎成纤维iPS免疫荧光检测Oct-4、SSEA-1、Nanog、Sox2的结果图。
图7为斑马鱼胚胎成纤维感染TetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA/TetO-FUW-GFP病毒后获得的iPS细胞能分化成具有内、中、外三胚层的类似早期三胚层胚胎的结构的拟胚体的RT-PCR鉴定分析结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，实施例中涉及的方法步骤和参数条件均是斑马鱼的胚胎细胞和尾鳍细胞最佳条件设置，是通过长时间多次实验验证得出的最佳条件，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法，包括以下步骤：
(1)分离斑马鱼尾鳍和胚胎成纤维细胞：取斑马鱼的尾鳍和体节前期胚胎置于75％酒精溶液中漂洗，漂洗时间控制在30s以下，然后放于含双抗的磷酸盐缓冲液中反复漂洗多次，去除斑马鱼胚胎的膜和卵黄，将漂洗后的尾鳍和胚胎剪碎成组织块平铺于培养皿1中，添加少量含有双抗的磷酸盐缓冲液后置于28℃、5％CO2饱和湿度培养箱中，当组织块边缘发干时添加培养基A继续培养，48h后换液，当组织块迁出的成纤维细胞达到80％时，经0.05％胰酶进行消化处理后过200目滤器去除组织块，得到斑马鱼的成纤维细胞计数传代，选取低于20代的斑马鱼尾鳍成纤维细胞和第2～5代处于对数增长期的胚胎成纤维细胞冻存备用；培养基A成分为：90％DMEM、10％胎牛血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1％的青霉素/链霉素；
(2)感染斑马鱼成纤维细胞：选择生长状况良好无支原体污染的293T细胞以2.5×107密度接种于含有培养基A的100mm培养皿2中，使其24h后细胞密度达到70％-80％，转染前0.5h将培养皿2中培养293T细胞的培养基A更换为新鲜预热的5mlOpti-MEMReduced-SerumMedium；准备6个1.5ml的经高压灭菌的EP管(离心管)分成A、B两组，每组各3个EP管，向A组的每个EP管中加入476μl预热的Opti-MEMReduced-SerumMedium(转染时用的无血清培养基，能够提高转染效率)和24μlLTX，向B组的每个EP管中加入464μl预热的Opti-MEMReduced-SerumMedium，再向B组3个EP管中分别加入9μg的TetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA/TetO-FUW-GFP(TetO-FUW-GFP是一个对照，带GFP绿色荧光标记，用来衡量目的质粒的转染效率以及目的病毒的感染效率)、6μgpSPAX2、3μgpMD2.G，然后往这3个EP管中分别都加入18μlPLUS混匀，将A组得到的3个EP管中的混合物分别与B组得到的3个EP管中的混合物两两混匀后得到3份混合物，静置5min后将这3份混合物依次滴入含有293T细胞的100mm培养皿2中，然后放置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中开始转染，转染12h后为293T细胞换液，在转染48h、72h后分别进行一次毒液的收集，毒液经0.45μm低温高速浓缩滤器过滤后添加8μg/ml聚凝胺(通过低温高速浓缩病毒液提高病毒滴度从而提高感染效率，解决了慢病毒在鱼类细胞中感染效率低的问题)，然后直接感染斑马鱼尾鳍成纤维细胞和胚胎成纤维细胞(如图1所示)，感染12h后换液，为了增加感染效率可以进行二次感染；培养基A成分为：90％DMEM、10％胎牛血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1％的青霉素/链霉素；
(3)诱导斑马鱼成纤维细胞为iPS：参见图2的诱导流程，将感染后的斑马鱼成纤维细胞以1.5×104的密度重铺于35mm培养皿中计数传代，用添加DOX(2ug/mL)的诱导型培养基进行诱导，得到的斑马鱼尾鳍成纤维iPS和胚胎成纤维iPS参见图3，每天换液一次，诱导15天左右，感染后的细胞会出现典型的iPS克隆，克隆边界清晰，外形鼓起，核质比大，此时采用机械法或者0.25％胰酶消化挑取生长状况良好的克隆，单克隆接于含有iPS培养基的feeder或0.2％明胶上(克隆在明胶条件下比在feeder上生长快速，但易分化，需要及时将分化的克隆刮除，否则更多的克隆将会分化)，每5d用0.25％胰酶传代扩增并冻存于液氮中，经常观察克隆，及时进行传代培养，即可得到斑马鱼的诱导性多能干细胞。iPS可分化为成纤维拟胚体，参见图4。
一种可用于上述斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法的诱导型培养基的成分为：90％DMEM、7.5％胎牛血清、2.5％鱼血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1％的青霉素/链霉素、10ng/mlbFGF。
一种可用于上述斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法的iPS培养基的成分为：DMEM、7.5％胎牛血清、2.5％鱼血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1％的青霉素/链霉素、10ng/mlbFGF、0.5μMPD0325901、0.5μMALK5inhibitorA-83-01、3μMGSK3βinhibitorCHIR99021、1000U/mlLIF的培养液。
斑马鱼iPS的鉴定：
斑马鱼尾鳍和胚胎成纤维细胞诱导后获得的iPS细胞进行碱性磷酸酶活性检测呈阳性，如图5；经免疫细胞荧光染色鉴定表明所得的斑马鱼胚胎iPS细胞表达Oct-4、SSEA-1、Nanog、Sox2；而斑马鱼尾鳍成纤维所得的斑马鱼胚胎iPS细胞只表达Oct-4，如图6；斑马鱼胚胎成纤维感染病毒后获得的iPS细胞能分化成具有内、中、外三胚层的类似早期三胚层胚胎的结构的拟胚体(拟胚体的形成是研究干细胞体外分化能力的指标)，且如图7所示，RT-PCR鉴定分析表明其具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能；这些鉴定结果都直接说明获得的斑马鱼iPS细胞是具有多能性的。
Claims (10)
1.一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：首先，取斑马鱼组织或斑马鱼胚胎，经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞，然后用病毒感染斑马鱼成纤维细胞，再对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导，经人工挑克隆及传代培养得到斑马鱼诱导性多能干细胞；所述诱导是指用含有盐酸强力霉素的诱导型培养基对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导；所述传代培养是指用iPS培养基对挑克隆后的诱导性多能干细胞进行传代培养。
2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述斑马鱼组织为斑马鱼成体尾鳍；所述斑马鱼胚胎为体节前期胚胎。
3.根据权利要求1或2所述的诱导方法，其特征在于，所述经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞的具体操作包括：取斑马鱼的尾鳍或胚胎置于酒精溶液中漂洗，然后放入含双抗的磷酸盐缓冲液中反复漂洗，将漂洗后的尾鳍或胚胎剪碎成组织块贴于含有双抗的磷酸盐缓冲液培养皿中，然后置于饱和湿度培养箱中培养，当组织块边缘发干时添加培养基A继续培养，48～72h后换液，当组织块迁出的成纤维细胞达到80～90％时，经胰酶进行消化处理后过滤除去组织块，将得到的斑马鱼成纤维细胞计数传代并冻存备用。
4.根据权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，所述培养基A的成分为90％DMEM、10％胎牛血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇和1％的青霉素/链霉素。
5.根据权利要求3所述的诱导方法，其特征在于，所述斑马鱼成纤维细胞计数传代是取第2～20代的斑马鱼尾鳍成纤维细胞或第2～5代处于对数增长期的斑马鱼胚胎成纤维细胞。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的诱导方法，其特征在于，所述用病毒感染斑马鱼成纤维细胞的具体操作包括：将293T细胞接种于含有培养基A的培养皿中，按9μgTetO-FUW-OSKM/FUW-M2rtTA/TetO-FUW-GFP、6μgpSPAX2、3μgpMD2.G添加质粒，按照转染操作处理后放置于饱和湿度培养箱中转染，转染至少48h后进行病毒液的收集，病毒液经低温高速浓缩滤器过滤后添加入聚凝胺，然后将含有聚凝胺的病毒液感染斑马鱼成纤维细胞；所述培养基A的成分为90％DMEM、10％胎牛血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇和1％的青霉素/链霉素。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的诱导方法，其特征在于，所述对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导的具体操作包括：将感染后的斑马鱼成纤维细胞重铺于培养皿中计数传代，用添加盐酸强力霉素的诱导型培养基进行诱导，诱导15～20d后细胞出现典型的诱导性多能干细胞克隆，此时采用机械法或者胰酶消化挑取生长状况良好的克隆消化成单细胞，然后接种于含有iPS培养基的feeder或明胶上，用胰酶传代扩增并冻存得到斑马鱼诱导性多能干细胞。
8.一种可用于如权利要求1-7中任一项所述诱导方法的诱导型培养基，其特征在于，包括以下成分：90％DMEM、7.5％胎牛血清、2.5％鱼血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1％的青霉素/链霉素和10ng/mlbFGF；所述诱导型培养基中添加有盐酸强力霉素。
9.根据权利要求8所述的诱导性培养基，所述盐酸强力霉素的浓度为2～4ug/mL。
10.一种可用于如权利要求1-7中任一项所述诱导方法的iPS培养基，其特征在于，包括以下成分：90％DMEM、7.5％胎牛血清、2.5％鱼血清、1mML-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸0.1mMβ-巯基乙醇、1％的青霉素/链霉素、10ng/mlbFGF、0.5μMPD0325901、0.5μMALK5inhibitorA-83-01、3μMGSK3βinhibitorCHIR99021和1000U/mlLIF。
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Inventor after: Xiao Yamei Inventor after: Zhao Xiaoyang Inventor after: Zhou Yonghua Inventor after: Peng Liangyue Inventor after: Jiang Minggui Inventor after: Liu Wenbin Inventor after: Liu Jinhui Inventor before: Xiao Yamei Inventor before: Zhou Yonghua Inventor before: Zhao Xiaoyang Inventor before: Jiang Minggui |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20160113 Assignee: Changsha Jinshi Technology Co.,Ltd. Assignor: HUNAN NORMAL University Contract record no.: X2023980053490 Denomination of invention: Induction method for zebrafish induced pluripotent stem cells and inducible culture medium and iPS culture medium for this induction method Granted publication date: 20191108 License type: Common License Record date: 20231222 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |