CN104073514B

CN104073514B - 一种制备多能性干细胞的方法

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Publication number: CN104073514B
Application number: CN201310102292.5A
Authority: CN
Inventors: 胡晓湘; 隋丹丹; 李宁
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2013-03-27
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2033-03-27
Also published as: CN104073514A

Abstract

本发明提供了一种利用可调控的蛋白稳定系统制备多能性干细胞的方法，该方法是将目的载体待调控因子前加上降解区域。当在外源OCT4前添加降解区域时，通过添加TMP，可稳定待调控因子蛋白，并获得诱导的多能性干细胞，不添加TMP，则不能获得多能性干细胞克隆；通过改变TMP的添加剂量和添加时间，可以控制外源因子的表达计量及表达阶段，从而得到不同的多能性细胞诱导效率。本发明的方法为诱导多能性细胞的获取提供了一个可调控的途径。

Description

一种制备多能性干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种制备多能性干细胞的方法，具体地说，涉及一种利用可调控的蛋白稳定系统制备多能性干细胞的方法。

背景技术

1981年Evans和Matin两位科学家同时成功地分离出小鼠ES细胞，即胚胎干细胞，由于其无限增殖及其潜在的分化能力，使其广泛用于基础研究和应用。特别是1998年Thomason等首次利用临床上自愿捐献的体外受精—胚胎移植(in-vitro fertilizationand embryo transfer,IVF-ET)胚胎建立了5个人胚胎干细胞系，掀起了细胞治疗的热潮。同时与基因打靶技术结合，使其在细胞发育机制研究、细胞代替治疗、新药制备与筛选、器官移植等领域具有巨大的应用前景。但是人的ES细胞涉及伦理问题，大大限制了未来应用。为了解决这个问题，2006年日本科学家Yamanaka，成功利用四个转录因子Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc将小鼠胎儿成纤维细胞诱导成为与ES细胞类似的多能性干细胞，并且命名为iPS细胞即诱导多能性干细胞。此技术的发展为未来细胞治疗开启了一片新天地。但是由于外源因子整合及c-Myc的致癌性，对安全性造成威胁。

为了解决安全性问题，研究者开发了Doxycycline(Dox)诱导iPS系统。但此系统具有以下缺点，第一，有低水平的漏表达；第二，需要持续表达额外元件tTA或rtTA。同时此系统在mRNA水平调控，不能准确反应内源蛋白的表达情况，因此很多方面亟待改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备多能性干细胞的方法，特别是涉及一种利用可调控的蛋白稳定系统制备多能性干细胞的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种新的诱导系统，该系统不利用原癌基因c-Myc，它是一种由TMP诱导的安全的三因子诱导iPS系统。TMP是一个蛋白诱导系统，原理是通过将蛋白降解信号融合到目的蛋白上，然后通过磺胺类药物TMP对蛋白稳定性进行调控。加入TMP，则目的蛋白表达，去除TMP，则外源蛋白降解。

本发明首先提供一种TMP调控系统表达载体，其是以piggyBac转座子载体为骨架载体，所述表达载体包括从ZGs载体（Seq ID No.6）上获得的PB5′端和PB3′端，采用单顺反子读码框架，以启动子EF1α启动转录，三个外源基因OCT4、KLF4和SOX2之间由2A序列连接，DD基因位于上述至少一个外源基因的5′端，转座酶载体PBase中含有CAG启动子；其中，所述DD基因为带有R12Y和Y100I突变的大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因，并根据人的密码子偏好性进行了优化。

优选地，前述TMP调控系统表达载体的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

优选地，前述TMP调控系统表达载体的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

优选地，前述TMP调控系统表达载体的核苷酸序列如Seq ID No.3所示。

本发明还提供一种制备多能性干细胞的方法：将上述TMP调控系统表达载体导入胚胎成纤维细胞中，所得阳性细胞克隆经磺胺类药物TMP处理后接种饲养层细胞，通过培养传代，获得多能性干细胞。

优选地，所述胚胎成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。

前述方法中，向细胞培养基中加入磺胺类药物TMP的浓度为1μM。

本发明公开了利用一种可调控的蛋白稳定系统制备多能性干细胞的方法，该方法是将目的载体待调控因子前加上降解区域。当在外源OCT4前添加降解区域时，通过添加TMP，可稳定待调控因子蛋白，并获得诱导的多能性干细胞，不添加TMP，则不能获得多能性干细胞克隆；通过改变TMP的添加剂量和添加时间，可以控制外源因子的表达计量及表达阶段，从而得到不同的多能性细胞诱导效率。本发明的方法为诱导多能性细胞的获取提供了一个可调控的途径。

本发明提供的可调控的蛋白稳定系统系统具有以下优点：

（一）快速敏感调控，即短时间内即可对目的蛋白进行调控，同时1μM的TMP就可以稳定目的蛋白。

（二）使用方便。由于不像Dox系统还需要额外的元件，TMP只需要一个蛋白降解元件，然后融合到目的蛋白上即可。

（三）可以对多个目的蛋白进行调控。可以将蛋白降解元件分别与目的蛋白融合然后进行多基因调控。

（四）蛋白水平调控。研究表明，基因mRNA水平变化不能完全反应蛋白水平变化，因此Dox系统调控不能反应目的蛋白变化情况，而TMP系统可以更准确地反应目的基因在蛋白水平的调控。

附图说明

图1为本发明实施例利用piggyBac载体诱导小鼠多能性干细胞的过程示意图。

图2为本发明实施例细胞计数示意图。

图3为本发明实施例构建的质粒（O^ddKS、OK^ddS、OKS^dd、dd-3和OKS的结构示意图。

图4为本发明实施例利用可调控的piggyBac载体诱导小鼠多能性干细胞的结果；其中，Ⅰ为滋养层细胞；Ⅱ为Oct4-GFP培养成纤维细胞，P0代；Ⅲ为电转O^ddKS质粒5天后细胞形态；Ⅳ为电转O^ddKS质粒14天后形成的原代GFP阳性克隆；Ⅴ为稳定传代的小鼠iPS细胞，P5代；Ⅵ为稳定传代的小鼠iPS细胞，P5代，GFP阳性。

图5为本发明实施例畸胎瘤的组织切片分析结果。

图6为本发明实施例不同浓度TMP处理诱导获得小鼠多能性细胞效率情况。

图7为本发明实施例免疫印迹法检测总的OCT4蛋白表达量。

图8为本发明实施例用Gelpro32软件对蛋白免疫印迹法结果进行量化处理。

图9为本发明实施例Oct4因子不同时间的表达对再程序化过程的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例中涉及的材料及来源：

Oct4-GFP小鼠胚胎成纤维细胞系（购自The Jackson Laboratory，JaxMicestrain name:B6;CBA-Tg(Pou5f1-EGFP)2Mnn/J;stock number004654)），小鼠ES细胞系（购自美国标准生物品收藏中心ATCC）。前者在再程序化过程中，可利用GFP表达阳性指示內源Oct4基因的启动。

DMEM：购于GIBCO公司，Catalog no.11960。

FBS（血清）：购于GIBCO公司，Catalog no.10099。

ES FBS（ES血清）：购于GIBCO公司，Catalog no.16141。

non-essential amino acid(NEAA，非必需氨基酸):购于GIBCO公司，Catalogno.11140。

Pen/Strep（青霉素/链霉素）：购于GIBCO公司，Catalog no.15140。

GlutaMAX（谷氨酰胺替代物）：购于GIBCO公司，Catalog no.35050。

Sodium Pyruvate(丙酮酸钠):购于GIBCO公司，Catalog no.11360。

2-mercaptoethanol(β-巯基乙醇):购于GIBCO公司，Catalog no.21986。

LIF（白血病抑制因子）：购于Millipore公司，Catalog no.ESG1107。

DMSO(二甲基亚砜):购于Sigma公司，Catalog no.D2650。

畸胎瘤实验所用裸鼠由北医三院（北京大学第三医院）实验动物中心提供，所有实验操作程序遵循国家和国际规章制度。

引物合成及序列测定由上海生工（上海生工生物工程有限公司）完成。

质粒纯化及回收试剂盒为Qiagen公司产品。

实施例利用piggyBac载体诱导小鼠多能性干细胞

1方法

1.1TMP调控系统表达载体的构建

本实施例中载体采用piggyBac转座子载体骨架构建，这个载体骨架包括了从ZGs载体（Seq ID No.6）上获得的PB5′末端和PB3′末端。其中四个实验载体O^ddKS、OK^ddS、OKS^dd、dd-3和一个对照载体OKS，采用单顺反子读码框架，以EF1α启动子启动转录，三个外源基因OCT4、KLF4、SOX2之间由2A序列连接。降解区域（dd）的基因，来自带有R12Y和Y100I突变的大肠杆菌二氢叶酸还原酶，本实施例对降解区域的基因进行了人的偏好密码子优化，并用融合PCR的方法将dd基因构建至相应载体待调控基因的5′端。转座酶载体PBase由CAG启动子启动。

1.2利用piggyBac载体诱导小鼠多能性干细胞

利用piggyBac载体诱导小鼠多能性干细胞的过程示意图见图1。

1.2.1胚胎成纤维细胞系电转

（1）解冻Oct4-GFP小鼠胚胎成纤维细胞细胞系，10⁷个冻存细胞解冻后，接种至8个10cm培养皿，隔日换液。

（2）于电转胚胎成纤维细胞前一日(Day-1)，接种饲养层细胞至培养皿（每10cm培养皿约接种1.2×10⁶个细胞），37℃培养箱中培养过夜。

（3）电转当天（Day0）培养约3～4天的Oct4-GFP小鼠胚胎成纤维细胞（细胞汇合度为80%），消化计数，离心，吸弃上清，准备电转。

（4）准备电转仪，实验采用Lonza公司的电转仪及试剂盒Amaxa^TMBasicNucleofector^TMKit for primary mammalian fibroblasts；程序设置：A024。

（5）目的质粒（O^ddKS、OK^ddS、OKS^dd、dd-3、OKS）和PB酶质粒（PBase）以3:1的比例混合加入至细胞沉淀中，每10⁶个细胞加入1.5μg目的质粒,0.5μgPBase，100μl电击液，电转。

目的质粒O^ddKS、OK^ddS、OKS^dd、dd-3、OKS的核苷酸序列分别如Seq ID No.1-5所示。

（6）电转后细胞，迅速加入预热的MEF培养基（TMP处理组分别按处理浓度提前将TMP加入培养基中），按照不同浓度接种至铺有饲养层细胞的培养皿中，37℃，7.5%CO₂恒温培养。

1.2.2小鼠诱导多能性干细胞的建立

电转第二日（Day1），将细胞培养基换成ES培养基+350μg/ml G418+TMP（TMP处理组按照处理浓度提前加入至培养基中），G418连续处理5天，每日换相同的新鲜培养基，显微镜下观察细胞形态变化，并拍照。

Day6，停止G418的筛选，将细胞培养基换成ES培养基+TMP（TMP处理组按照处理浓度提前加入至培养基中），每日换相同的新鲜培养基至诱导第14天，镜下观察细胞形态变化，并拍照。

1.2.3诱导小鼠多能性干细胞效率统计

诱导第14天，培养皿中形成稳定的呈GFP阳性的小鼠iPS克隆，当日计数，并计算诱导效率。具体方法为：将培养小鼠iPS细胞的培养皿下均匀地画上分割线，在荧光纤维镜下观察GFP阳性克隆的细胞数目。按区域依次计数，压线克隆记上不记下，若出现看似连在一起的几个克隆，记为一个（克隆充分分散，连在一起的几个克隆被认为是由同一个原始细胞分裂而来），细胞计数示意图见图2。

1.2.4小鼠多能性干细胞克隆点的挑取

（1）诱导小鼠iPSCs第14天（Day14），铺饲养层细胞至24孔板中待用。

（2）诱导小鼠iPSCs第15天（Day15），准备挑取克隆点，将倒置显微镜置于超净台中灭菌。

（3）将铺有饲养层细胞的24孔板换上ES培养基，放在培养箱中预热，待用。

（4）在96孔板中加入30μl0.05%的胰蛋白酶，放在培养箱中预热，待用。

（5）在显微镜下，观察选择边缘整齐，表面光滑，体积较大的ES样克隆，并用记号笔在要挑取的克隆点正下方培养盘底部做上标记。

（6）把克隆点所在的10cm培养盘中的培养基吸去，用DPBS洗一遍，然后再加入5mlDPBS。

（7）用200μl的移液枪插上枪头，将克隆点周边的细胞划开，然后吸取克隆点，置于96孔板的胰酶中，每挑取一个克隆点换一个枪头。

（8）每盘细胞操作时间不要过长，否则细胞会因为DPBS无钙镁而脱壁。挑取完毕，吸去DPBS，加入ES培养基，可放入培养箱继续培养。

（9）吸取100μl培养基，反复吹打消化好的克隆点，约30次，然后转至已经铺好饲养层的24孔板中培养。

（10）待iPS细胞快长满时传代。

1.3小鼠多能性干细胞的培养

1.3.1小鼠多能性干细胞的传代培养

（1）于传代前一日，每10cm培养板约接种1.2×10⁶个饲养层细胞，37℃培养箱中培养过夜。

（2）传代当天，将DPBS、0.05%胰蛋白酶和ES培养基分别置于37℃水浴锅中预热15min。

（3）吸弃原培养皿中的培养基，用DPBS洗一遍。

（4）加入2ml0.05%胰蛋白酶，37℃培养箱中消化约5min。

（5）取出培养皿，镜下观察，大部分细胞脱落，反复吹吸，使大部分细胞呈单细胞状态。

（6）加入4ml培养基终止消化，反复吹吸后，将细胞转移至15ml离心管中。

（7）1000rpm，室温离心5min。

（8）吸弃上清，用10ml ES培养基重悬细胞。

（9）吸弃铺好饲养层细胞培养皿中的胚胎成纤维培养基。

（10）将10ml细胞重悬液按1:3～5的比例，转移至铺好饲养层的细胞培养皿中。

小鼠iPS细胞系约3-5天传一代（此时细胞汇合度约为70%-80%，传代时间因细胞的分裂速度而有所不同）；每天更换新鲜的培养基；培养条件：37℃，7.5%CO₂恒温培养。

1.3.2小鼠多能性干细胞的冻存

（1）贴壁细胞长满后，用0.05%胰蛋白酶消化成单细胞，收集细胞于15ml离心管中，细胞计数。

（2）1000rpm离心5min，吸弃上清。

（3）根据细胞量，加入相应体积预冷的小鼠iPS细胞冻存液重悬细胞沉淀，使得终浓度达到10⁶个细胞/ml。

（4）转移至冻存管中，每个冻存管加1ml细胞悬液。

（5）冻存管放入程序降温盒中，直接放入-80℃冰箱中过夜，于第二日转移至液氮中保存（转移动作尽量迅速）。

1.3.3小鼠多能性干细胞的解冻

（1）将ES培养基置于37℃水浴锅中预热15min～30min。

（2）将10ml预热培养基预先加至15ml离心管中，待用。

（3）从液氮中迅速取出待解动细胞，37℃水浴锅中解冻（快速晃动冻存管，以加速解冻）。

（4）超净台中将解冻的细胞悬液加入至准备好的10ml预热培养基中，轻柔吹吸混匀。

（5）1000rpm，离心5min，吸弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞沉淀。

（6）接种至预先铺好饲养层细胞的培养板上培养。

1.4小鼠多能性干细胞的鉴定

1.4.1碱性磷酸酶染色（AP染色）

（1）小鼠多能性干细胞培养3天后，用4%多聚甲醛室温固定30min。

（2）吸弃固定液，用DPBS漂洗3遍。

（3）加入BM Purple1～2ml，浸没培养皿。

（4）室温避光孵育，约15min后镜下观察，待染色深浅合适时，吸弃BMPurple，终止染色，加入DPBS后镜下观察照相。

1.4.2免疫荧光检测

（1）12孔板饲养层细胞（feeder）上铺iPS细胞，生长到50-60%时待用；

（2）去除培养基，室温用PBS洗2遍；

（3）加入2ml4%多聚甲醛/甲醇，室温静置30min；

（4）室温PBS洗3遍，每次5min；

（5）加入2ml PBS-T溶液，4℃渗透10min；

（6）去除PBS-T溶液，室温PBS洗3遍，每次5min；

（7）加入2ml封闭液PBS-B，37℃封闭细胞30min；

（8）用封闭液PBS-B按照一定比例稀释一抗到合适浓度。各一抗稀释浓度如下：OCT4(1:100)；NANOG（1:400）；SSEA1(1:500)；

（9）将细胞与稀释好的一抗4℃共孵育过夜；

（10）移除一抗溶液，室温PBS洗3遍，每次5min；

（11）用封闭液PBS-B按照一定比例稀释二抗，二抗稀释浓度为1:200（然后所有步骤都在避光条件下操作）；

（12）避光，室温二抗孵育1h；

（13）室温PBS洗3遍，每次5min；

（14）用1：10000DAPI（PBS稀释）孵育30sec；

（15）去除DAPI液，加PBS；

（16）镜下观察。

1.4.3畸胎瘤检测

（1）10cm皿feeder上扩增iPS细胞系，细胞长至80%-90%。

（2）0.05%胰酶消化iPS细胞，培养基终止消化，计数，离心，去培养基，按密度10⁷个细胞/ml PBS重悬，冰上保存，运送至裸鼠鼠房准备注射。

（3）裸鼠腋下皮下注射10⁶～2×10⁶个细胞每个注射点，每只裸鼠注射两个点。裸鼠编号，对应细胞系编号、注射日期、注射量明确写在鼠笼说明卡上。

（4）饲养裸鼠3～4周，每周观察测定畸胎瘤大小，记录是否成瘤、瘤体出现时间、增长速度，待瘤体直径达到2cm后，收集瘤体。

（5）制成石蜡切片，HE染色。

（6）镜下拍照，分析各细胞系三胚层分化情况。

1.4.4免疫印迹法

1.4.4.1总蛋白的提取

（1）待6孔板细胞汇合度为90-100%时，弃掉上清，用PBS洗两次后，置于1ml IP裂解液中，于冰上反复吹吸，然后转移至一个1.5ml离心管中，静置5min。

（2）4℃，12000rpm，离心5min。将上清转移至新的离心管中。

（3）测定浓度，-70℃保存。

1.4.4.2BCA法测定蛋白浓度

（1）将蛋白标准液稀释至0.5mg/ml；配制适量BCA工作液，充分混匀。

（2）将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板的标准品孔中，加PBS补足20μl。

（3）加样到样品孔中，加PBS补足到20μl。

（4）各孔中加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。

（5）测定各孔在波长595nm下的吸收值，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

1.4.4.3SDS-PAGE

（1）组装电泳装置：①将玻璃板先用蒸馏水洗净晾干，准备2个干净的小烧杯；②玻璃板在灌胶支架上固定好。

（2）根据待分离的蛋白质量大小不同而配制不同浓度的分离胶(参见分子克隆)，灌入玻璃板夹层中，用水封至凝固。

（3）配制浓缩胶，加入到玻璃板夹层中，直至加满。将梳子插入夹层的浓缩胶液体中。

（4）在适量蛋白样品中加入5×蛋白上样缓冲液，连同蛋白Marker于100℃煮沸5-10min。

（5）将凝胶板固定到电泳装置的上，加入1×电泳缓冲液，小心拔出梳子。

（6）上样：用注射器(或移液器)将蛋白样品加入到样品孔中。

（7）连接电源，进行电泳。初始电压60V左右，当指示剂显示进入分离胶后改为100V，直到溴酚蓝跑至凝胶底部时，停止电泳。关闭电源，弃去电极缓冲液，将凝胶从玻璃板中取出。

1.4.4.4蛋白质转膜过程

（1）将剥离好的凝胶用适量的转移缓冲液平衡20min。

（2）根据凝胶大小裁剪PVDF膜一张，相同大小滤纸6张。PVDF膜根据使用说明书处理(在甲醇中浸湿10秒，用双蒸水清洗5min，再置于转移缓冲液中平衡10min)浸好，备用。将海绵和滤纸置于转移缓冲液中平衡10-20min，备用。

（3）组装转膜夹层：负极(黑板)-海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵-正极(白板)，用玻璃棒排去夹层间的气泡。夹紧转膜夹，完成组装。

（4）在转膜槽中加入转移缓冲液，按正确的极性方向将转移夹放入电泳仪中，将电泳仪放入4度室，连接电源。350mA电泳60-90min。

（5）关闭电源，撤卸转膜装置，取出PVDF膜，并在膜上剪一小角，标记定位。

1.4.4.5抗体杂交

（1）封闭：将膜放入合适大小的自封袋中，加封闭液10-15ml，封闭。室温在旋转摇床或摆动平台中摇动60min，或4℃过夜。

（2）孵一抗：倾去封闭液。按抗体说明书提供的浓度用封闭液稀释一抗，将膜封闭在一抗中，室温孵育60min。

（3）孵二抗：按抗体说明书封闭液稀释辣根过氧化物酶连接的抗Ig的二抗，室温孵育60min。用TBST洗膜三至六次，每次10-15min。

1.4.4.6发光底物显影

（1）准备：取一定量的显影液、定影液分别盛于两容器，并再另用一容器盛一定量水作停影用；配发光底物(根据膜大小按1:1取A、B液一定体积混匀)；将膜从缓冲液中取出，吸干表面的TBST，勿干透，将膜正面(有蛋白面)朝上放在自封袋上，避免气泡；根据膜的大小剪好胶片。

（2）将发光底物(AB混合液)滴加到膜上，均匀覆盖整张膜，室温温育1-2min(HRPO反应)，至可见荧光条带。

（3）用自封袋盖住膜(避免气泡)，再将胶片放在其上，盖上暗盒压片5s～5min。

（4）显影：将曝光过的胶片马上放入显影液中，显影时间根据观察而定。

（5）定影：将显影过有条带的胶片放入水中停影，随即放入定影液中定影至胶片透明。

（6）定影好的胶片从暗室中取出后，用自来水冲洗、晾干、标记，扫描，及分析。

2结果

2.1TMP调控系统表达载体的构建

所构建载体的结构示意图如图3所示。

2.2利用piggyBac载体诱导小鼠多能性干细胞

在实验中滋养层细胞的质量会对多能性干细胞的诱导产生影响，图4(Ⅰ)显示了密度合适，长势较好的滋养层细胞。另外，胚胎成纤维细胞的质量也与诱导情况密切相关，图4(Ⅱ)中Oct4-GFP MEF，P0代长至第3天，可观察到细胞体积较小，生长密集，说明细胞活力很好，可进行消化电转。电转质粒O^ddKS后的Oct4-GFP MEF，ES培养基+TMP调控诱导培养至第五天，MEF细胞开始发生形态转变，由成纤维样细胞转变成上皮细胞样，图4（Ⅲ）。诱导14天后，小鼠ES样克隆形成，此时克隆表面光滑，边缘整齐，镜下观察GFP呈阳性。由于实验所用细胞Oct4-GFP MEF中GFP是连接在Oct4启动子后面，当內源Oct4启动时，GFP会同时启动表达，因此GFP阳性一直被人们用来判定iPS细胞是否诱导成功。此类克隆适合下一步挑取，图4（Ⅳ）。挑取的克隆近90%可建立可持续传代的，形态较好，GFP阳性的小鼠iPS细胞系，图4（Ⅴ、Ⅵ）。实验结果表明，通过TMP调控诱导系统可有效地诱导小鼠胚胎成纤维细胞形成小鼠诱导多能性干细胞。

2.3小鼠诱导多能性干细胞的鉴定

2.3.1碱性磷酸酶染色

碱性磷酸酶染色鉴定结果显示，获得的小鼠iPS细胞系碱性磷酸酶强阳性，而且观察到的克隆碱性磷酸酶阳性率可达到100%。碱性磷酸酶阳性是细胞多能性的初步指征，因此实验结果初步证实了TMP调控诱导系统获得的小鼠iPS细胞系具有多能性特征。

2.3.2免疫荧光染色

免疫荧光结果显示，实验获得的小鼠iPS细胞系表达小鼠胚胎干细胞的核蛋白marker Oct4、Nanog及膜蛋白marker SSEA1。小鼠iPS细胞系的培养基中不加入TMP蛋白，外源OCT4不表达，所检测的Oct4marker指示的是內源Oct4的阳性表达。免疫荧光染色进一步证明了所获得的小鼠iPS细胞系具有小鼠ES特征。

2.3.3体内分化实验---畸胎瘤检测

畸胎瘤形成是验证多能性细胞体内分化潜能的有力证据，可以根据畸胎瘤形成的时间、大小及分化程度，判断多能性细胞的分化潜能，是ES及iPS细胞验证中的。实验分别将10⁶个和2×10⁶个iPS细胞注射至5～6周龄的4只雌裸鼠腋下，约3～4周即长出肿瘤，直径约2cm～4cm。第四周，处死裸鼠，取出肿瘤，并做组织切片和HE染色。图5中显示的切片照片来自同一注射点形成的畸胎瘤，可看到分别来自于内胚层、中胚层和外胚层的组织特征，显示了小鼠iPS细胞系的分化能力（图5）。

2.3.4TMP调控诱导系统效率统计

Oct4-GFP MEF分别转染O^ddKS和OKS质粒，O^ddKS转染细胞分为两组，添加1μMTMP和不添加TMP组；OKS转染组不添加TMP。三组细胞同时诱导14天后，观察发现，O^ddKS+1μM TMP组及OKS转染组，都可得到表面光滑，边缘整齐，镜下观察GFP呈强阳性的iPS克隆，而O^ddKS不添加TMP组不能形成完整克隆，仅见到聚集的细胞群，呈现GFP阴性。

分别对不同处理组的细胞进行GFP阳性克隆计数。其中，O^ddKS+1μM TMP组，每电转7.2×10⁴个MEF，可获得296±5个GFP阳性克隆，OKS转染组，每电转7.2×10⁴个MEF，可获得290±36个GFP阳性克隆，两组的诱导效率分别约为0.41%和0.40%；而O^ddKS不添加TMP组，没有GFP阳性克隆形成。实验结果表明，TMP调控诱导系统在小鼠胚胎成纤维细胞系的再程序化诱导过程中，可获得与非调控系统相近的诱导效率，约为0.41%；该系统在再程序化过程中严格受控于TMP的调控，当无TMP加入时，完全不形成克隆。

2.3.5不同因子调控诱导系统获得小鼠iPS细胞效率的比较

分别电转质粒O^ddKS、OK^ddS、OKS^dd、dd-3、OKS至Oct4-GFP MEFs，1μM TMP持续诱导14天，分别对不同载体转染的细胞进行GFP阳性克隆计数。5个载体O^ddKS、OK^ddS、OKS^dd、dd-3及OKS，分别获得的GFP阳性克隆数及诱导效率如表1所示。其中，O^ddKS（0.41%）,OKS^dd（0.37%）实验组的诱导效率与OKS（0.40%）组相近，OK^ddS（0.56%）实验组诱导效率高于前三组约30%,dd-3（0.08%）实验组诱导效率远低于其他四组。以上结果表明，对于单个因子调控的载体在再程序化过程中可获得相似的诱导效率，可知，dd对于蛋白的调控不会受到2A肽连接的位置影响；但三因子同时调控的载体诱导效率较低，即使提高TMP加入的浓度也无缓解，可见不是受到竞争性抑制的影响，原因有待进一步考察。

表1 不同piggyBac转座子载体再程序化效率统计

载体名称	GFP阳性克隆	转染的细胞	再程序化效率（%）
				O^ddKS	296±5	7.2×10⁴	0.40-0.42（约0.41）
OK^ddS	402±21	7.2×10⁴	0.53-0.59（约0.56）
				OKS^dd	266±25	7.2×10⁴	0.33-0.40（约0.37）
dd-3	62±3	7.2×10⁴	0.08-0.09（约0.08）
				OKS	290±36	7.2×10⁴	0.35-0.45（约0.40）

2.3.6通过TMP调控系统对外源基因进行剂量调控及诱导时间调控

2.3.6.1多能性因子OCT4在再程序化过程中的的计量依赖性调控

将O^ddKS转染Oct4-GFP MEFs细胞，并以不同浓度的TMP处理（0nM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM），在诱导第14天，获得GFP阳性的小鼠iPS细胞，对GFP阳性细胞进行计数，并计算效率。

GFP阳性克隆计数得到，当浓度处理达到10nM时，可观察到GFP阳性的iPS细胞，但此时的诱导效率较低，仅达到约0.12%的诱导效率。随着TMP浓度的增加，iPSCs的诱导效率及OCT4蛋白量都随之增加。当TMP浓度处理达到100nM时，iPSCs的诱导效率(约0.38%，每电转1.2×10⁴个细胞可获得45±6个GFP阳性克隆)可近似达到与OKS非调控系统相同的效率0.40%。同时，该处理组细胞的内外源OCT4蛋白表达总量与小鼠ES细胞持平。当TMP浓度处理低于10nM时，几乎不能获得GFP阳性克隆（图6和图7）。

2.3.6.2多能性因子在再程序化过程过程中的时间依赖性调控

为了探究Oct4因子在再程序化过程中的表达时序上的要求，将O^ddKS调控质粒电转至Oct4-GFP细胞，并以1μM TMP处理。实验发现OCT4表达6天，即可获得GFP阳性克隆，OCT4再持续表达5天，此时克隆效率可达到约0.36%。TMP添加更长时间，iPS的获得效率没有进一步的明显增加。同时可观察到外源Oct4在诱导前期仅1～3天的添加，无法获得GFP阳性的iPS细胞；但诱导中期仅两天（day7-day8）的添加，即可获得一定数量的GFP阳性的iPS细胞，表明这些细胞处于一种代发状态。第20天观察，发现通过增加培养时间，或在诱导后期添加Oct4，仍然可以获得较高的诱导效率。证明了在整个再程序化过程中，任何阶段的Oct4表达都是有效的（图8）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种甲氧苄胺嘧啶TMP调控系统表达载体，其特征在于，包括piggyBac载体以及转座酶载体PBase；所述piggyBac载体是以piggyBac转座子载体为骨架载体，该载体包括从ZGs载体上获得的PB 5′端和PB 3′端，采用单顺反子读码框架，以启动子EF1α启动转录，三个外源基因OCT4、KLF4和SOX2之间由2A序列连接，DD基因位于上述外源基因OCT4、KLF4或SOX2的5′端；转座酶载体PBase中含有CAG启动子；

其中，所述DD基因为带有R12Y和Y100I突变的大肠杆菌二氢叶酸还原酶基因，并根据人的密码子偏好性进行了优化；

所述ZGs载体的核苷酸序列如Seq ID No:6所示；

所述piggyBac载体的核苷酸序列如Seq ID No:1、2或3所示。

2.一种制备多能性干细胞的方法，其特征在于，将权利要求1所述的表达载体导入胚胎成纤维细胞中，所得阳性细胞克隆经1μM甲氧苄胺嘧啶TMP处理后接种饲养层细胞，通过培养传代，获得多能性干细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述胚胎成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。