CN107312797B - 一种蛋白调控系统及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋白调控系统及其制备方法和应用，所述蛋白调控系统中的二氢叶酸还原酶与所要调控的目的蛋白之间采用刚性连接肽进行连接，所述刚性连接肽为(EAAAK)n或A(EAAAK)nA，其中n为1‑6中的任意整数，优选n为6。本发明的蛋白调控系统具有更高的目的蛋白表达量、更高的调控比例和更高的调控幅度，具有很广阔的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种蛋白调控系统及其制备方法和应用，具体涉及一种采用刚性连接肽连接后优化的蛋白调控系统及其应用。
背景技术
DDD(DHFR degradation domain)调控系统是一种利用泛素蛋白酶系统对目的蛋白进行调控的调控系统，它利用大肠杆菌的二氢叶酸还原酶(ecDHFR)与目标蛋白融合通过控制稳定剂添加与否对目的蛋白进行蛋白水平的调控。
ecDHFR可以被DHFR抑制剂甲氧苄氨嘧啶(TMP)所稳定。当没有添加稳定剂TMP时，ecDHFR及与其融合的蛋白会被泛素标记，然后被蛋白酶体识别并降解，从而实现目的蛋白的不表达。而当添加稳定剂TMP时，TMP会与ecDHFR结合并且稳定ecDHFR，从而使ecDHFR及与其融合的蛋白保持稳定的状态不被泛素化降解，目的蛋白可以正常表达。TMP与ecDHFR结合从而稳定蛋白不被降解这个状态是可逆的，添加TMP可以稳定ecDHFR，而撤走TMP会导致ecDHFR及其融合蛋白的降解，从而通过控制TMP的量来控制目的蛋白的表达水平。
TMP是一种常用并且廉价的人用药，可以直接在人体上使用。另外TMP对DHFR有很强的稳定效果，而TMP对ecDHFR的稳定作用比哺乳动物的DHFR更强，所以只需要很小量的TMP就可以稳定ecDHFR，所以使用DDD调控系统的调控成本比较低。除此以外，TMP还能够通过血脑屏障以及胎盘屏障，所以DDD可以用于调控不同时期，不同范围的蛋白表达，具有很广阔的应用空间。综上所述，DDD调控系统是一种使用方便，应用广泛的的蛋白调控系统。但是，目前DDD调控系统仍然存在缺陷：(1)调控目的蛋白表达时表达量低于去除调控序列时的蛋白表达量；(2)调控蛋白表达幅度低。
常见的构建融合蛋白的方法，一是将两个功能分子直接相连接，其中的功能分子通常包括蛋白质、蛋白质的球型结构域以及一些高表达蛋白序列。另一种方法则是通过连接肽序列将功能分子连接起来。一般而言，有如下因素会影响融合蛋白的生物学活性：1、融合蛋白之间的空间位置；2、融合蛋白各自的受体结构及相互关系；3、融合蛋白连接肽的长度，折叠，氨基酸组成，是否糖基化，连接肽与两段连接的蛋白分子之间的适配性，另外连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。
连接肽作为融合蛋白之间连接的纽带，一般都要求有柔韧性好、亲水性强等特点，因此甘氨酸作为分子量小、结构简单，同时亲水性强的氨基酸被运用到连接肽设计中。从1988年(GGGGS)n(n≤6)被发明开始，它作为一种优秀的连接肽被一直使用至今，被广泛运用到多种融合蛋白的构建中。因为富含甘氨酸，所以这种结构的连接肽相对柔软并且弯曲，因此这种连接肽被称为柔性连接肽。但是这种柔性连接肽也有缺点，因为柔软，所有连接肽两端连接的蛋白可以随意活动，容易形成发夹结构，从而使融合蛋白缠绕容易形成二聚体，同时可能会遮蔽蛋白的活性位点影响蛋白的活性。2001年，Arai等人设计了一种成α螺旋结构的连接肽(EAAAK)n(n≤6)，这种连接肽具有的刚性结构可以有效的分割融合的两个蛋白，使其相互影响达到最小，其二级结构成α螺旋，不易弯折，保证了功能蛋白间距的相对稳定。
不同连接肽的效果不一样，有的连接肽虽然可以提高DDD调控系统调控的目的蛋白的表达量，但是同时也会提高目的蛋白在不添加稳定剂时的本底水平，反而降低了DDD调控系统的灵敏度，所以需要选择合适的连接肽连接ecDHFR蛋白以及所要表达的目的蛋白。
发明内容
鉴于现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种蛋白调控系统及其制备方法和应用，通过优化DDD调控系统(二氢叶酸还原酶降解域调控系统)中ecDHFR(二氢叶酸还原酶)蛋白与目的蛋白的融合方式提高了添加TMP时目的蛋白的表达水平，和调控幅度。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种蛋白调控系统，所述蛋白调控系统中的ecDHFR与所要调控的目的蛋白之间采用刚性连接肽进行连接。
本发明中，通过将刚性连接肽将所述调控系统与目的蛋白相连，可以降低不调控时蛋白的本底水平，有效提高调控目的蛋白表达的幅度，提高调控效果，发明人发现所述刚性连接肽可以连接在ecDHFR的C端或N端，刚性连接肽连接在任意一端不会对调控系统的调控效果产生影响，但是刚性连接肽必须连接在ecDHFR和目的蛋白之间。
本发明中，所述ecDHFR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列如下：MISLIAALAVDYVIGMENAMPWNLPADLAWFKRNTLNKPVIMGRHTWESIGRPLPGRKNIILSSQPGTDDRVTWVKSVDEAIAACGDVPEIMVIGGGRVIEQFLPKAQKLYLTHIDAEVEGDTHFPDYEPDDWESVFSEFHDADAQNSHSYCFEILERR.
根据本发明，所述刚性连接肽为(EAAAK)n或A(EAAAK)nA，其中n独立地选自1-6中的任意整数，例如可以是1、2、3、4、5或6，优选n为6。
根据本发明，所述刚性连接肽为A(EAAAK)nA，其中n为1-6中的任意整数，例如可以是1、2、3、4、5或6，优选n为6。
本发明中，连接肽的长度直接影响着功能蛋白的间距，过长或过短的连接肽都会影响融合蛋白的稳定性与活性等，长度过短会导致空间位阻效应，两端的蛋白不能充分折叠或展开，形成错误构型或阻碍活性位点，造成融合蛋白无活性或低活性，二聚体大量出现，过长会导致融合蛋白整体结构松散，易被宿主细胞中的蛋白酶水解切断。所以，选择的连接肽要有足够的长度和较好的柔韧性，以保证融合连接的蛋白能够在空间上有足够的自由度以发挥其功能，同时链间连接肽中要尽量避免形成α螺旋及β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。
发明人发现采用本发明选择的刚性连接肽，可以有效提高蛋白调控系统的调控目的蛋白的幅度，提高调控效果，且本底水平也低，通过发明人大量的实验验证，(EAAAK)n相比于其他刚性连接肽的调控效果都明显，尤其是(EAAAK)6连接肽的效果最明显，具有最低的本底水平，同时可以有效地提高给药TMP(甲氧苄氨嘧啶)后目的蛋白的表达量，极大的提高了蛋白调控系统调控目的蛋白的表达幅度。
根据本发明，所述目的蛋白为胞内蛋白和/或膜蛋白。
根据本发明，所述膜蛋白为嵌合抗原受体。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的蛋白调控系统的制备方法，包括如下步骤：
构建ecDHFR-刚性连接肽-目的蛋白表达载体，并将构建后的表达载体转染到表达宿主中，得到所述蛋白调控系统。
根据本发明，所述刚性连接肽为(EAAAK)n，其中n独立地选自1-6中的任意整数，例如可以是1、2、3、4、5或6，优选n为6。
根据本发明，所述刚性连接肽为A(EAAAK)nA，其中n为1-6中的任意整数，例如可以是1、2、3、4、5或6，优选n为6。
根据本发明，所述表达载体和表达宿主可以根据不同的目的蛋白进行选择，在此不做特殊的限定。
第三方面，本发明提供一种采用如第一方面所述的蛋白调控系统进行蛋白调控的方法，包括如下步骤：
将构建的蛋白调控系统进行培养，加入TMP进行调控蛋白的表达。
根据本发明，通过外部添加TMP用于控制目的蛋白的表达，控制TMP的添加量可以控制目的蛋白的表达量，不同的蛋白的表达量对TMP添加量的响应值不同，本领域技术人员可以根据控制的目的蛋白进行调整TMP的用量，本发明所述TMP的浓度为5-250μM，例如可以是5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、210μM、220μM、230μM、240μM或250μM。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的蛋白调控系统用于胞内蛋白和/或膜蛋白的蛋白表达调节。
根据本发明，所述膜蛋白为嵌合抗原受体。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的蛋白调控系统用于制备控制胞内蛋白和/或膜蛋白的蛋白表达调节的药物。
根据本发明，所述膜蛋白为嵌合抗原受体。
根据本发明，所述药物还包括TMP。
第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的蛋白调控系统用于制备缓解CAR-T细胞治疗副作用的药物。
本发明中，CAR-T细胞疗法在白血病和淋巴瘤治疗中效果明显，但是其伴随着严重的副作用，尤其是细胞因子释放综合征(CRS)，高度增殖的CAR-T细胞能引起CRS，通过蛋白调控系统制备的药物能够选择性的控制CAR-T细胞的表达，控制CAR-T细胞的表达量，从而保证CAR-T细胞疗效的前提下降低甚至防止副作用。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的蛋白调控系统具有更高的目的蛋白表达量：在添加稳定剂TMP后目的蛋白有更高的表达水平，甚至高于直接表达目的蛋白的表达量；
(2)本发明的蛋白调控系统具有更高的调控比例：在使用等量的TMP诱导目的蛋白表达时，本发明的蛋白调控系统与原系统相比可以表达更多的目的蛋白，所以控制等量目的蛋白表达时，本发明的蛋白调控系统需要更少的TMP，调控更加灵敏；
(3)本发明的蛋白调控系统具有更高的调控幅度：与其他的连接肽优化的DDD调控系统以及未优化的DDD调控系统相比，使用(EAAAK)6连接肽的改良型DDD调控系统的本底水平最低，在不添加稳定剂TMP时表达的目的蛋白最少，同时因为表达的蛋白量多，所以调控幅度高。
附图说明
图1为本发明实施例1pGPC3-EGFP-(EAAAK)6-DHFR-CAR3(ecDHFR-(EAAAK)6)质粒示意图；
图2为本发明实施例2pGPC3-EGFP-(EAAAK)3-DHFR-CAR3(ecDHFR-(EAAAK)3)质粒示意图；
图3为本发明实施例3pGPC3-EGFP-A(EAAAK)5A-DHFR-CAR3(ecDHFR-A(EAAAK)5A)质粒示意图；
图4为本发明对比例1pGPC3-EGFP-DHFR-CAR3(ecDHFR)质粒示意图；
图5为本发明对比例2pGPC3-EGFP-flag-DHFR-CAR3(ecDHFR-Flag)质粒示意图；
图6为本发明对比例3pGPC3-EGFP-(GGGGS)3-DHFR-CAR3(ecDHFR-(GGGGS)3)质粒示意图；
图7为本发明流式分析比较各组GFP荧光平均值结果，其中，图7(a)为未加入TMP、加入10μm TMP和加入100μm TMP的比较；图7(b)随着时间的变化，加入10μm TMP和加入100μm TMP的比较，blank为没有转染的293T细胞，GPC3对照为pGPC3-EGFP-Flag，ecDHFR-(GGGGS)3为对比例3，ecDHFR-(EAAAK)3为实施例2，ecDHFR-(EAAAK)6为实施例1，ecDHFR-A(EAAAK)5A为实施例3，ecDHFR为对比例1；
图8为本发明流式分析比较各组GFP荧光平均值结果，其中，图8(a)未加入TMP和加入100μm TMP的比较；图8(b)随着时间的变化，加入100μm TMP的比较，blank为没有转染的293T细胞，GPC3对照为pGPC3-EGFP-Flag，ecDHFR为对比例1；ecDHFR-A(EAAAK)5A为实施例3，ecDHFR-Flag为对比例2。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：蛋白调控系统的构建
构建293T载体，在pEGFP-C1载体中通过AgeI和EcoRI酶切位点将GPC3带(EAAAK)6连接肽的DDD调控片段插入，获得pGPC3-EGFP-(EAAAK)6-DHFR-CAR3载体，获得的载体如图1所示。
实施例2：蛋白调控系统的构建
构建293T载体，在pEGFP-C1载体中通过AgeI和EcoRI酶切位点将GPC3带(EAAAK)3连接肽的DDD调控片段插入，获得pGPC3-EGFP-(EAAAK)3-DHFR-CAR3载体，获得的载体如图2所示。
实施例3连接肽采用A(EAAAK)5A替代
构建293T载体，在pEGFP-C1载体中通过AgeI和EcoRI酶切位点将GPC3带A(EAAAK)5A连接肽的DDD调控片段插入，获得pGPC3-EGFP-AEAAAK5A-DHFR-CAR3载体，获得的载体如图3所示。
对比例1不含有连接肽
构建293T载体，在pEGFP-C1载体中通过AgeI和EcoRI酶切位点将GPC3不带Flag标签的DDD调控片段插入，获得pGPC3-EGFP-DHFR-CAR3载体，获得的载体如图4所示。
对比例2连接肽采用flag标签替代
构建293T载体，在pEGFP-C1载体中通过AgeI和EcoRI酶切位点将GPC3带flag标签的DDD调控片段插入，获得pGPC3-EGFP-Flag-DHFR-CAR3载体，获得的载体如图5所示。
对比例3连接肽采用(GGGGS)3替代
构建293T载体，在pEGFP-C1载体中通过AgeI和EcoRI酶切位点将GPC3带(GGGGS)3连接肽的DDD调控片段插入，获得pGPC3-EGFP-GGGGS3-DHFR-CAR3载体，获得的载体如图6所示。
实施例4刚性连接肽和其他连接肽的效果验证
将实施例1-3和对比例1、3进行给药TMP(10μM，100μM)培养48h后进行流式细胞仪检测各组的GFP荧光，分析各组的荧光平均值数据结果如图7(a)-图7(b)所示，其中blank为没有转染的293T细胞，GPC3对照为pGPC3-EGFP-Flag。
从图7(a)-图7(b)可以看出，从流式细胞仪分析的荧光可以看出，带有刚性连接肽(EAAAK)6(实施例1)、(EAAAK)3(实施例2)、A(EAAAK)5A(对比例3)的不添加TMP的实验组的目的蛋白表达的本底水平都比较低，而使用柔性连接肽(GGGGS)3(对比例4)的不添加TMP的实验组的目的蛋白表达的本底水平都比较高，甚至要比不添加连接肽的pGPC3-EGFP-DHFR-CAR3(对比例1)的本底水平都要高，同时，带有刚性连接肽(EAAAK)6(实施例1)、(EAAAK)3(实施例2)、A(EAAAK)5A(对比例3)和(GGGGS)3(对比例4)的给药10μM，100μM TMP的目的蛋白的表达水平要高于不带连接肽的pGPC3-EGFP-DHFR-CAR3(对比例1)以及不用DDD调控系统的单纯表达GPC3的对照组pGPC3-EGFP-Flag要高，可见，带有连接肽可以提高DDD调控系统的调控幅度。相比实施例1-2和对比例3-4，发现刚性连接肽(EAAAK)6(实施例1)的效果最优越，本底低，调控幅度高，调控比例远超于其他的实施例和对比例，在10μM组有5倍的调控比例，而在10μM组有接近7倍的调控比例，调控比例随着TMP给药量的提高而变得明显。
实施例5带有连接肽和不带有连接肽的效果验证
将实施例3和对比例1-2进行给药TMP(100μM)培养48h后进行流式细胞仪检测各组的GFP荧光，分析各组的荧光平均值数据结果如图8(a)-图8(b)所示，其中blank为没有转染的293T细胞，GPC3对照为pGPC3-EGFP-Flag。
从图8(a)-图8(b)可以看出，不带有连接肽的调控幅度最低，而带有A(EAAAK)5A(对比例3)连接肽以及Flag标签(对比例2)作为连接肽对照的实验组的调控幅度都高于不带有连接肽(对比例1)的组，但是带有Flag标签(对比例2)的组的没有添加TMP时的本底水平非常高，所以其调控比例比不添加连接肽的组还低，所以带有不合适的连接肽虽然可以提高目的蛋白的调控幅度，但是调控的灵敏度反而下降。而带有A(EAAAK)5A(对比例3)连接肽的组的调控比例有6倍，比没有添加连接肽(对比例1)的组的调控比例的4倍还高，所以调控幅度还是带有A(EAAAK)5A(对比例3)连接肽的组最高。可见，DDD调控系统在ecDHFR与目的蛋白中间带有连接肽或者一定长度的肽段可以提高DDD调控系统的调控效果，但是合适的连接肽可以在提高调控灵敏度的同时降低本底的水平。
综上所述，实施例1-2的发现刚性连接肽(EAAAK)6(实施例1)的效果最优越，本底低，调控幅度高，调控比例远超于其他的实施例和对比例，在10μM组有5倍的调控比例，而在10μM组有接近7倍的调控比例，调控比例随着TMP给药量的提高而变得明显，刚性连接肽(EAAAK)n的效果优于刚性连接肽A(EAAAK)nA，刚性连接肽的效果优于其他连接肽的效果，含有连接肽的效果优于不含有连接肽的效果。
对DDD调控系统的元件ecDHFR与刚性连接肽(EAAAK)n连接肽融合，获得改良的DDD调控系统元件再对目的蛋白进行调控，改良型的DDD调控系统的调控水平有很大的提高，灵敏度也有很大的提高，而其中连接肽(EAAAK)6的效果最为显著。改良型的DDD调控系统更加适合于调控目的蛋白的表达，有很高的使用价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州中科蓝华生物科技有限公司
<120> 一种蛋白调控系统及其制备方法和应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 1
Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Tyr Val Ile Gly Met
1 5 10 15
Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys
20 25 30
Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu
35 40 45
Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser
50 55 60
Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu
65 70 75 80
Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly
85 90 95
Gly Arg Val Ile Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu
100 105 110
Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr
115 120 125
Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp
130 135 140
Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Cys Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg
145 150 155
Claims (6)
1.一种低本底水平、高调控幅度的改良型蛋白调控系统，其特征在于，所述蛋白调控系统中的二氢叶酸还原酶与所要调控的目的蛋白之间采用刚性连接肽进行连接；
所述刚性连接肽为(EAAAK)6，连接于二氢叶酸还原酶和目的蛋白之间；
所述目的蛋白为膜蛋白，所述膜蛋白为嵌合抗原受体，且所述蛋白调控系统以100-250μM的甲氧苄氨嘧啶为稳定剂调控目的蛋白的表达。
2.一种如权利要求1所述的蛋白调控系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建二氢叶酸还原酶-刚性连接肽-目的蛋白表达载体，并将构建后的表达载体转染到表达宿主中，得到所述蛋白调控系统；
所述刚性连接肽为(EAAAK)6。
3.一种采用如权利要求1所述的蛋白调控系统进行蛋白调控的方法，所述方法为非疾病的诊断和治疗目的的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将构建的蛋白调控系统进行培养，加入100-250μM甲氧苄氨嘧啶进行调控蛋白的表达。
4.如权利要求1所述的蛋白调控系统在非疾病的诊断和治疗目的的膜蛋白的蛋白表达调节中的应用；
其中，所述膜蛋白为嵌合抗原受体。
5.如权利要求1所述的蛋白调控系统在制备控制膜蛋白的蛋白表达调节的药物中的应用；
所述膜蛋白为嵌合抗原受体；
所述药物还包括甲氧苄氨嘧啶。
6.如权利要求1所述的蛋白调控系统在制备缓解嵌合抗原受体T细胞治疗副作用的药物中的应用。
Priority Applications (2)
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