CN101014616A

CN101014616A - 接头分子

Info

Publication number: CN101014616A
Application number: CN 200580030121
Authority: CN
Inventors: 彼得·阿蒂米克; 萨班德拉·普拉丹安加; 乔恩·塞耶斯; 理查德·罗斯
Original assignee: Asterion Ltd
Current assignee: Asterion Ltd
Priority date: 2004-07-26
Filing date: 2005-07-18
Publication date: 2007-08-08

Abstract

我们公开了包含至少两个能够结合细胞因子受体的结构域的治疗性多肽，其中所述结构域由肽接头连接，其中该接头任选地包含刚性α螺旋区。

Description

接头分子

本发明涉及包含至少两个能够结合细胞因子受体的结构域的多肽，其中所述结构域由肽接头(linker)分子连接。

一组被称为细胞因子的生长因子参与多种不同的细胞功能。这些功能包括，举例但非限制，调整免疫系统、调节能量新陈代谢和控制生长和发育。细胞因子通过在靶细胞的细胞表面表达的受体介导其作用。细胞因子受体可分为三个单独的亚组。I型受体(生长激素(GH)家族)由它们的胞外结构域的氨基末端部分的四个保守的半胱氨酸残基和C-末端部分存在的保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序所表征。该重复的Cys基序也存在于II型(干扰素家族)和III型(肿瘤坏死因子家族)中。

已知许多细胞因子结构域通过特异位点与它们的关连受体互相作用。一些细胞因子受体具有高亲和性结构域结合位点和低亲和性结合位点。

例如，已知GH的单独一个分子与两个受体分子(GHR)关联(Cunningham et al.，1991；de Vos et al.，1992；Sundstrom et al.，1996；Clackson et al.，1998)。其通过GH上两个独特的受体-结合位点和两个受体的胞外结构域的共同的结合囊发生。GH分子的位点1具有比位点2更高的亲和性，并且受体二聚体化被认为是顺序发生的：一个受体结合到GH的位点1，随后第二个受体被召集到位点2。GHR的胞外结构域存在两个相连结构域，每个约100个氨基酸。激素结合形成三聚复合体GHR-GH-GHR时，这两个结构域的构象发生改变。GHR-GH-GHR复合体内化，随后进行再循环步骤，通过该步骤受体分子再生并在细胞内继续使用。

细胞因子和其它结构域结合经常形成受体-结构域复合体。参与复合体形成的受体可能是同源或异源的。例如，红细胞生成素和GH，形成受体-激素-受体的三聚体复合体。白介素-4形成受体-激素-不同受体的三聚体复合体。肿瘤坏死因子通过形成细胞跨膜肿瘤坏死因子受体(TNF-1/p55或TNF-2/p75)的同型三聚体传导信号。其它细胞因子，如瘦素(leptin)和GCSF，形成受体-激素-激素-受体的四聚体复合体，并且其它(如白介素6)可能形成由两个可溶受体分子、两个跨膜受体分子和两个细胞因子分子组成的六聚体复合体。每种情况中都有将细胞因子定位于受体复合体的主要高亲和性结合位点，和在改变构象或召集其它分子以起始信号传导中起次要作用的其它位点。

细胞因子的TNF超家族活化用于细胞生存、死亡和分化的信号传导途径，该细胞的生存、死亡和分化调控淋巴组织、乳房组织、神经组织和外胚层组织的发育、组织和自身稳定。已证明了TNF在宿主防御中的作用，这些作用例如包括脾细胞分化、完全IgG反应和类型转换、巨噬细胞活化、一氧化氮和活性氧自由基的生成。但是，过量表达时，TNF还与发病有关。在以下病理中找到该相关性的证据：细菌脓毒病、移植物抗宿主病、脑型疟、类风湿关节炎、斑秃/全秃(alopecia areata/generialis)、哮喘、癌症、Crohn病、糖尿病、肥胖症、银屑病和银屑病关节炎、结节病、硬皮病和中毒性休克综合征。这些病理被公认为是抗TNF剂应用建立的和/或潜在的病理。

细胞因子的过量表达是造成多种人类疾病的原因，例如肢端肥大症、巨人症、GH缺乏症、Turners综合征、肾衰竭、骨质疏松症、骨关节炎、糖尿病、癌症、肥胖症、胰岛素抵抗、高脂血症、高血压、贫血、自身免疫和感染性疾病、包括类风湿关节炎的炎性疾病。

抑制诸如GH、促乳素或TNF的细胞因子的作用的方法是进行拮抗剂的给药。

GH拮抗剂的一个例子是Pegvisomant，其为包裹于聚乙二醇(PEG)中的经修饰的GH分子。Pegvisomant有许多有益效果，包括，例如由于增加的有效分子量降低了肾小球滤过速度，因而减少产生期望效果所需要的剂量(参见Abuchowski et al J Biol Chem.，252，3578-3581，(1977))。但是，聚乙二醇化的结果是减小该经修饰的GH分子对GHR的亲和性。

WO03/057729(在此整体并入以作参考)公开了促乳素拮抗剂的一个例子，更具体地是编码所述促乳素拮抗剂的核苷酸和蛋白质序列。该促乳素拮抗剂包括对人促乳素氨基酸序列的修饰，该修饰用精氨酸残基代替位点129的甘氨酸残基。该经修饰的促乳素作为促乳素受体活化的抑制剂。

已经发展出许多治疗策略以抑制TNF，其基于能够i)抑制TNF合成(例如使用抑制性细胞因子IL-10、沙利度胺(thalidomide)、皮质类固醇、环孢菌素A、反义寡核苷酸)；ii)抑制TNF加工处理(例如金属蛋白酶(TACE)抑制物)；iii)中和TNF(例如使用可溶性TNF受体或TNF抗体)。

我们描述了包含多个细胞因子受体的配体结合结构域的多肽及其在调节受体介导的细胞因子活化中的用途。

依照本发明的一方面，提供了包含至少两个能够结合细胞因子受体的细胞因子结合结构域的多肽，其中所述结构域通过包含非柔性螺旋区的肽接头(linker)分子连接。

本发明的优选实施方案中，所述多肽作为所述细胞因子受体的拮抗剂。可选择地，所述多肽作为激动剂。

优选地，所述多肽包含串联排列的结构域。本发明的优选实施方案中，所述多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个串联排列的结构域。

本发明的其它优选实施方案中，所述多肽包含多于10个串联排列的结构域。

优选地，所述非柔性螺旋区包含至少一个拷贝的基序A(EAAAK)xA，或其功能性变体。优选地所述肽接头分子包含两个拷贝的基序EAAAK，且该肽接头分子的长度通过递增的加入至少一个氨基酸是可延长的。

“功能性变体”是通过一个或多个替代、添加、缺失造成氨基酸序列可能不同的接头分子，但是其保持基本的螺旋的或非螺旋的构象。优选的变体是那些通过保守氨基酸替代与参考氨基酸序列相区别的变体。该替代中特定氨基酸被相似特征的另一氨基酸替代。以下非限制性氨基酸名单被认为是保守取代(相似)：a)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸、赖氨酸和组氨酸；e)异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸；及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最优选的是基本保持柔性或非柔性的螺旋接头区域的氨基酸替代。

本发明的其它优选实施方案中，所述接头分子包含至少一个柔性非螺旋区。

如上所述，提供非柔性螺旋区保持所述结构域的空间分离时，提供柔性非螺旋区使结构域能够调整方向进入细胞因子受体的结合位点。

本发明的一个实施方案中，柔性非螺旋区位于或接近所述肽接头分子的氨基末端，因此允许位于该肽接头分子的氨基末端的结合结构域依据其关联受体调整方向。

本发明的其它实施方案中，柔性非螺旋区位于或接近肽接头分子的羧基末端，因此允许位于该肽接头分子的羧基末端的结合结构域依据其关联受体调整方向。

本发明的其它实施方案中，柔性非螺旋区位于或接近肽接头分子的氨基和羧基末端，因此允许分别位于该肽接头分子的氨基末端和羧基末端的结合结构域依据其关联受体调整方向。

优选地，柔性非螺旋区与至少一个结合结构域相邻。更优选地，该柔性非螺旋区在结合结构域和非柔性螺旋区之间形成连接。

更优选地，所述非柔性螺旋区包含至少一个拷贝的基序A(EAAAK)_xA。所述非柔性螺旋区的长度通过增加该A(EAAAK)_xA基序的重复数目是可延长的。

本发明的优选实施方案中，A(EAAAK)_xA基序中的x少于10个拷贝。更优选地，x少于5个拷贝。甚至更优选地，x选自1、2、3、4或5个拷贝。

本发明的优选实施方案中，刚性α螺旋接头和结合结构域之间没有柔性连接，但是所述结合结构域通过所述非柔性α螺旋接头直接连接。

本发明的优选实施方案中，所述结合结构域通过由非柔性α螺旋组成的接头分子连接。

本发明的优选实施方案中，所述接头分子连接一结合结构域的羧基末端和另一结合结构域的氨基末端。

本发明的这一实施方案中，所述螺旋接头在所述第一细胞因子分子的C-末端螺旋和所述第二细胞因子分子的N-末端螺旋之间是连续的，因此其以基本上固定的方向刚性地连接所述两个细胞因子结合结构域。例如，其可能涉及删除第一细胞因子结构域的N-末端和螺旋后C-末端的短区域，以及第二细胞因子的螺旋前N-末端的短区域(即第一细胞因子的第182-190位残基，和第二细胞因子的第1-5位残基，因为这些是第一细胞因子中C-末端螺旋(如图1B中的螺旋4)后和第二细胞因子的N末端(如图1B中的螺旋1’)前的随机卷曲构象的短区域)。

不同构建体中，通过以下方式可以改变该固定的方向(翻译的和旋转的)：插入1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的氨基酸，或删除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，其产生具有新特征的分子，例如拮抗特征。加入额外氨基酸将产生约1.5的所述两个结构域的附加的相对翻译和所述两个结构域的绕螺旋轴的约+100°的相对旋转。通常，接头可以从两个EAAAK单位开始并且通过加入A、AA、AAA、AAAA、EAAAA和EAAAK序列延长。

本发明的其它优选实施方案中，所述多肽的结合结构域彼此相同或相似。

本发明的其它优选实施方案中，所述多肽包含细胞因子的结合结构域，所述细胞因子选自生长激素；瘦素；红细胞生成素；促乳素；白介素(IL)IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12的p35亚基、IL-13、IL-15；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；睫状神经营养因子(CNTF)；心脏营养素-1(CT-1)；白细胞抑制因子(LIF)；制瘤素M(OSM)；干扰素、IFNα和IFNγ，肿瘤坏死因子(TNF)α和TNFβ，及RANK配体。

本发明的其它优选实施方案中，至少一个所述结构域包含生长激素结合结构域。

本发明的其它优选实施方案中，所述多肽包含至少两个生长激素或生长激素变体的结合结构域。

美国专利5,849,535公开了经修饰的GH变体，在此引为参考。对GH的该修饰发生在位点1和位点2的结合位点。对位点1的修饰产生对GHR的亲和力高于野生型GH的GH分子，这种修饰的GH分子具有激动剂活性。该文献还公开了对位点2的修饰，该修饰产生GH拮抗剂。美国专利5,854,026、6,004,931、6,022,711、6,057,292和6,136,563公开了修饰GH而改变GH位点1的亲和力的其它例子，其中的每一篇在此均引为参考。对位点2的修饰也有公开，特别是当将GH的氨基酸残基G120修饰为精氨酸，赖氨酸，色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸或谷氨酸中的任何一种时，会产生一种具有拮抗特性的GH分子。

在我们同样待决的申请WO03/070765中(在此引为参考)，我们描述了关于GH受体活化的具有拮抗活性的GH变体的融合。该GH变体通过柔性接头与该生长激素受体的胞外结构域融合。该嵌合多肽显示延迟的清除和拮抗活性。提供具有非柔性或部分柔性接头的类似嵌合多肽也在本发明公开的范围内。

本发明的可选择的优选实施方案中，所述多肽包含至少两个促乳素或促乳素变体的结合结构域。

本发明的优选实施方案中，所述促乳素变体多肽包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在人促乳素的位点第129位被修饰。

本发明的优选实施方案中，所述修饰是氨基酸替代。优选地，所述替代是用精氨酸氨基酸残基代替甘氨酸氨基酸残基。优选地，所述修饰还包含至少9、10、11、12、13或14个氨基末端的氨基酸残基的删除。

本发明的可选择的实施方案中，多肽的结合结构域彼此相似。

本发明的优选实施方案中，所述多肽包含第一结合结构域和第二结合结构域，所述第一结合结构域为生长激素结合结构域，所述第二结合结构域为促乳素结合结构域。

优选地，所述多肽由生长激素结合结构域和促乳素结合结构域组成。

本发明的其它优选实施方案中，所述多肽包含第一结合结构域和第二结合结构域，所述第一结合结构域为经修饰的生长激素结合结构域，所述第二结合结构域为经修饰的促乳素结合结构域。

优选地，所述多肽由经修饰的生长激素结合结构域和经修饰的促乳素结合结构域组成。

本发明的优选实施方案中，所述经修饰的生长激素结合结构域包含氨基酸位点第120位甘氨酸的氨基酸替代。优选地，所述修饰是用选自精氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸的氨基酸代替第120位甘氨酸。

本发明的优选实施方案中，所述修饰是用精氨酸氨基酸残基代替第120位甘氨酸。

本发明的其它优选实施方案中，所述经修饰的促乳素结合结构域包含第129位甘氨酸的修饰。优选地，所述修饰是用精氨酸氨基酸残基代替第129位甘氨酸。优选地，所述修饰还包含至少9、10、11、12、13或14个氨基末端的氨基酸残基的删除。

本发明的其它优选实施方案中，所述多肽还包含细胞因子受体的配体结合结构域。优选地，所述受体是生长激素受体。本发明的其它优选实施方案中，所述受体是促乳素受体。

本发明的优选实施方案中，通过包含或由非柔性螺旋区组成的接头，所述配体结合结构域可与所述细胞因子结合结构域结合。

本发明的另一方面，提供编码本发明的多肽的核酸分子。

本发明的优选实施方案中，所述核酸是适于所述多肽表达的载体。

通常，所述适于包括提供介导细胞/组织特异表达的转录控制序列(启动子序列)。这些启动子序列可以是细胞/组织特异的、可诱导的或组成型的。

启动子是本领域公知的术语，但为了清楚的目的，描述为具有下列特征，这些特征仅仅是举例，并不产生任何限制。增强子元件是顺式作用核酸序列，通常位于基因转录起始位点的5′端(增强子也可位于基因序列的3′端或甚至位于内含子序列中，因而其位置独立)。增强子的功能是增强与其连接的基因的转录速率。增强子的活性受与增强子元件特异结合的反式作用转录因子(多肽)的影响。转录因子的结合/活性(参见Eukaryotic Transcription Factors(真核转录因子)，by David SLatchman，Academic Press Ltd，San Diego)受许多环境因素的影响，这些因素的例子包括，但不限于中间代谢物(如葡萄糖)和/或环境效应因素(如热)。

启动子元件还含有所谓的TATA框和具有转录起始位点选择功能的RNA聚合酶起始选择(RIS)序列。这些序列还与多肽结合，该多肽具有有利于RNA聚合酶转录起始选择的功能。

所述的适于还包括提供选择性标记和有助于在真核细胞或原核细胞中保持所述载体的自主复制序列。自主保持的载体被称为游离型载体。

所述的有助于编码基因载体表达的适于包括提供转录终止子/聚腺苷酸化序列，还包括提供内部核糖体进入位点(IRES)，该IRES具有使排列在双顺反子或多顺反子表达盒中的基因编码载体最大化表达的功能。

这些适于是本领域公知的，有大量的公开文献涉及到通用的表达载体的构建和重组DNA技术。参见Sambrook等(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，ColdSpring Harbour，NY；Marston，F(1987)DNA Cloning Techniques：APractical Approach，第3卷，IRL Press，Oxford UK；DNA Cloning：F MAusubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。

本发明的载体可以是基因治疗载体，这对于本领域技术人员是显而易见的。基因治疗载体通常是基于病毒的。许多病毒常被用作递送外源基因的载体。常用的载体包括重组修饰的有包膜的或无包膜的DNA和RNA病毒，优选地选自杆状病毒科、细小病毒科、picornoviridiae、疱疹病毒、痘病毒科、腺病毒科或picornnaviridiae。也可使用嵌合载体，其使用每个母体载体特征的有利元素(例如参见，Feng，et al.(1997)NatureBiotechnology 15：866-870)。这种病毒载体可以是野生型的或可经重组DNA技术修饰成为复制缺陷的、条件复制的或增殖型的。

优选的载体源自腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒的基因组。本发明的大多数优选的实践中，所述载体源自人腺病毒基因组。特别优选的载体源自人血清2型或血清5型腺病毒。通过E1a和/或E1b编码区中的修饰或删除可以减弱这种载体的复制能力(至可被认为是“复制缺陷”的点)。为完成特定表达特征或允许重复给药或降低免疫反应而对病毒基因组进行的其它修饰是优选的。

或者，该病毒载体可以是条件复制的或增殖型的。条件复制病毒载体用于完成在特定细胞类型中的选择性表达，同时避免不利的广谱感染。Pennisi，E.(1996)Science 274：342-343和Russell，and SJ.(1994)Eur.J.ofCancer 30A(8)：1165-1171中描述了条件复制载体的例子。条件复制载体的其它例子包括那些载体，其中病毒复制必需的基因处于只在特定细胞类型或细胞状态下活化的启动子的控制之下，使得缺乏该基因表达时，病毒不复制。于1997年12月16日授权的Henderson et al.的第5,698,443号美国专利和于1999年2月16日授权的Henderson et al.的第5,871,726号美国专利中描述了该载体的例子，此处并入其全部公开以供参考。

此外，可修饰病毒基因组以包括可诱导的启动子，其只在某些条件下完成复制或表达。可诱导的启动子的例子可从科学文献中获知(例如参见Yoshida and Hamada(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.230：426-430；Iida，et al.(1996)J.Viroi.70(9)：6054-6059；Hwang，et al.(1997)J.Virol71(9)：7128-7131；Lee，et al.(1997)MoI.Cell.Biol.17(9)：5097-5105；和Dreher，et al.(1997)J.Biol.Chem 272(46)；29364-29371.)。

载体还可以是非病毒的，并且可以从多种本领域技术人员容易获得的商业来源获得。例如，该载体可以是游离的或整合的质粒。

本发明的其它方面，提供了经本发明的核酸和载体转化或转染的细胞。

本发明的优选实施方案中，所述细胞是真核细胞。

优选地，所述真核细胞选自真菌细胞，例如Saccharomyces cerevisiae，Pichia spp，粘菌(例如Dictyostelium spp)、昆虫细胞(例如Spodopterafrugiperda)、植物细胞或哺乳动物细胞(例如CHO细胞)。

本发明的其它优选实施方案中，所述细胞是原核细胞。

本发明的其它方面，提供了制备本发明的多肽的方法，所述方法包含步骤：

i)在有利于生产本发明的多肽的条件下生长本发明的细胞；及

ii)从所述细胞或其生长环境中分离所述多肽。

本发明的优选方法中，提供具有亲和标签的所述多肽。

亲和标签为本领域已知，包括麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶、钙调蛋白结合蛋白和将聚组氨酸轨迹工程化到蛋白质中，该蛋白质随后在含有镍的基质上被亲和纯化。许多情况中，可商购的载体和/或试剂盒可用于融合所关注蛋白和合适的亲和标签，该融合蛋白随后被转染到宿主细胞中用于表达及随后的亲和基质上的提取和纯化。

在我们同样待决的申请WO03/070765中(在此引为参考)，我们描述了用于多肽的新的亲和标签，其利用包括信号序列的结构域，该信号序列指导向该多肽加入糖基磷脂酰肌醇。包括糖基磷脂酰肌醇标签的多肽优先插入脂质膜中，并且可以对细胞因子受体活化有拮抗效果。因此，本文公开的发明包括有糖基磷脂酰肌醇分子附着的多肽。

依照本发明另一方面，提供了包含与第二细胞因子结合结构域连接的第一细胞因子结合结构域的多肽，其中所述多肽还包含细胞因子受体的胞外结构域。

本发明的优选实施方案中，所述第一和第二结合结构域由柔性接头分子连接。

本发明的可选择的优选实施方案中，所述第一和第二结合结构域由包含非柔性螺旋区的肽接头分子连接。

本发明的优选实施方案中，所述第一和第二结合结构域由包含非柔性螺旋区和柔性非螺旋区的肽接头分子连接。

包含非柔性螺旋区及非柔性螺旋区和柔性非螺旋区的组合的肽接头分子之前已描述，并且其适用于本发明的这一实施方案，就如之前说明的细胞因子和细胞因子受体一样。

本发明的优选实施方案中，所述细胞因子受体的胞外结构域通过接头分子与该第一或第二细胞因子结合结构域连接。优选地，所述接头分子包含非柔性螺旋区。

本发明的可选择的优选实施方案中，所述接头分子是柔性的。

优选地，所述接头分子包含非柔性螺旋区和柔性非螺旋区。

本发明的优选实施方案中，所述细胞因子结合结构域是生长激素或生长激素的变体，并且所述胞外结构域是生长激素的胞外结构域。优选地，所述结构域是人的。

本发明的多肽可能显示双功能性。第一，所述包含细胞因子或其部分(其优选地通过包含非柔性螺旋区的接头分子连接)的第一和第二结构域能够结合细胞表面细胞因子受体，并且空间位阻这些受体结合成为受体复合物，因此阻止下游细胞信号传导。第二，提供包含细胞因子或其部分的第三结构域能够起到可溶性受体的作用，因此在其结合细胞表面受体之前连接任何细胞因子。该第三结构域优选地通过包含非柔性螺旋区的肽接头分子与第一或第二结构域连接。本发明的可选择的实施方案中，所述第三结构域优选地通过包含柔性非螺旋区的肽接头分子与第一或第二结构域连接。

本发明的优选实施方案中，所述肽接头分子还包含对蛋白酶剪切敏感的氨基酸序列。

本发明的另一方面，提供本发明的多肽或核酸分子作为药物的用途。

优选地提供包含本发明的多肽或核酸分子的药物组合物。优选地，所述药物组合物包含载体、赋形剂和/或稀释剂。

给药时，本发明的治疗组合物以药物可接受的制剂的形式给药。术语“药物上可接受”是指不妨碍活性成分的生物学活性效果的非毒性物质。所述制剂通常可以含有盐、缓冲剂、相容载体、防腐剂和任选的其它治疗剂。

用在药物中时，所述盐应该是药物可接受的，但是非药物可接受的盐可方便地用于制备其药物可接受的盐，并且不被排除在本发明的范围之外。这种药理学的和药物可接受的盐包括但不限于那些从以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、蚁酸、丙二酸、琥珀酸等等。而且，药物可接受的盐可以以诸如钠盐、钾盐或钙盐的碱金属盐或碱土金属盐的形式制备。

所述药物组合物可含有适合的缓冲剂，包括：盐形式的乙酸、盐形式的柠檬酸、盐形式的硼酸和盐形式的磷酸。

如果需要，所述组合物可与药物可接受的载体组合。如本发明所用，术语“药物可接受的载体”是指一种或多种适于向人给药的相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包被物质。术语“载体”是指天然或合成的有机或无机成分，活性成分与其结合可使应用方便。所述药物组合物的成分还能够以特定方式与本发明的分子共混合，以及与其自身混合，该特定方式使得不产生可能损害期望药效的相互作用。

所述的药物组合物可以方便地制成单位剂量形式，并用制药领域公知的任何方法来制备。所有方法包括将活性剂与组成一个或多个附加成分的载体组合的步骤。通常，按如下所述制备组合物：均一地和紧密地将活性化合物与液态载体、精细分离的固体载体或两者组合，以及如果需要的话，随后定形产品。

所述的药物组合物任选还可以含有合适的防腐剂，如苯扎氯铵、氯丁醇、羟基苯甲酸酯类和噻汞撒。

本发明的药物组合物可以采用任何常规的方式给药，包括注射或在一段时间内逐渐输注的方式。所述给药的例子包括口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、腔内、皮下或透皮给药。

适于口服给药的组合物可以以不连续单位提供，例如胶囊、片剂、锭剂，每单位还有预定剂量的活性化合物。其它组合物包括水溶液或非水溶液的悬浮液例如糖浆、酏剂或乳剂。

本发明的组合物以有效量给药。“有效量”是组合物的量，其单独或与其它剂一起，产生期望的反应。治疗如癌症的具体疾病的情况下，所期望反应是抑制该疾病的进程。这可能涉及只暂时减慢疾病的进程，尽管更优选地，其涉及永久阻止疾病的进程。这可以通过通常方法监测。

当然，这种剂量取决于具体被治疗的疾病状态、该状态的严重程度、包括年龄、物理条件、身高和体重的患者个体的参数、治疗持续时间、同时进行的治疗的性质(如果有的话)、特定给药途径和健康从业者知识和专长的类似因素。这些因素对本领域普通技术人员是已知的，并且只需常规实验就可确定。使用最大剂量的单独成分或其组合是通常优选的，该最大剂量是根据可靠医学判断的最高安全剂量。但是，本领域普通技术人员应了解，患者可能出于医学原因、生理原因或几乎任何其它原因坚持较低剂量或耐受剂量。

本发明另一方面提供了本发明的多肽或核酸分子制备用于治疗疾病的药物的用途，所述疾病选自肢端肥大症、巨人症、GH缺乏症、Turners综合征、肾衰竭、骨质疏松症、骨关节炎、糖尿病、癌症(例如，前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌、黑素瘤、肝细胞瘤、肾癌、神经胶质瘤，膀胱癌、肺癌、神经癌、卵巢癌、睾丸癌、胰腺癌、胃肠癌、淋巴瘤)、肥胖症、胰岛素抵抗、高脂血症、高血压、贫血、自身免疫和感染性疾病、包括类风湿关节炎的炎性疾病。

本发明还提供治疗人或动物个体的方法，包含向该个体给药有效量的多肽、核酸分子、药物组合物或药物。

贯穿本说明书的描述和权利要求，词语“包含(comprise)”和“含有(contain)”和这些词的变体，如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”，指“包括但不限于”，并且不意谓(并且不)排除其它部分、添加物、成分、完整物或步骤。

贯穿本说明书的描述和权利要求，除非上下文另有要求，单数包括复数。具体地，使用不定冠词时，描述应被理解为预期复数和单数，除非上下文另有要求。

本发明的特定方面、实施方案或实施例描述有关的特征、完整物、特点、化合物、化学部分或组应理解为可用于本文描述其它任何的方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。

通过具体例子并参考下述附图描述本发明的具体实施方案：

图1A：α螺旋(打阴影的矩形)连接细胞因子结构域(椭圆形)。柔性接头(弯曲的箭头)分别连接第一细胞因子结构域到该螺旋，及该螺旋到第二细胞因子结构域；图1B：α螺旋连接细胞因子结构域。柔性接头分别连接第一细胞因子结构域到该螺旋，及该螺旋到第二细胞因子结构域。

图2：螺旋接头没有柔性连接物-取而代之的是，其延续细胞因子1的C-末端螺旋(4)，并且将其连接到细胞因子2的N-末端螺旋(1’)，形成一个长的螺旋4-接头-螺旋1’的刚性串联体。这两个细胞因子的相对方向因此固定。但是，通过从该接头加入或去除氨基酸制备的不同构建体，可以制备一系列刚性串联体，其中结构域方向不同。

图3显示构建体χ1C1b的图和核苷酸/氨基酸序列。

图4显示接头设计的纵览和用于制备有柔性末端的螺旋接头的串联体的引物。

图5显示A)GH结构域和接头之间边缘区的设计，其允许通过引物二联体的连接制备结构域之间的不间断的螺旋接头。B)用于修饰χ1C1b以制备χ1C5的引物。

图6显示构建体χ1C5的图和接头区域的序列。

图7显示接头设计的纵览和用于制备具有刚性螺旋接头的串联体的引物。

图8所示为显示构建χ1L1的策略的示意图。

图9显示χ1L1的核苷酸序列。GH结构域以灰色显示，GHR结构域以粗体显示，接头以下划线显示。

图10显示χ1L1的氨基酸序列。GH结构域以灰色显示，GHR结构域以粗体显示，接头以下划线显示。

图11所示为显示构建χ1L1的克隆策略的示意图。

图12显示χ1L1的表达。

图13显示χ1L1-His的初步纯化。使用Co²⁺柱纯化χ1L1-His。

图14显示χ1L1表现激动剂活性。

图15总结了关于刚性或半刚性GH构建体使用的命名法。

图16a)是包含半刚性接头序列的GH串联体的核酸序列；b)是包含半刚性接头序列的GH串联体的蛋白质序列；c)显示用于GH串联体的构建中的半刚性接头的例子；d)显示包含半刚性接头的GH串联体的细菌表达；和e)显示包含半刚性接头的GH串联体的生物活性。

图17a)是包含刚性接头序列的GH串联体的核酸序列；b)是包含刚性接头序列的GH串联体的蛋白质序列；c)显示用于GH串联体的构建中的刚性接头的例子；d)显示包含刚性接头的GH串联体的细菌表达；和e)显示包含刚性接头的GH串联体的生物活性。

图18A显示T1cEAK2+3his的纯化及考马斯染色和Western印迹分析；图18B和18C显示T1cEAK2+3his的生物活性；图18D显示TlcEAK2+4his的纯化及考马斯染色和Western印迹分析；并且图18E和18F显示T1cEAK2+4his的生物活性。

图19显示用于生长激素串联体的检测的ELISA。

图20示意性显示通过柔性、半刚性的和刚性的接头连接的生长激素串联体。

图21显示促乳素(PRL)、生长激素(GH)及它们的拮抗性突变体的可能组合的例子。

图22显示促乳素的核酸和氨基酸序列，以及一个它的拮抗性形式：1-14氨基酸截短的G129R突变体(下划线表示)。

图23显示生长激素的核酸和氨基酸序列，以及一个它的拮抗性形式：G120R突变体(下划线表示)。

图24是促乳素串联体的示意图。

图25(A)GH刚性串联体构建体的示意图，该构建体有工程化的限制位点NotI和NruI，其允许接头与毗邻结构域的末端螺旋直接连接，还促进接头的变化。(B)PRL-接头-GH刚性构建体的示意图，该构建体有工程化的限制位点NotI和NruI，其有与(A)中相似的功能，NotI位点在接头区域中并且因此可被连接到结构域A中的截短的PRL基因。(C)PRL刚性串联体的示意图，需要使用简并的氨基酸密码在接头和结构域B中的PRL之间的边界，工程化独特的限制位点，使得容易合成和修饰该串联体基因。

材料和方法

GH串联体中接头的修饰起始于GH-(G₄S)-GH分子(χ1C1)的基因，该分子已被修饰以从其表达蛋白的N-末端去除30个氨基酸的突出端，该基因还被亚克隆到修饰的pET21(+)载体中，得到pET21:χ1C1b(图3)。

对于有柔性末端接头的螺旋接头的构建体，通过连接互补寡核苷酸构建构建体；这些寡核苷酸被设计为编码所需接头，并且有可以接入载体pET21:χ1C1b的末端，该载体用NotI和EcoRI消化。图4显示了这些接头的纵览。

对于GH结构域之间的刚性接头，修饰GH结构域以截短它们的C-末端(GH1)和N-末端(GH2)，使得该结构域在螺旋末端结束。然后使用简并密码子设计限制位点，其能够引入新接头且不打断这两个结构域之间形成的螺旋(图5A)。设计引物进行这些对GH串联体的GH结构域的修饰(图5b)。所产生的构建体命名为χ1C5(图6)。使用互补寡核苷酸制备被NotI和NruI位点侧翼连接的接头区域，然后其被连接到经NotI和NruI消化的pET21:χ1C5中。图7显示了这些接头的纵览。

通过首先转化pET表达载体至表达株E.coli BL21(DE3)CodonPlusRIPL中进行构建体的表达。表达可在多种不同条件下进行，包括不同的孵育温度(如室温、37℃)、不同的培养基(如LB、2YT、5YT等等)、不同的诱导点(即开始诱导培养物的OD₆₀₀值)、用于诱导培养物的IPTG(或其它诱导物)的不同浓度和诱导后收集细胞的时间。

可将His-标签添加到所述构建体的C-末端，其有助于其使用固定金属-离子亲和层析(Ni²⁺或Co²⁺柱)的纯化。没有His-标签的构建体可通过多种方法纯化，例如离子交换层析、疏水柱和分子大小排阻层析。可能需要一个或多个这样的纯化技术以制备合适纯度的蛋白。

_{χ1C5的构建}

使用PCR和相关引物制备修饰的GH结构域。使用DiGHNcoGF和GH[AEA3]NotR修饰GH1，并且使用EcoI-(Nru)GH-F和GHΔ^*-HR修饰GH2。PCR反应的组成：1μl 100pmol/μl正向引物、1μl 100pmol/μl反向引物、1μl pTrcHisGHstop(稀释的)、1μl10mM dNTPs、5μl 10x扩增缓冲液、1μl 50mM MgSO₄、0.5μl Pfx聚合酶、39.5μl无菌水。使用以下温度谱对这些反应混合物进行PCR：95℃、5分钟，15x(95℃、45秒，55℃、45秒，72℃、45秒)，72℃、5分钟。使用琼脂糖胶证实PCR产物，并且分离需要的PCR产物。修饰的GH1被连接到pET21:x1C1b的NcoI和NotI位点之间制备pET21:χ1C4。修饰的GH2被连接到pET21:χ1C4的EcoRI和HindIII位点之间制备pET21:χ1C5。图8显示了此过程的纵览。

接头改变

引物的磷酸化

当需要2个或更多引物二联体制备接头时，首先磷酸化含有内部5’-端的引物。为准备磷酸化的每一个引物配制下述反应混合物：2μl100pmol/μl寡核苷酸、2μl 10x激酶缓冲液、2μl 10mM ATP、13μl无菌水、1μl T4多核苷酸激酶(10U/μl)。37℃孵育30分钟，然后70℃孵育10分钟。然后用退火缓冲液(10mM TRIS，50mM NaCl，1mM EDTA，pH7.5-8.0)1∶10稀释样品，获得0.1pmol/μl的溶液，其可用于下述退火反应。

引物二联体的退火

用退火缓冲液(10mM TRIS，50mM NaCl，1mM EDTA，pH7.5-8.0)稀释引物到0.1pmol/μl。在干净试管中混合10μl互补引物。95℃下孵育该试管2分钟，并且在40-60分钟的时间段内使温度下降到30℃。需要多于一个引物二联体时，混合等体积的引物二联体以提供含有形成需要的接头的所有引物二联体的溶液。然后冰上保持该溶液。

连接和转化

经相关限制酶消化的约200ng载体(如用NotI和EcoRI消化pET21:χ1C1b或用NotI和NruI消化pET21:χ1C5)与4μl退火的引物、1μl连接酶缓冲液、2μl T4 DNA连接酶以及将反应液调整为10μl的无菌水一起孵育。冰中孵育过夜，冰可在此时间内融化。然后向50μl化学感受态E.coli SURE细胞中加入5μl过夜的连接产物。冰上孵育1小时，然后42℃热激30秒。向细胞中加入450μl LB培养基，然后37℃孵育30分钟。4000rpm离心该小量培养物5分钟，用50μl LB培养基重新悬浮得到的沉淀物，然后涂布于含有羧苄青霉素(100μg/ml)、四环素(10μg/ml)、葡萄糖(0.3％w/v)的LB平板上。37℃孵育过夜。筛选得到的菌落以检测接头改变是否成功。

通用策略的修改

使用NotI和NruI消化pET21:χ1C5制备有刚性接头的构建体，该构建体的制备在转化后在阴性对照平板(连接反应中没有引物二联体)上产生了大量菌落，因此很难筛选阳性克隆。通过消化载体的去磷酸化解决此问题：NotI和NruI消化的15μl pET21:χ1C52μl CIAP 10x缓冲液、1μl CIAP(小牛肠碱性磷酸酶)(10U/μl)和2μl无菌水混合。37℃孵育1小时后80℃孵育30分钟。使用纯化试剂盒(如Qiagen PCR PurificationKit)从溶液中纯化DNA。用上述方法磷酸化用于制备引物二联体的所有引物。按以上描述将磷酸化的引物二联体连接到去磷酸化的载体中。

χ1L1的克隆和表达

χ1L1由生长因子GH的两个结构域和其后的一个细胞外生长因子结构域组成，这些结构域中的每一个目前由(Gly₄Ser)₄接头连接(图8)。图9显示了χ1L1的核苷酸序列，图10显示了χ1L1的氨基酸序列。

通过将由NheI和XhoI位点侧翼连接的hGH基因连接到χ1E2(GHRa-GH-GHRb)中构建χ1L1；这一步得到χ1K1。然后GHR结构域被连接到χ1K1的EcoRI和HindIII位点之间制得χ1L1。图11显示了此过程的示意图。

通过测序检测χ1L1基因，其被证明是正确的。在E.coli(DE3)BL21CodonPlus RIPL中使用经修饰的pET21(+)载体进行表达。1mM IPTG(终浓度)诱导后4小时的OD₆₀₀为0.5-0.6的LB培养基中表达的蛋白是部分可溶的，并且在使用抗GH的探针的western印迹中观察到多条不同分子量的条带(图12)。

用Co²⁺柱纯化C-末端His-标签的χ1L1(图13)。许多污染蛋白质保留在蛋白质制备品中，并且在western印迹中依然观察到多条不同分子量的条带。该蛋白质制备品的初步生物测定显示其有显著的激动剂活性(图14)。

促乳素串联体的构建和促乳素：生长激素串联体的构建

使用标准PCR技术及随后的连接和转化制备的载体来产生PRL和GH串联体的构建体。可通过连接和转化退火的寡核苷酸对到制备的载体中改变接头。以下显示了PRL和GH串联体的构建体的三个示例性策略。

策略1

PRL-(G₄S)₄-PRL的产生

1.对NcoI和NotI位点之间的PRL进行PCR(正向引物＝atat ccatgggcTTGCCCATCTGTCC；反向引物＝atatatatatatgg gcggccgccGCAGTTGTTGTTGTGG)。

2.用NcoI和NotI消化PCR产物。

3.用NcoI和NotI消化接受载体→pET21(m)χ1C1b(即GH-(G₄S)₄-GH)。

4.连接PCR产物入载体，获得pET21(m)PRL-(G₄S)₄-GH。

5.对EcoRI和HindIIII位点之间的PRL进行PCR(正向引物＝atatg aattcTTGCCCATCTGTCC；反向引物＝atat aagcttGCAGTTGTTGTTGTGG)。

6.用EcoRI和HindIIII消化PCR产物。

7.用EcoRI和HindIIII消化接受载体→pET21(m)PRL-(G₄S)₄-GH。

8.连接PCR产物到载体，获得pET21(m)PRL-(G₄S)₄-PRL。

策略2

PRL-A(EA₃K)₂A-GH的产生

2.用NcoI和NotI消化PCR产物。

3.用NcoI和NotI消化接受载体→pET21(m)TlaEAK2(即GH-A(EA₃K)₂A-GH)。

4.连接PCR产物到载体，获得PRL-A(EA₃K)₂A-GH。

策略3

PRL-A(EA₃K)₄A-pRL的产生

1.退火用于产生A(EA₃K)₄A接头的引物。

2.用NotI和EcoRI消化接受载体→pET21(m)PRL-(G₄S)₄-PRL(来自于上述实例1)。

3.连接寡核苷酸二聚体到载体，获得PRL-A(EA₃K)₄A-PRL。

图24显示上述策略。

实施例1

半刚性串联体

在含有羧苄青霉素、四环素和氯霉素的10ml LB培养基中培养E.coliBL21(DE3)CodonPlus-RIPL细胞。37℃下振荡生长细胞。OD₆₀₀为0.4-0.7时用终浓度为1mM的IPTG诱导培养物。收集培养物前再培养4小时。使用溶菌酶、脱氧胆酸钠和超声波的组合裂解细胞。然后离心分离可溶部分。考马氏亮蓝染色的PAGE没有显示串联体表达的明显条带。

用ELISA测定可溶部分，将40ng/点样孔的串联体上样到12％的PAGE胶。转移蛋白到PVDF膜，western印迹中使用兔抗-GH Ab(一抗)和抗-兔-HRP Ab(二抗)；参见图16d。图16e显示了包含半刚性接头的GH串联体的生物活性。

实施例2

刚性串联体

在含有羧苄青霉素、四环素和氯霉素的10ml LB培养基中培养E.coliBL21(DE3)CodonPlus-RIPL细胞。37℃下振荡生长细胞。OD₆₀₀为0.4-0.7时用终浓度为1mM的IPTG诱导培养物。收集培养物前再培养4小时。

使用溶菌酶、脱氧胆酸钠和超声波的组合裂解细胞。然后离心分离可溶部分。考马氏亮蓝染色的PAGE没有显示串联体表达的明显条带。

用ELISA测定可溶部分，将40ng/点样孔的串联体上样到12％的PAGE胶。转移蛋白到PVDF膜，western印迹中使用兔抗-GH Ab(一抗)和抗-兔-HRP Ab(二抗)；参见图17d。图17e显示了包含半刚性接头的GH串联体的生物活性。

实施例3

串联体的纯化

根据构建体T1cEAK2+3His和T1cEAK2+4His在生物测定中的初始最大活性，选定其用于进一步研究。转化表达载体到E.coli BL21(DE3)CodonPlus RIPL细胞中并在1L每批培养物中进行表达。使用Ni-螯合的固化的金属-离子亲和层析(IMAC)和离子交换层析纯化可溶蛋白质部分。IMAC是第一个纯化步骤，使用pH梯度(pH8到pH3)完成初始洗脱；但是，发现柱清洗中丢失了许多蛋白。因此我们返回使用咪唑洗脱(0到0.5M的咪唑)，使用修改的纯化策略，我们实现了＞70％的纯度。然后使用离子交换柱(Resource Q)继续纯化该蛋白至＞90％的纯度。图18说明了此过程。

基于ELISA结果的定量：T1cEAK2+3His(RQ13/4)＝215μg/ml；T1cEAK2+3His(RQ14/4)＝177μg/ml。

每种获得1ml，因此总产量为392μg。其从2升培养物获得→每升产量＝约200μg。

在更高蛋白质浓度时，T1cEAK2+3-His的活性达到比rhGH更高倍数的诱导。基于摩尔数测试该串联体时，获得相似结果，参见图18B和图18C。对T1cEAK2+4His进行了相似分析。图18D、18E和18F显示了其纯化和生物活性。

基于ELISA结果的定量：T1cEAK2+4His(RQ13/4)＝550μg/ml。其从2升培养物获得→每升产量＝约275μg。在更高蛋白质浓度时，T1cEAK2+4-His的活性达到比rhGH更高倍数的诱导。基于摩尔数测试该串联体时，获得相似结果。

实施例4

使用Bradford分析测量χ1C3的浓度。平行测定rhGH(@1mg/ml)以证实从Bradford分析获得的数据的准确性。然后在GH生物测定中用χ1C3直接代替GH标准给出串联体标准曲线。比对GH标准曲线和串联体标准曲线测量纯的和不纯的串联体样品和rhGH，然后从每一个ELISA板测量蛋白质浓度。GH的ELISA为串联体ELISA测定实际值的约2/3。如图19所示。

实施例5

促乳素/GH串联体

通过PCR向基因末端引入适当的限制位点使其能够连接到串联体基因中，可以合成有或没有其相应拮抗突变的促乳素和/或GH串联体。

柔性串联体

通过用基于序列(G₄S)_n的柔性接头连接两个蛋白质结构域来构建串联体基因；该蛋白质结构域和接头的每个末端都有独特的限制位点(图20)。

因此通过接入不同的结构域可以改变串联体中的所述两个蛋白质结构域。举例来说，促乳素(PRL)、促乳素第1至14氨基酸缺失G129R突变体(Δ1-14 PRL.G129R)、生长激素(GH)和生长激素G120R拮抗突变体(GH.G120R)可以多种方式被组合在该串联体基因中(图B)。图22和23显示了这些结构域的核苷酸序列和蛋白质序列。

可以使用标准PCR产生欲被适合的限制性内切酶位点侧翼连接的所需蛋白质结构域的基因。用这些限制性内切酶消化PCR产物和接受载体，然后连接和转化，将产生有所需蛋白质结构域的串联体。可对蛋白质结构域或接头使用此方法(图24)，该接头可使用已描述的寡核苷酸替代。

半刚性的串联体

通过用基于序列A(EA₃K)_nA的螺旋接头连接两个蛋白质结构域来构建串联体基因；该蛋白质结构域和接头的每个末端都有独特的限制位点(图20)。

因此通过接入不同的结构域可以改变串联体中的所述两个蛋白质结构域。举例来说，促乳素(PRL)、促乳素第1至14氨基酸缺失G129R突变体(Δ1-14 PRL.G129R)、生长激素(GH)和生长激素G120R拮抗突变体(GH.G1 20R)可以多种方式被组合在该串联体基因中(图21)。图22和23显示了这些结构域的核苷酸序列和蛋白质序列。

可以使用标准PCR产生欲被适合的限制性内切酶位点侧翼连接的所需蛋白质结构域的基因。用这些限制性内切酶消化PCR产物和接受载体，然后连接和转化，将产生具有所需蛋白质结构域的串联体。可对蛋白质结构域或接头使用此方法(图24)，该接头可使用已描述的寡核苷酸替代。

刚性的串联体

串联体的两个结构域需要通过结构域A的C-末端α-螺旋和结构域B的N-末端α-螺旋直接连接。因此位于结构域A和结构域B的蛋白质(图22和23)的基因需要被截短使得螺旋接头[A(EA₃K)_nA]直接与这些螺旋相连。

因此：

蛋白质	结构域A截短部分	结构域B截短部分
蛋白质	结构域A截短部分	结构域B截短部分	GH	184-191	1-6
PRL	191-199	1-14	GH	184-191	1-6

通过用基于序列A(EA₃K)_nA的螺旋接头连接两个蛋白质结构域来构建串联体基因；该蛋白质结构域和接头的每个末端都有独特的限制位点(图20)。向接头区域的N-末端工程化独特的NotI位点，向GH的C-末端工程化独特的NruI位点(图5和6)；使GH串联体中接头区域的修饰可行。

包含NotI位点的N-末端接头序列可以被很容易地直接附加于结构域A位置的PRL基因，使得基于模板PRL-接头-GH的构建体被构建(图25)。但是，结构域B是PRL时，必须向接头和结构域B之间的边界区域引入独特的限制位点(图25)。

因此，通过接入不同的结构域可以改变串联体中的所述两个蛋白质结构域。举例来说，促乳素(PRL)、促乳素第1至14氨基酸缺失G129R突变体(Δ1-14 PRL.G129R)、生长激素(GH)和生长激素G120R拮抗突变体(GH.G120R)可以多种方式被组合在该串联体基因中(图21)。依赖其在结构域A或结构域B中的位置，所述蛋白结构域会按上述需求被截短。

可以使用标准PCR产生欲被适合的限制性内切酶位点侧翼连接的所需的蛋白质结构域的基因。用这些限制性内切酶消化PCR产物和接受载体，然后连接和转化，将产生具有所需蛋白质结构域的串联体。可对蛋白质结构域或接头使用此方法(图24)，并类似于柔性和半刚性接头所使用的方法学。

Claims

1.包含至少两个能够结合细胞因子受体的结构域的多肽，其中所述结构域由包含非柔性螺旋区的肽接头分子连接。

2.如权利要求1所述的多肽，其中所述结构域包含3、4、5、6、7、8、9或10个串联排列的结合结构域。

3.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含多于10个的串联排列的结构域。

4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中所述的非柔性螺旋区包含至少一个拷贝的基序A(EAAAK)xA，或其功能性变体。

5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中所述接头分子包含至少一个柔性非螺旋区。

6.如权利要求5所述的多肽，其中所述柔性非螺旋区位于或接近所述肽接头分子的氨基末端。

7.如权利要求5所述的多肽，其中所述柔性非螺旋区位于或接近所述肽接头分子的羧基末端。

8.如权利要求5所述的多肽，其中所述柔性非螺旋区位于或接近所述肽接头分子的氨基和羧基末端。

9.如权利要求5-8中任一项所述的多肽，其中所述柔性非螺旋区与至少一个所述结合结构域相邻。

10.如权利要求4-9中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含少于10个拷贝的EAAAK基序。

11.如权利要求4-9中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含少于5个拷贝的EAAAK基序。

12.如权利要求2-11中任一项所述的多肽，其中所述结合结构域通过由非柔性螺旋接头组成的连接分子连接。

13.如权利要求12所述的多肽，其中所述螺旋接头连接一个结合结构域的羧基末端和另一个结合结构域的氨基末端。

14.如权利要求13所述的多肽，其中所述螺旋接头在第一结合结构域的C-末端螺旋和第二结合结构域的N-末端螺旋之间是连续的，因此以基本上固定的方向刚性地连接所述两个结合结构域。

15.如权利要求1-14中任一项所述的多肽，其中所述多肽的结合结构域彼此相同或相似。

16.如权利要求15所述的多肽，其中所述多肽包含细胞因子的结合结构域，所述细胞因子选自生长激素；瘦素；红细胞生成素；促乳素；白介素(IL)IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11；IL-12的p35亚基、IL-13、IL-15；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；睫状神经营养因子(CNTF)；心脏营养素-1(CT-1)；白细胞抑制因子(LIF)；制瘤素M(OSM)；干扰素、IFNα和IFNγ，肿瘤坏死因子(TNF)α和TNFβ，及RANK配体。

17.如权利要求16所述的多肽，其中所述至少一个结构域包含生长激素结合结构域或生长激素变体。

18.如权利要求16或17所述的多肽，其中所述多肽包含生长激素或生长激素变体多肽的至少两个结合。

19.如权利要求16所述的多肽，其中所述多肽包含促乳素或促乳素变体的至少两个结合结构域。

20.如权利要求19所述的多肽，其中所述促乳素变体多肽包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在促乳素的位点第129位被修饰。

21.如权利要求20所述的多肽，其中所述修饰是氨基酸替代。

22.如权利要求21所述的多肽，其中所述替代是用精氨酸氨基酸残基取代甘氨酸氨基酸残基。

23.如权利要求19-22中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含促乳素的9至14个氨基末端的氨基酸残基的缺失。

24.如权利要求1-14中任一项所述的多肽，其中所述多肽的结合结构域彼此不相似。

25.如权利要求24所述的多肽，其中所述多肽包含第一结合结构域和第二结合结构域，所述第一结合结构域为生长激素结合结构域，所述第二结合结构域为促乳素结合结构域。

26.如权利要求24所述的多肽，其中所述多肽由生长激素结合结构域和促乳素结合结构域组成。

27.如权利要求24所述的多肽，其中所述多肽包含第一结合结构域和第二结合结构域，所述第一结合结构域为经修饰的生长激素结合结构域，所述第二结合结构域为经修饰的促乳素结合结构域。

28.如权利要求24所述的多肽，其中所述多肽由经修饰的生长激素结合结构域和经修饰的促乳素结合结构域组成。

29.如权利要求27或28所述的多肽，其中所述经修饰的生长激素结合结构域包含氨基酸位点第120位甘氨酸的氨基酸替代。

30.如权利要求29所述的多肽，其中所述修饰是用选自精氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸的氨基酸替代甘氨酸。

31.如权利要求30所述的多肽，其中所述修饰是用精氨酸氨基酸残基替代第120位甘氨酸。

32.如权利要求27-31中任一项所述的多肽，其中所述经修饰的促乳素结合结构域包括第129位甘氨酸的修饰。

33.如权利要求32所述的多肽，其中所述修饰是用精氨酸氨基酸残基替代第129位甘氨酸。

34.如权利要求28-32中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含促乳素的9至14个氨基末端的氨基酸残基的缺失。

35.如权利要求1-34中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含细胞因子受体的配体结合结构域。

36.如权利要求35所述的多肽，其中所述受体是生长激素受体。

37.如权利要求35所述的多肽，其中所述受体是促乳素受体。

38.编码权利要求1-37中任一项所述多肽的核酸分子。

39.如权利要求38所述的核酸，其中所述核酸是适于所述多肽表达的载体。

40.用权利要求38或39所述的核酸或载体转化或转染的分离细胞。

41.如权利要求40所述的分离细胞，其中所述细胞是真核细胞。

42.如权利要求40所述的分离细胞，其中所述细胞是原核细胞。

43.制备本发明的多肽的方法，所述方法包含步骤：

i)在有利于生产权利要求1-37中任一项所述的多肽的条件下生长权利要求40-42中任一项所述的细胞；及

ii)从所述细胞或其生长环境中分离所述多肽。

44.含有与第二细胞因子结合结构域连接的第一细胞因子结合结构域的多肽，其中所述多肽还包含细胞因子受体的胞外结构域。

45.如权利要求44所述的多肽，其中所述第一和第二结合结构域由柔性接头分子连接。

46.如权利要求44所述的多肽，其中所述第一和第二结合结构域由包含非柔性螺旋区的肽接头分子连接。

47.如权利要求44所述的多肽，其中所述第一和第二结合结构域由包含非柔性螺旋区和柔性非螺旋区的肽接头分子连接。

48.如权利要求44-47中任一项所述的多肽，其中所述细胞因子结合结构域是生长激素或生长激素的变体，并且所述胞外结构域是生长激素的胞外结构域。

49.编码权利要求44-48中任一项所述多肽的核酸分子。

50.如权利要求49所述的核酸分子，其中所述核酸是适于所述多肽表达的载体。

51.包含权利要求49所述核酸分子的载体。

52.权利要求1-39或44-51中任一项所述多肽或核酸分子作为药物的用途。

53.包括权利要求1-39或44-51中任一项所述多肽或核酸分子的药物组合物。

54.用权利要求49或51所述的核酸分子或载体转化或转染的分离细胞。

55.如权利要求54所述的分离细胞，其中所述细胞是真核细胞。

56.如权利要求54所述的分离细胞，其中所述细胞是原核细胞。