CN106581643B - 白介素37作为药物在治疗骨关节炎和痛风中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白介素37作为药物在治疗骨关节炎和痛风中的应用，本发明所述药物为以IL‑37蛋白作为活性成分，同时本发明公开了IL‑37、其衍生物、变异体和/或截短多肽为活性成分，或者上述物质的编码核苷酸序列为活性成分，并公开了原核、真核、哺乳类细胞表达及纯化IL‑37及其活性成分，对骨关节炎和痛风及一些自身免疫疾病的治疗作用。本发明也公开了IL‑37及其活性成分编码核苷酸序列克隆至各种表达载体，对骨关节炎和痛风进行基因治疗。该发明也包括含IL‑37的片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等对骨关节炎、痛风和一些自身免疫疾病的治疗作用。

Description

白介素37作为药物在治疗骨关节炎和痛风中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，特别是白介素 37 在制备防治骨关节炎和痛风的药物中的应用。

背景技术

骨关节炎是一种常见于中老年人导致关节疼痛和功能失常的慢性炎症性关节疾病，主要由受累关节处的宿主炎症介质驱动的关节组织异常重塑的退行性疾病，以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征。该病好发于负重较大的膝关节、髋关节、腰骶部脊柱关节以及手部指间关节等部位。从病理改变的角度来看，骨关节炎的发病涉及整个关节（关节软骨，软骨下骨，滑膜，半月板和韧带，肌肉和神经），造成关节软骨的破坏，软骨下骨的硬化，骨刺增生，韧带和半月板损伤，是一种退行性的骨性关节疾病。骨关节炎是慢性致残的主要原因，其病因尚未完全明了，对骨关节炎的治疗目前主要以消炎止痛为主，近年来作为发病特征之一的滑膜炎症成为新治疗药物的主要靶标，如抗 TNF 制剂，抗蛋白酶（ anti-MMPs ）及缓激肽 BK 阻断剂，抗 IL-6 制剂等，至今骨关节炎尚无特效疗法，仍处于对炎症及后遗症的治疗阶段。

痛风是一种因嘌呤代谢障碍，使尿酸累积在关节处而引发红、肿、热和剧烈疼痛的疾病，其发作多见于下肢关节和大拇趾关节，踝关节，膝关节等部位属于关节炎的一种。临床上认为痛风的发病是由于人体血液中高浓度的尿酸形成尿酸盐沉积在关节囊、滑囊、软骨、骨质和其他软组织中形成针状结晶，结晶体沉积在局部关节造成炎症体的过度激活，从而导致免疫系统过度敏感而造成痛风的炎症反应，故痛风亦属于炎症体疾病。炎症体疾病以没有高滴度的自身抗体和抗原特异 T 细胞的自发炎症为特征。痛风在临床上主要分为三个阶段即高尿酸血症期，痛风反复发作期和慢性痛风石性关节炎期。目前痛风的治疗以别嘌呤醇为主，别嘌醇通过抑制黄嘌呤氧化酶进而减少尿酸的合成，该药对于痛风的高尿酸血症和慢性痛风石治疗比较有效，对急性发作期痛风无效，因该品无消炎作用。对急性期病人目前主要以控制炎症为主尚无特效疗法。

骨关节炎（ OA ）滑液中的炎症介质主要来源于软骨，软骨下骨及滑膜，其中 TNFα 和 IL-1 β 作为骨关节炎发病中两个主要的细胞因子主要产生于激活的滑膜细胞，单核细胞和关节软骨中， IL-1 β 和 TNF α 通过滑膜成纤维细胞表面高滴度的 IL-1 β 受体和 TNF α 受体以自分泌的方式大量产生，促炎细胞因子 IL-6 ， IL-8 在滑膜中产生也异常增多，这些促炎细胞因子也可以通过远端扩散的方式进入滑膜液进而作用于软骨基质和软骨细胞造成关节损伤。

促炎细胞因子 IL-1 β , TNF α , IL-6, IL-8 也是炎症体疾病的主要介导者，在痛风关节炎的发病中，通过过量的尿酸结晶激活炎症体进而募集和激活 caspase-1, 激活的 Caspase-1 将 IL-1 β 前体切割加工成为功能成熟的 IL-1 β ，成熟的 IL-1 β 与细胞膜上的受体结合后或通过 NF-kb 途径进而启动促炎基因 IL-1 β , TNF α ， IL-6,IL-8 的转录和大量合成。促炎细胞因子 IL-1 β , TNF α , IL-6, IL-8 也是炎症体疾病的主要介导者，在骨关节炎及痛风患者的关节及滑膜中促炎细胞因子 IL-1 β 和 TNF α大量存在，其产生一方面可以通过滑膜成纤维细胞表面的 IL-1 β 受体和 TNF α 受体以自分泌的方式大量生成，另一方面 IL-1 β 与细胞膜上的受体结合后可以启动促炎基因IL-1 β , TNF α ,IL-6, IL-8 的转录和大量合成，在痛风患者中，过量的尿酸结晶也导致IL-1 β , TNF α , IL-6, IL-8 的大量生成，这些促炎细胞因子也可以通过远端扩散的方式进入滑膜液进而作用于软骨基质和软骨细胞造成关节损伤。 IL-37 重组蛋白对外周血和滑膜中 IL-1 β , TNF α , IL-6, IL-8 等炎性因子 mRNA 的表达有显著的抑制作用，并降低上述炎性因子在骨关节炎和痛风患者的外周血单核细胞和滑膜细胞中的表达量，从而对炎症发作引起的关节损伤起到保护作用。

IL-37 是 IL-1 家族中新发现的免疫抑制因子， IL-37 基因在胸腺，睾丸及子宫中表达，在单核细胞及树突细胞中 IL-37 亦可通过 ToIL 样受体家族的配体，及炎性因子IL-1 β , TNF 诱导而产生。 IL-37 前体蛋白合成后存在于细胞胞浆内，在炎症的刺激下，其前体通过 caspase-1 切除 N 端前肽而成为成熟的 IL-37 蛋白，成熟的 IL-37 蛋白易位进入细胞核作为转录因子抑制炎性细胞因子的产生，或者直接释放至胞外作为配体发挥抑炎作用。 IL-37 也可作为转录子调控基因的表达。 IL-37 具有五种剪接变体，其中最长的 IL-37b 含有 6 个外显子中的 5 个。目前，针对 IL-37b 的抗炎作用已有一些研究，IL-37b 在体外可以抑制系统红斑狼疮，银屑病，甲亢，视神经脊椎炎及系统性硬化，强直性脊柱炎中炎性细胞因子 IL-1 β , TNF α , IL-6, IL-17 等的产生，在动物模型的实验中也进一步证明 IL-37 在皮炎， DSS- 肠炎，肥胖诱导的炎症中起到治疗作用。这说明 IL-37 在炎症性疾病中具有抑炎作用。但作为抑炎因子的 IL-37 在骨关节炎和痛风的功能和作用至今仍无报道，骨关节炎和痛风属于顽固的炎症性疾病，目前尚无特效疗法治疗其炎症，为进一步研究开发治疗骨关节炎和痛风炎症的新药。为此我们对 IL-37 在骨关节炎和痛风中的作用和功能进行了研究。

但到目前为止，利用 IL-37 基因进行优化改造及截肽片段构建具有 IL-37 活性的重组蛋白；够将具有穿模结构构建能进入细胞内及细胞核并具 IL-37 生物活性的重组蛋白；构建能在体内具有长半衰期并具 IL-37 生物活性的重组蛋白；及上述重组具 IL-37活性重组蛋白对骨关节炎和痛风炎症及一些自身免疫性疾病如：类风湿性关节炎、多发性硬化、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的抑炎作用仍未见报道。

发明内容

本发明解决的问题是通过对 IL-37 基因进行优化改造，利用 IL-37 活性成分及其与它有效成分构建具有 IL-37 活性重组蛋白的制备方法如 : 利用优化改造后 IL-37基因基因片段构建具 IL-37 生物活性的重组蛋白且极大的增强了蛋白的表达量；研究已表明 IL-37 不但可作为配体也可作为转录子发挥抑炎作用，为了解决重组的 IL-37 能穿透细胞膜及核膜进入胞内及细胞核作为转录子发挥其抗炎作用，该课题利用 HIV -1 Tat穿模结构与优化改造后 IL-37 活性基因片段构建 IL-37-HIV Tat 融合蛋白，其不但能进入细胞浆及细胞核，且具IL-37 生物活性；我们的研究显示， IL-37 活性基因片段的重组蛋白在体内半衰期在半小时以内，为了增加重组 IL-37 蛋白在体内的半衰期时间，我们利用人 IgG1 Fc 与改造后 IL-37 基因基因片段构建融合重组蛋白，其不但能在体内具有较长半衰期并具 IL-37 生物活性。

本发明的另一个目的是提供上述具有 IL-37 活性的重组蛋白为药物在骨关节炎、痛风性关节炎及自身免疫疾病的应用。我们的实验结果显示，上述重组蛋白能有效的抑制骨关节炎、痛风性关节炎的炎症反应，提示其能对一些自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的抑炎有治疗作用。

本发明的另一个目的是，本课题所发明的 IL-37 重组蛋白可用于制备口服或者注射等相关剂型药物。

本发明具体技术方案如下：白介素 37 在制备防治骨关节炎和痛风的药物中的应用。

所述药物中的白介素 37 为重组蛋白 , 所述的重组蛋白的氨基酸序列如 SEQID NO ： 1 所示：

MSFVGENSGVKMGSEDWEKDEPQCCLEDPAGSPLEPGPSLPTMNF/VHTSPKVKNLNPKKFSIHDQDHKVLVLDSGNLIAVPDKNYIRPEIFFALASSLSSASAEKGSPILLGVSKGEFCLYCDKDKGQSHPSLQLKKEKLMKLAAQKESARRPFIFYRAQVGSWNMLESAAHPGWFICTSCNCNEPVGVTDKFENRKHIEFSFQPVCKAEMSPSEVSD ；

本发明提供的所述的重组的人IL-37 蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO ：2所示：MVHTSPKVKNLNPKKFSIHDQDHKVLVLDSGNLIAVPDKNYIRPEIFFALASSLSSASAEKGSPILLGVSKGEFCLYCDKDKGQSHPSLQLKKEKLMKLAAQKESARRPFIFYRAQVGSWNMLESAAHPGWFICTSCNCNEPVGVTDKFENRKHIEFSFQPVCKAEMSPSEVSD ；

该重组蛋白可明显抑制骨关节炎及痛风性关节滑膜细胞炎性因子的表达。

本发明提供的具 IL-37 活性的重组的人 IL-37-HIV1 Tat 融合蛋白的氨末端为HIV -1 Tat 穿模结构，羧末端为人 IL-37 活性部分，两者之间有一中间肽连接，氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示： MYVRKKRRQRRRAPSGGSGSGGGGEFVRVHTSPKVKNLNPKKFSIHDQDHKVLVLDSGNLIAVPDKNYIRPEIFFALASSLSSASAEKGSPILLGVSKGEFCLYCDKDKGQSHPSLQLKKEKLMKLAAQKESARRPFIFYRAQVGSWNMLESAAHPGWFICTSCNCNEPVGVTDKFENRKHIE FSFQPVCKAEMSPSEVSD ；

该重组蛋白穿过细胞膜进入巨噬细胞浆并进入细胞核。可明显抑制骨关节炎及痛风性关节滑膜细胞炎性因子的表达。

本发明提供的重组的人 IL-37-Fc 融合蛋白是重组蛋白的氨末端为 IL-37 活性部分，羧末端为人 IgG1 Fc 包括铰链 CH2 和 CH3 部分，氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 4所示： MYVRKKRRQRRSGGSGSGGGGEFVRSRVHTSPKVKNLNPKKFSIHDQDHKVLVLDSGNLIAVPDKNYIRPEIFFALASSLSSASAEKGSPILLGVSKGEFCLYCDKDKGQSHPSLQLKKEKLMKLAAQKESARRPFIFYRAQVGSWNMLESAAHPGWFICTSCNCNEPVGVTDKFENRKHIEFSFQPVCKAEMSPSEVSDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPEN YKTTPPVLDSDGSFFLYSK TVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHY TQKSLSLSP GK ；

该重组蛋白能可明显抑制骨关节炎及痛风性关节滑膜细胞炎性因子的表达，与 2相比在动物体内具有较长的半衰期。

作为本发明的进一步改进：具有 IL-37 活性的重组蛋白的制备方法，其特征是：包括如如下步骤：

（ 1 ）设计得到 SEQ ID NO ： 3 、 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 任一项所述的核苷酸序列；

（ 2 ）构建 SEQ ID NO ： 3 、 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 任一项所述的核苷酸序列表达系统，包括构建表达载体并将表达载体转入宿主细胞，形成可表达如权利4-6 任一项所述的具有 IL-37 活性的重组蛋白；

（ 3 ）培养 SEQ ID NO ： 3 、 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 任一项所述的核苷酸序列表达系统的重组细胞，使其表达目的蛋白；

（ 4 ）分离纯化 SEQ ID NO ： 3 、 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 任一项所述的具有 IL-37 活性的重组蛋白。

第一步：所述的 IL-37 重组蛋白是通过下列方法制备得到的：将编码白介素 37(IL-37) 具有活性成分的基因片段或 IL-37-HIV1 Tat 融合蛋白连入原核表达载体pET28a 得到重组表达载体，将所述重组表达载体转染大肠杆菌，所使用菌株为 E.coliTransetta DE3 ，筛选得到阳性克隆菌；大量培养所述阳性克隆菌，异丙基 - β -D- 硫代吡喃半乳糖苷诱导 IL-37 蛋白的表达；超声破碎，凝胶过滤和亲分离纯化得 95% 纯度的IL-37 重组蛋白。本发明运用原核细胞表达了权利要求 2 的 IL-37 重组蛋白，并具有较强的生物学活性，后续可以使用该方法大量表达 IL-37 用于制备药物。

第二步：所述的人 IL-37-HIV1 Tat 融合蛋白是通过下列方法制备得到的：首先将将 IL-37 具有活性成分的编码基因片段与 HIV -1 Tat 穿模结构域基因片段（ 49-59Tat 的氨基酸序列）相连接，该融合蛋白的氨末端为 HIV -1 Tat 穿模结构，羧末端为人IL-37 活性部分，两者之间有一中间肽连接，然后将 IL-37-HIV1 Tat 融合基因片段连入原核表达载体 pET28a 得到重组表达载体；将所述重组表达载体转染大肠杆菌，所使用菌株为 E.coli Transetta DE3 ，筛选得到阳性克隆菌；大量培养所述阳性克隆菌，诱导物异丙基 - β -D- 硫代吡喃半乳糖苷诱导 IL-37 的表达；超声破碎，凝胶过滤和亲和层析分离纯化得 95% 纯度的白细胞介素 37 重组融合蛋白。本发明运用原核细胞表达了权利要求 3 的 IL-37-HIV1 Tat 融合蛋白，并具生物学活性，后续可以使用该方法大量表达 IL-37-HIV1 Tat 融合蛋白以用于药物制备。

第三步：所述的人 IL-37-Fc 融合蛋白是通过下列方法制备得到的：首先将将IL-37 具有活性成分的基因片段与 IgG1 Fc （铰链区、 CH2 和 CH3 ）的基因片段相连接，该融合蛋白的氨末端为 IL-37 活性编码基因部分，羧末端为人 IgG1 Fc 铰链区、 CH2 和CH3 部分，然后将 IL-37-Fc 融合基因片段连入真核核表达载体 pPIC9K 得到重组表达载体；将 AatII 将其线性化，然后通过电穿孔导入毕赤酵母菌株 GS115 ，通过免疫印迹检测FC 的表达来筛选阳性克隆；大量培养所述阳性克隆酵母，并用甲醇诱导 IL-37-Fc 的表达；超声破碎，亲和层析分离纯化和 S200 凝胶过滤纯化去除降解的融合重组 IL-37-Fc蛋白。本发明运用真核细胞表达了权利要求 4 的 IL-37-Fc 融合重组蛋白，具有很强的生物学活性。

作为本发明的进一步改进：所述表达的系统为原核表达系统为真核表达系统，所述原核表达系统选自大肠杆菌表达系统；所述真核表达系统为酵母表达系统。

具有 IL-37 活性的重组蛋白制备药物，应用于骨关节炎、痛风及自身免疫疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的治疗。

具有 IL-37 活性的基因制备药物，应用于骨关节炎、痛风及某些自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的治疗。

作为本发明的进一步改进：所述药物服用方法是口服或非经肠胃形式服用。

作为本发明的进一步改进：所述非经肠胃形式服用方法包括局部、关节腔、动脉、肌肉内、皮下、骨髓内、囊内、心室内、静脉、腹膜内、粘膜或鼻腔注射。

作为本发明的进一步改进：所述药物的制药方式为片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、滴丸，注射剂，粉针剂或喷雾剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明对 IL-37 基因进行改造，成功地运用原核和真核细胞表达了具 IL-37 生物活性的基因片段：与 HIV1 Tat 构建成融合蛋白使其能穿模进入细胞浆和细胞核，与 IgG1 Fc 构建成融合蛋白使其能具有较长的半衰期，且具有很强的生物学活性，后续可以使用该方法大量表达具 IL-37 生物活性的重组蛋白用于药物制备。

本发明将成功表达的具 IL-37 生物活性的重组蛋白对骨关节炎和痛风的炎症细胞进行体外试验，结果显示具 IL-37 生物活性的重组蛋白对外周血 PBMC 和滑膜成纤维细胞中 IL-1 β , TNF α , IL-6,IL-8 ， CXCL8 等炎性因子表达有显著的抑制作用。

本发明对 IL-37 进行临床体外实验，结果显示具 IL-37 生物活性的重组蛋白不仅在骨关节炎及痛风关节炎中的外周血及滑膜中呈现高表达，而且具 IL-37 生物活性的重组蛋白可以明显抑制骨关节炎及痛风患者中的外周血单核细胞中炎性细胞因子 IL-1 β, TNF α , IL- 6,IL-8 ， CXCL8 的转录和表达水平，并能降低骨关节炎及痛风患者滑膜细胞及滑膜液中上述炎性因子 mRNA 和蛋白的表达量。因此，具 IL-37 生物活性的重组蛋白对骨关节炎及痛风的炎症有显著抑炎作用，进而减轻炎性因子对患者滑膜和软骨的破坏，特别是对关节损伤具有很好的保护作用，可作为治疗骨关节炎和痛风炎症的药物。

尽管 IL-37 在骨关节炎和痛风及自身免疫疾病的研究已有报道，但利用改造后IL-37 活性基因片段表达具 IL-37 生物活性的重组蛋白，及其与 HIV1 Tat 构建成融合蛋白使其能穿模进入细胞，与与 IgG1 Fc 构建成融合蛋白使其在体内能具有较长的半衰期等重组蛋白，对骨关节炎和痛风及自身免疫疾病炎症的治疗作用到目前为止尚未见报道。

尽管已有 IL-37 对类风湿性关节炎、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的抑制已有报道，但利用 IL-37 活性片段及其与HIV1 Tat 或 IgG1 Fc 构建的具 IL-37 生物活性的重组蛋白对上述自身免疫疾病炎症的抑制作用也尚未见报道。

本专利与目前 IL-37 在骨关节炎及痛风研究的明显和实质上的进步在于：本发明成功的利用 IL-37 活性成分，及其与它有效成分构建具有 IL-37 活性的重组蛋白如 :将改造后的 IL-37 基因基因片段构建具 IL-37 生物活性的重组蛋白，并能大量在原核细胞表达；利用 HIV -1 Tat 穿模结构与 IL-37 基因基因片段构建能进入细胞并具 IL-37生物活性的重组蛋白；利用人 IgG1 Fc 与 IL-37 基因基因片段构建能在体内具有长半衰期并具 IL-37 生物活性的重组蛋白。

利用上述具有 IL-37 生物活性的重组蛋白对 IL-37 在骨关节炎炎症中的调节进行了研究；结果显示，具 IL-37 生物活性的重组蛋白能显著抑制骨关节炎的炎症反应，指出了 IL- 37 对骨关节炎具有治疗作用。利用了本实验室制备的具有 IL-37 生物活性的重组蛋白研究 IL-37 对痛风炎症的作用；结果显示该重组蛋白能显著抑制痛风的炎症反应，指出了 IL-37 重组蛋白能作为药物对痛风的炎症进行治疗。

我们的研究结果提示，我们所构建的上述 3 种含 IL-37 活性基因片段的重组蛋白对自身免疫疾病疾病如：类风湿性关节炎、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症具有治疗的作用。

附图说明

图 1. IL-37 的 PCR 产物电泳检测结果图： A 图 . 纵坐标：标准分子量的 DNAMarker ： 100-5000 ；横坐标： 1-2 泳道为从 cDNA 中克隆的 IL-37-HIV1 Tat 阳性产物， 3-4 泳道为从 cDNA 中克隆的 IL-37 基因活性片段阳性产物， B 图 . 纵坐标 : 标准分子量的 DNA Marker ： 100-5000 ；横坐标： 1-2 泳道为 IL-37-Fc 阳性产物。

图 2. 重组 IL-37 蛋白纯化结果图：纵坐标：标准分子量蛋白 Marker ； A 图：横坐标： 1 ， 2 分别为上样纯化后的 IL-37 基因片段表达的活性蛋白产物， 3 为阴性对比； B 图1 ， 5 分别为上样纯化后的 IL-37-HIV1 Tat 融合阳性基因活性片段表达的蛋白产物， 6 为未纯化表达的菌液； C 图 4 分为上样纯化后的 IL-37-IgG1 FC 融合阳性基因片段表达的蛋白产物， 6 为未纯化表达的菌液；结果显示纯化效果良好。

图 3. IL-37-IgG1 FC 融合重组蛋白的药代动力学研究结果：用纯化 IL-37-FC融合

组蛋白在 SD 大鼠中做单个剂量（ 10ug/kg ）尾静脉注射。血液样本被收集在 0， 0.5,1,2,6,24,48,72,96 小时；血清 IL-37 的水平由 IL-37 ELISA 试剂盒所测量。纵坐标： IL- 37-FC 小鼠血清的含量（ ng/ml ） , 横坐标：检测血清中 IL-37-FC 重组蛋白的时间，结果显示与 IL-37 重组蛋白相比， IL-37-FC 在血清中具有较长的半衰期（ IL-37 ： IL-37-FC 为 0.5 小时 :48 小时）。

图 4. IL-37-HIV1 Tat 融合重组蛋白穿模效果的测试：在培养的巨噬细胞加入IL-37- HIV1 Tat 融合重组蛋白， FITC （绿）为 F4/80 ， PE （红）为 IL-37 ，结果显示IL-37-HIV1 Tat 融合重组蛋白能穿膜进入细胞内并大部聚集在细胞核内。

图 5. IL-37 基因和蛋白的表达水平增加在骨关节炎患者，特别是在疾病活跃的骨关节炎患者：骨关节炎患者和健康对照组静脉血液样本（ 6 毫升）收集在深圳市人民医院，并在三小时内处理。离心分离血清，外周血单个核细胞由 FicoIL-Paque 密度梯度离心进行分离，从活跃的骨关节炎患者分离滑膜细胞和和滑膜液；分别在 PBMC 和滑膜细胞中提取总 RNA ，进行 cDNA 合成，半定量实时 PCR 和 ELISA 分别检测 PBMC 和滑膜细胞IL-37 mRNA 及血清和滑膜液 IL-37 蛋白含量，用看家基因 GAPDH 标准化；。纵坐标： A图为外周血 PBMC IL-37 mRNA 的相对表达量， B 图为外周血清 IL-37 蛋白的表达量， C图分别为滑膜细胞 IL-37 mRNA 及滑膜液 IL-37 蛋白的相对表达量；横坐标： A 和 B 图依次表示骨关节炎患者组，健康对照组，静止期骨关节炎患者组，活动期骨关节炎患者组，C 图依次为膜细胞和和滑膜液。

图 6. IL-37 的表达量与骨关节炎 WOMAC 评分和临床参数之间的关联性：将参加本实验骨关节炎患者的 WOMAC 评分和 BMI ，身体质量指数， CRP, C- 反应蛋白与 IL-37 在患者的表达水平进行相关性比较。纵坐标： A 图 WOMAC ， B 图 BMI ； C 图为 CRP；横坐标：均为 IL-37 蛋白的水平。

图 7. 炎性细胞因子和基质金属蛋白酶 3 在骨关节炎患者的表达水平：在深圳市人民医院收集骨关节炎患者和健康对照组静脉血液样本，分离血清及外周血单个核细胞，提取总 RNA ，进行 cDNA 合成，半定量实时 PCR 和 ELISA 分别检测 PBMC 和血清IL-37 mRNA 和蛋白含量， GAPDH 作为内参。

纵坐标： A 和 E 图为 TNF α ， B 和 F 图为 IL-1 β ， C 和 G 图为 CXCL8 ，D 和 H 图为 MMP3 ， A 、 B 、 C 和 D 图均为所标 mRNA 相对表达量， E 、 F 、 G 和 H为所标血清蛋白相对表达量；横坐标： A 、 B 、 C 、 D 、 E 、 F 、 G 和 H 均依次为骨关节炎患者和健康对照组。

图 8. IL-37 水平与骨关节炎性因子表达的相关性：在深圳市人民医院收集骨关节炎患者静脉血液样本，分离血清， ELISA 分别检测血清 IL-37 、 TNF α 、 IL-1 β 、CXCL8 和蛋白含量， GAPDH 作为内参。纵坐标： A 图为 TNF α ， B 图为 IL-1 β ， C 图为 CXCL8 ， D 图为 MMP3 ，横坐标： A 、 B 、 C 、和 D 均为 IL-37 蛋白表达量。

图 9. 体外 IL-37 重组蛋白抑制骨关节炎患者外周血单核细胞炎性因子的表达： IL- 37 重组蛋白是我们实验室所制备 [ 见图１和２ ] 。从骨关节炎患者和健康对照者分离 PBMCs ，培养并用加入重组的 IL-37 然后用 LPS 刺激，收集细胞和培养上清，分别用 RT - PCR 和 ELISA 分析 IL-37 对炎性介质表达的影响。

纵坐标： A 和 E 图为 TNF α ， B 和 F 图为 IL-1 β ， C 和 G 图为 CXCL8 ，D 和 H 图为 MMP3 ， A 、 B 、 C 和 D 图均为所标 mRNA 相对表达量， E 、 F 、 G 和 H图均为所标血清蛋白相对表达量；横坐标： A 、 B 、 C 、 D 、 E 、 F 、 G 和 H 均依次为未用 IL-37 刺激的骨关节炎患者、用 IL-37 刺激的骨关节炎患者、未用 IL-37 刺激的健康对照者、用 IL-37 刺激的健康对照者的 PBMCs 。

图 10. 体外 IL-37 重组蛋白抑制骨关节炎患者滑膜细胞炎性因子的表达： IL-37 重组蛋白由我们实验室所制备 [ 见图１和２ ] 。从骨关节炎患者分离滑膜细胞，培养并用重组的 IL-37 然后用 LPS 进行刺激，收集细胞和培养上清，分别用 RT -PCR 和 ELISA分析 IL-37 对炎性介质表达的影响， *P<0.05 表示显著差异。

纵坐标： A 图为 mRNA 相对表达量， B 图为蛋白相对表达量；横坐标： A 和 B图依次均为 TNF α 、 IL-1 β 、 CXCL8 和 MMP3 。

图 11. IL-37 ， IL-37HIV Tat 和 IL-37FC 重组蛋白对骨关节炎患者外周血白细胞炎性因子 TNF α 表达的作用：从骨关节炎患者分离 PBMCs ，培养并分别加入 5 nmol重组的 IL- 37 ， IL-37HIV Tat 和 IL-37FC 重组蛋白刺激 12 小时 , 然后用 1ug/ml的 LPS 刺激 5 小时刺激，收集细胞和培养上清，用 RT -PCR 分析 IL-37 对炎性介质TNF α 表达的影响。

纵坐标：为相对 TNF α mRNA 的表达量，横坐标：分别为 IL-37 ， IL-37HIV Tat和 IL-37FC 重组蛋白对骨关节炎患者外周血白细胞处理组。图 12. IL-37 基因和蛋白在痛风患者和健康对照者的表达水平：从深圳市人民医院收集痛风患者和健康对照组静脉血液样本，并在三小时内处理。离心分离血清，外周血单个核细胞由 FicoIL-Paque 密度梯度离心进行分离；在 PBMC 提取总 RNA ，进行 cDNA 合成，半定量实时 PCR 和 ELISA 分别检测 PBMC IL -37 mRNA 和血清 IL-37 蛋白含量， GAPDH 作为内参。纵坐标： A 图为外周血 PBMC IL-37 mRNA 的相对表达量， B 图为外周血清 IL-37 蛋白的相对表达量；横坐标： A 和 B 图依次表示痛风患者组，健康对照组。

图 13. 检查 IL-37 mRNA 和蛋白在活动性、静止性痛风患者和健康对照者及痛风患者伴随有和没有伴随痛风石的表达水平：样本收集与图 5 一样。纵坐标： A 和 C 图为外周血清 IL-37 蛋白的表达量， B 图为外周血 PBMC IL-37 mRNA 的相对表达量；横坐标： A 和 B 图依次表示活动期痛风关节炎患者，静止期痛风关节炎患者组，健康对照组；Ｃ图依次表示痛风关节患者炎伴有痛风石和没有伴有痛风石。

图 14. IL-37 的水平与痛风临床表现的关联性：收集参加本实验痛风患者的临床参数： BMI 、 UA 和 CRP 并与 IL-37 在患者的表达水平进行相关性比较。纵坐标： A图 BMI ， B 图 UA ； C 图为 CRP ；横坐标：均为 IL-37 蛋白的水平。

图 15. 检测炎性细胞因子在痛风患者和健康对照组的表达水平：从深圳市人民医院收集痛风患者和健康对照组静脉血液样本，分离血清及外周血单个核细胞，提取总RNA ，进行 cDNA 合成，半定量实时 PCR 和 ELISA 分别检测 PBMC 和血清 mRNA 和蛋白含量， GAPDH 作为内参。纵坐标： A 和 D 图为 IL-1 β ， B 和 E 图为 IL-6 ， C 和 F图为 TNF α ； A 、 B 和 C 图均为所标 mRNA 相对表达量， D 、 E 和 F 为所标血清蛋白表达量；横坐标： A 、 B 、 C 、 D 、 E 和 F 均依次为痛风患者和健康对照组。

图 16. IL-37 与痛风性性关节炎性因子的相关性：在深圳市人民医院收集骨关节炎患者静脉血液样本，分离血清， ELISA 分别检测血清 IL-37 与骨关节炎性因子 IL-1β 、 IL-6 TNF α 的相关性， GAPDH 作为内参。纵坐标： A 图为 TNF α ， B 图为 IL-1 β， C 图为 CXCL8 ，横坐标： A 、 B 、 C 均为 IL-37 蛋白表达量。

图 17. IL-37 重组蛋白对痛风患者炎性因子表达的作用： IL-37 重组蛋白由我们实验室所制备 [ 见图１和２ ] 。从痛风患者和健康对照者分离 PBMCs ，培养并用加入重组的 IL- 37 然后用 LPS 刺激，收集细胞和培养上清，提取总 RNA ，进行 cDNA 合成，分别用 RT - PCR 和 ELISA 分析 IL-37 对痛风炎性介质表达的影响。

纵坐标： A 和 D 图为 IL-1 β ， B 和 E 图为 IL-6 ， C 和 F 图为 TNF α ， A、 B 和 C 图均为所标 mRNA 相对表达量， D 、 E 和 F 图均为所标血清蛋白表达量；横坐标： A 、 B 、 C 、 D 、 E 和 F 均依次为未用 IL-37 刺激的骨关节炎患者、用 IL-37 刺激的骨关节炎患者、未用 IL-37 刺激的健康对照者、用 IL-37 刺激的健康对照者组。

图 18. IL-37 重组蛋白对痛风患者滑膜细胞炎性因子水平的调节： IL-37 重组蛋白为我们实验室所制备 [ 见图１和２ ] 。从骨关节炎患者分离滑膜细胞，培养并用重组的 IL-37 然后用 LPS 刺激，收集细胞和培养上清，提取总 RNA ，进行 cDNA 合成，分别用RT -PCR 和 ELISA 分析 IL-37 对炎性介质表达的影响。

纵坐标： A 图为 mRNA 相对表达量， B 图为蛋白表达量；横坐标： A 和 B 图依次均为、 IL-1 β 、 IL-6 、 TNF α 。

图 19. IL-37 ， IL-37HIV Tat 和 IL-37FC 重组蛋白对痛风关节炎患者外周血白细胞炎性因子 IL-1 表达的作用：从骨关节炎患者分离 PBMCs ，培养并分别加入 5nmol 重组的 IL- 37 ， IL-37HIV Tat 和 IL-37FC 重组蛋白刺激 12 小时 , 然后用1ug/ml 的 LPS 刺激 5 小时，收集细胞和培养上清，用 RT -PCR 分析 IL-37 对炎性介质TNF α 表达的影响。

纵坐标：为相对 IL-1 mRNA 的表达量，横坐标：分别为 IL-37 ， IL-37HIV Tat和 IL- 37FC 重组蛋白对痛风关节炎患者外周血白细胞处理组。

具体实施方式

现结合附图 1 至 17 说明与实施例对本发明进一步说明，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 《 分子克隆实验指南 》 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

本发明实施方案所用到的主要仪器有：超纯水系统（ Classic DI ， ELGA ，英国），超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司，中国），二氧化碳培养箱（ Thermo Froma ，美国），电泳仪（ BIO-RAD ，美国），荧光定量 PCR 仪（ 7500fast ， Applied Biosystem ，美国），荧光显微镜（ Olympus ，日本），离心机（ Thermo Scientific ，德国）， PCR 扩增仪（ BIO-RAD ，美国），转膜仪（ BIO-RAD ，美国），凝胶成像系统（ Carestream ，美国），加样器（ Eppendorf ，德国），水平电泳槽（ BIO-RAD ，美国）， Westen blot 垂直电泳槽（ BIO-RAD ，美国）， -80 ℃ 冰箱（ SANYO ，日本）， 4-20 ℃ 冰箱（海尔，中国），电子分析天平（ALC-210.3 ，赛多利斯，中国），酶标仪（ Epoch ， BIOTEK ，美国）。

实施例一、 IL-37 编码基因的克隆及重组质粒 pET28a-IL-37 、 pET28a-IL-37HIV1Tat 和pPIC9K-IL-37-FC 的构建：

实验材料来源

质粒和菌种：原核表达载体为质粒 pET -28a 、 pPIC9K 购于 Invitrogen 公司；所使用菌种大肠杆菌 E.coli Trans T1 克隆菌、 E.coli Transetta (DE3) 均购于北京全式金生物技术有限公司，毕赤酵母 GS115 购于 Invitrogen 公司。

主要试剂和工具酶：质粒 DNA 小量提取试剂盒和 DNA 胶纯化试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司； Taq 酶、 DNA marker 购于北京全式金生物技术有限公司；蛋白 Marker 购于 Fermentas 公司；限制性内切酶和 T4 连接酶均购于 Takara 公司。

实验过程及结果： IL-37 基因的改造及融合基因的构建：根据生物遗传信息学对IL-37 编码基因进行优化改造，详见实验结果图 1A （比较的基因序列中，上为原始的 IL-37 序列，下为优化改造后的 IL-37 序列）将建改造后的 IL-37 活性基因片段的核苷酸序列进行合成，在 5 ’端加限制性内切酶 BamH1 位点，图 1B 。

将 HIV1 Tat 含穿膜结构域氨基酸 49-59 的核苷酸及连接肽的序列（见图 2A ）在氨端和 IL-37 活性基因片段的核苷酸序列（图 1 B ）在羧端的核苷酸序列合成得 IL-37-HIV1Tat ，在 5 ’端加限制性内切酶 BamH1 位点，详见见图 2 B ；

将 IL-37 活性基因片段（见图 1B ）在氨端和 IgG1FC 段的核苷酸序列在羧端，的核苷酸序列合成得 IL-37-FC ，在 5 ’端加限制性内切酶 SnaB1 位点；

IL-37 基因表达载体的构建和扩增：将合成 IL-37 ， IL-37-HIV1Tat 和 IL-37-FC 的基因用 DNA 连接酶在 16 ℃ 进行连接反应，连接到 T 载体，用氯化钙法将所要克隆的基因产物转化 E.coli Trans T1 克隆菌，在含氨苄青霉素的 LB 平板进行筛选，挑取阳性菌落 ( 含重组质粒载体，进行扩增，提取质粒， IL-37 和 IL-37-HIV1 Tat 用限制性内切酶 BamH1 和 Sal1 ，而 IL-37- FC 用限制性内切酶 SnaB 1 和 Not1 进行酶切。所得产物琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离纯化，（详见图 1 ）并测序验证核苷酸序列。

实施例二、 IL-37 重组蛋白的制备 :

重组质粒 pET28a-IL-37 ，重组质粒 pET28a-IL-37-HIV1 Tat ，重组质粒pPIC9K-IL-37-FC 的构建：限制性内切酶从 IL-37 ， IL-37-HIV1Tat 和 IL-37-FC 的 T载体分别进行双酶切反应（ IL-37 和 IL-37-HIV1Tat T 载体用内切酶 BamH1 和 Sal1 ；IL-37-FC T 载体用内切酶 SnaB 1 和 Not1 ），分别回收酶切产物 IL-37 ， IL-37-HIV1Tat 和 IL-37-FC 基因片段；

质粒 pET28a 用内切酶 BamH1 和 Sal1 而 pPIC9K 质粒用内切酶 SnaB 1 和Not1 进行酶切；

琼脂糖凝胶电泳分离 ,DNA 分离柱进行纯化。

将纯化的 IL-37 和 IL-37-HIV1Tat 产物，和酶切后 pET28a ，及 IL-37-FC 基因片段与酶切后 pPIC9K 用 DNA 连接酶在 16 ℃ 进行连接反应。

重组蛋白 IL-37 的表达： pET28a-IL-37 pET28a-IL-37-HIVTat

重组蛋白的表达：将连接后的 pET28a-IL-37 pET28a-IL-37-HIVTat 的重组质粒分别转化 E.coli Transetta (DE3) ，挑取单菌落培养过夜，按 1% 比例接种于 LB 培养基，加异丙基 - β -D- 硫代吡喃半乳糖苷（ IPTG ）诱导 IL-37 的表达， pPIC9K-IL37-FC的重组蛋白的表达： Sac Ⅰ 限制性内切酶将 pPIC9K-IL37-FC 重组质粒线性化，将其电转化到毕赤酵母 GS115 感受态细胞，将已被转染的毕赤酵母 GS115 感受态细胞涂布在 MD培养基平板，除了组氨酸营养筛选外，还用不同浓度 G418 进行筛选，挑选在 G418 高浓度的单克隆菌落，进行 PCR 鉴定，获得多拷贝重组菌。重组 GS115-pPIC9K-IL37-FC 用甲醇诱导 IL-37-FC 表达。

IL-37 蛋白的表达验证和纯化：诱导表达后收集菌体，离心破碎，盐析、透析、分子筛、离子交换层析等多个步骤。将纯化的蛋白上样电泳，电泳结束后，凝胶经染色、脱色后采用凝胶成像系统拍照并进行图像分析，若电泳能检测到特异性的与目的蛋白大小相符的蛋白条带出现，且对照没有该条带，则说明菌体表达了目的重组蛋。 SDS-SDS-PAGE 胶电泳显示得纯化的 IL-37 蛋白（图 2 A 、 B 和 C ），图 2 A 为 IL-37 活性片段重组蛋白，图 2B 为 IL-37-HIV1 Tat 重组蛋白，图 2 C 为 IL-37-FC 重组蛋白，结果显示，我们不但成功的表达了 IL-37 ， IL-37-HIV1Tat 和 IL-37-FC 重组蛋白，其纯化的纯度在 95% 左右。

Brandford 法测定蛋白浓度，将纯度达到 95% 以上的管合并，并进行真空冷冻干燥，得到 IL-37 蛋白冻干粉末。保存于 -20 ℃ 备用。

重组 IL-37 活性基因片段重组蛋白与 IL-37-IL-37-Fc 在体内血循环半衰期的比较：用纯化 IL-37 和 IL-37-FC 融合重组蛋白在 SD 大鼠中做单个剂量（ IL-37 10ug/kg ； IL-37-FC 24.810ug/kg ）尾静脉注射。血液样本被收集在 0 ， 0.5,1,2,6,24,48,72,96 小时； IL-37 ELISA 试剂盒测量血清 IL-37 的水平。 IL-37 和 IL-37-IgG1 FC融合重组蛋白的体内药代动力学研究结果如图 3 显示，与 IL-37 重组蛋白相比， IL-37-FC 在血清中具有较长的半衰期（ IL-37 ： IL-37-FC 为 0.5 小时 :48 小时） ；

IL-37-HIV1 Tat 融合重组蛋白穿模效果测试：培养 THP1 巨噬细胞，加入 IL-37-HIV1 Tat 融合重组蛋白，用抗 F4/80-FITC （绿），抗 IL-37-PE （红）进行组化免疫荧光检测，结果如图 4 显示 IL-37-HIV1 Tat 融合重组蛋白能穿膜进入细胞内并聚集在细胞核内。

实施例三、患者外周血单核细胞和滑膜细胞的分离，并对 IL-37 及相关炎性细胞因子蛋白的检测及 IL-37 与临床表现和炎性因子相关性的分析。

实验材料来源：本研究所用骨关节炎和痛风患者全血及滑膜样本均来自深圳市人民医院。

实验过程：全血的采集和外周血单核细胞的分离：骨关节炎和痛风患者全血使用肝素抗凝管采集后用于检测临床指标，经患者同意在检测后 3 小时送至实验室分离外周血单核细胞，用 Ficoll- Paque 浓度梯队离心法对外周血单核细胞进行分离。

滑膜组织的取用及滑膜细胞的分离：深圳市人民医院在骨关节炎及痛风患者手术时获取滑膜组织，于病理检测使用后经病人同意用于科研。通过洗涤、剪切、胶原酶消化然后再用胰蛋白酶消化、尼龙网过滤，离心后收集细胞，在 37 ℃ 培养箱中培养 24h ，弃去未粘附细胞，得贴壁细胞为原代滑膜细胞。

细胞总 RNA 的提取：收集患者 PBMC 细胞或滑膜细胞利用 Trizol 法对 mRNA进行提取。

RNA 反转录为 cDNA ：检测 RNA 的纯度和浓度，将不同管的 RNA 浓度调为一致，按照 ScriptTM cDNA Synthesis kit 操作说明书加入反转录酶及通用引物，将 RNA 逆转录成 cDNA 。RT -PCR 引物的设计：从 Genbank 里查找骨关节炎人相关的炎性细胞因子的基因及内参基因的 mRNA 序列，引物列表如下：

表 5 骨关节炎患者和健康对照检测的基因引物序列列表：

从 Genbank 里查找痛风人相关的炎性细胞因子的基因及内参基因的 mRNA 序列，利用软件 Primer 5.0 设计相关引物，引物列表如下：

表 6 痛风患者和健康对照检测的基因引物序列列表

上述引物由上海生物工程有限公司合成。

IL-37 和炎性因子 mRNA 定量检测： qPCR 检测骨关节炎、痛风患者和健康照者PBMC IL-37 和相关炎性因子 mRNA 的表达：采用 qPCR 试剂盒进行检测 , 以 GAPDH 为内参基因，对目的基因的表达进行分析。

IL-37 对炎性因子蛋白定量检测： ELISA 检测骨关节炎、痛风患者和健康对照者血清 IL-37 和相关炎性因子的蛋白水平。血清和细胞培养上清的细胞因子 IL-37 ， TNFα ， IL-1 β ， CXCL8 和 MMP3 的 ELISA 试剂盒检测从 BD bioscience 购买，检测细胞因子 IL-6 水平从 e Bioscience 购买。检测方法根据制造商的说明进行。

IL-37 与临床指标及炎性细胞因子相关性的分析：采用 Spearman 相关分析评估血清 IL-37 水平与骨关节炎和痛风的临床和实验室检查指标及炎性细胞因子的相关性。P 值小于 0.05 被认为具统计学上的显着性。

3 ．实验结果：骨关节炎

图 5. IL-37 mRNA 和蛋白水平在骨关节炎患者比健康对照组显著增高：相比之下，骨关节炎比健康对照者 IL-37 mRNA 的表达升高 2.3-3.5 倍之间，尤其是在疾病活动期患者，而在疾病在静止期则增高不显著（图 5A ）。

IL-37 血清蛋白水平在骨关节炎患者也显著高于健康对照组，与 IL-37 mRNA 水平相似， IL-37 血清蛋白水平在疾病活动期显著增高，而在疾病在静止期不显著（图 5B）。

更为重要的是，与静止骨关节炎患者相比，活动期骨关节炎患者的滑膜细胞和滑膜液中分别显示增高的 IL-37 mRNA 和血清蛋白水平（图 5C ）。

实验结果指出 IL-37 在骨关节炎的表达水平与疾病的活动度呈正相关。

图 6. 血清 IL-37 的水平与骨关节炎临床表现呈正相关：我们将 IL-37 在骨关节炎的水平与 WOMAC 评分及临床指标，如抗 SP100 ， ssa60 ， CenpB 抗体、阿尔布河、Cr 、 BUN 、 IgG 、 ESR 和 CRP ， BMI 的相关性进行了比较。

如图 1 所示，血清 IL-37 水平与 WOMAC 、 BMI 和 CRP 呈正相关。（图 6 A 、B、 C 和表 2 ）。结果进一步确证 IL-37 在骨关节炎的表达水平与疾病的活动度呈正相关。

图 7. 炎性细胞因子和基质金属蛋白酶 3 在骨关节炎患者的表达水平增高 :与正常对照组相比，骨关节炎 TNF α ， IL-1 β ， CXCL8 和 MMP3 在 PBMC 的 mRNA 和血清的蛋白水平表达上调（图 7 A 、 B 、 C 、 D 、 E 、 F 、 G 和 H ）。结果与已出版的研究一致，骨关节炎具高表达的炎性细胞因子，进一步证实 TNF α ， IL-1 β ， CXCL8 和 MMP3与骨关节炎疾病密切相关。 图 8. 骨关节炎患者血清 IL-37 的水平与骨关节炎促炎因子的水平呈正相关：

图 8 和表 2 的结果显示， IL-37 的蛋白水平与炎性细胞因子 TNF α 、 IL-1 β、 CXCL8 及 MMP3 呈正相关（图 8 A 、 B 、 C 、 D 和表 2 ），这些数据表明 IL-37 与骨关节炎的活动度呈正相关。 痛风图 12.IL-37 mRNA 和蛋白水平在痛风患者和健康对照组之间的比较：

图 12 结果显示，痛风 IL-37 mRNA 的表达比健康对照者显著增高，（图 12 A ）。

IL-37 血清蛋白水平在痛风患者也显著高于健康对照组（图 12 B ）。

图 13. 比较 IL-37 mRNA 和蛋白在活动性、静止性痛风患者和健康对照者及痛风患者伴和没有伴有痛风石患者的表达水平：与健康对照者相比，活动性痛风患者 IL-37mRNA 和蛋白的水平明显升高，而在疾病缓解期 IL-37 mRNA 和蛋白的水平则没有显著增高（图 13 A 和 B ）。

有趣的是 IL-37 蛋白水平在痛风患者伴有痛风石比痛风患者没有伴有痛风石明显升高（图 13 C ）。

实验结果指出 IL-37 的 mRNA 和蛋白水平与痛风的活动度呈正相关，尤其是痛风伴有痛风石的患者更为显著。

图 14. 血清 IL-37 的水平与痛风临床表现呈正相关：我们将 IL-37 在痛风的水平与 BMI 、 UA 和 CRP 等痛风的临床指标的相关性进行分析。

如图 14 所示，血清 IL-37 水平与 BMI 、 UA 和 CRP 呈正相关，尤其是 CRP ，图 14 A 、 B 、 C 结果进一步确证 IL-37 水平在痛风的表达水平与疾病的活动度呈正相关。

图 15. 炎性细胞因子在痛风患者的表达增高：实验结果显示，痛风 IL-1 β 、IL-6 、 TNF α 在 PBMC 的 mRNA 和血清的蛋白水平比正常对照组明显增高（图 15 A 、 B、 C 、 D 、 E 和 F ）。

该结果进一步指出炎性细胞因子介导了痛风的炎症反应图 16. 痛风患者血清炎促炎因子的水平与 IL-37 的表达呈正相关：

图 16 A 、 B 、 C 和表 5 显示痛风患者血清 IL-37 的蛋白水平与炎性细胞因子 IL-1 β 、 IL-6 、 TNF α 呈正相关，这些数据表明 IL-37 与骨关节炎的免疫炎性反应密切相关。

实施例四： IL-37 重组蛋白对骨关节炎和痛风患者炎性细胞因子转录的调节实验材料来源：深圳市人民医院采集自骨关节炎和痛风患者的外周血及滑膜组织及健康对照组的外周血。

实验过程：经实施例 3 所述方法分出外周血单核细胞和滑膜细胞：外周血单核细胞及滑膜细胞的培养：培养上述分离得到的外周血单核细胞和滑膜细胞的培养基为 RPMI1640 (Hyclone,Thermo, 美国 ) 全培养基，加 10% 胎牛血清 (Hyclone, 美国 ) 及 100IU/ml 青霉素 100 μ g/ml 链霉素 , 将上述细胞在培养基中轻轻混匀后以 1 × 10 6cells/ml 的浓度接种于 12 孔板内。

重组 IL-37 蛋白的刺激：细胞培养的第二天， IL-37 炎性因子 mRNA 定量检测和 IL- 37 炎性因子蛋白定量检测。加入 IL-37 、 IL-37-HIV1 Tat 或 IL-37-FC 重组蛋白 5 nmol/ml 进行刺激或不刺激 12 小时 , 然后 LPS1 μ g/ml 刺激 4 小时后离心收集细胞用于总 RNA 提取以检测目的基因转录水平。检测细胞培养液上清细胞因子则加入IL-37 、 IL-37-HIV1 Tat 或 IL- 37-FC 重组蛋白 5 nmol/ml 进行刺激或不刺激 24 小时 , 1 μ g/ml LPS 刺激 4 小时后离心收集细胞上清用于检测上清液中分泌的目的蛋白。

细胞总 RNA 的提取， RNA 反转录为 cDNA ， RT -PCR 引物的设计， qPCR 对炎性因子的检测和 ELISA 对 IL-37 炎性因子蛋白定量检测的实验过程请看实验实例 3 。

3. 实验结果：骨关节炎：

图 9. IL-37 重组蛋白在体外抑制骨关节炎患者外周血单核细胞炎性因子的表达 : 与对照组比较， IL-37 重组蛋白处理组 TNF α 、 IL-1 β 、 CXCL8 和 MMP3 的mRNA 和蛋白表达水平在骨关节炎患者明显降低（图 9 A 、 B 、 C 、 D 、 E 、 F 和 H ）。

实验结果显示 IL-37 能显著抑制骨关节炎相关炎性因子在骨关节炎患者 PBMC的表达，然后有趣的是 IL-37 并未能抑制健康组 PBMC 炎性因子的表达。该结果指出 IL-37 能抑制骨关节炎的炎性反应。 图 10. 体外 IL-37 重组蛋白抑制骨关节炎患者滑膜细胞炎性因子的表达 : 更为有重要的是， IL-37 重组蛋白处理组与对照组相比，处理组显著抑制了 TNF α 、 IL-1 β 、 CXCL8 和 MMP3 的 mRNA 和蛋白在骨关节炎患者关节滑膜的表达水平（图 10 A 和 B ）。

实验显示 IL-37 能显著抑制骨关节炎相关炎性因子在关节滑膜的表达，结果进一步指出 IL-37 不但能抑制骨关节炎全身的炎性反应且能下调关节局部的炎症。

图 11. IL-37 ， IL-37HIV Tat 和 IL-37FC 重组蛋白对骨关节炎患者外周血白细胞炎性因子 TNF α 表达抑制效果的比较：图 11 显示重组的 IL-37 、 IL-37HIV1 Tat和 IL-37FC 重组蛋白具对骨关节炎患者分离外周血单核细胞炎性因子 TNF α 的表达均有抑制作用，相比较 IL-37 和 IL-37-FC 对 TNF α 的抑制效果强于 IL-37HIV1 Tat ，提示 IL-37 作为配体的抑炎作用比其作为转录子的作用要强。

痛风：

图 17. IL-37 重组蛋白对痛风性关节炎患者外周血单核细胞炎性因子表达的作用：与对照组比较， IL-37 重组蛋白处理组的 IL-1 β 、 IL-6 和 TNF α 的 mRNA 和蛋白表达水平在痛风患者显著下调（图 17 A 、 B 、 C 、 D 、 E 和 F ）。

实验显示 IL-37 能显著抑制痛风相关炎性因子在 PBMC 的表达，然后 IL-37 并未能抑制健康组外周血单核细胞炎性因子 mRNA 和蛋白的表达（图 17 A 、 B 、 C 、 D 、E 和 F ）。

该结果指出 IL-37 能抑制痛风的全身炎性反应。

图 18.IL-37 重组蛋白显著抑制痛风性关节炎患者滑膜细胞炎性细胞因子的表达： IL- 37 重组蛋白刺激组与 IL-37 重组蛋白未刺激组相比，刺激组显著抑制了 IL-1β 、 IL-6 和 TNF α mRNA 和蛋白在痛风患者滑膜细胞的表达（图 18 A 和 B ）。

实验显示 IL-37 重组蛋白能显著下调痛风相关炎性因子在关节滑膜的水平，结果进一步指出 IL-37 重组蛋白不但能抑制痛风全身的炎性反应且能下调痛风性关节炎关节局部的炎症图 18. IL-37 ， IL-37HIV Tat 和 IL-37FC 重组蛋白对痛风性关节炎患者外周血白细胞炎性因子 IL-1 表达抑制效果的比较：

实验显示重组的 IL-37 、 IL-37HIV1 Tat 和 IL-37FC 重组蛋白具对骨关节炎患者分离外周血单核细胞炎性因子 TNF α 的表达均有抑制作用，相比较 IL-37 和 IL-37-FC 对 TNF α 的抑制效果强于 IL-37HIV1 Tat ，提示 IL-37 作为配体的抑炎作用比其作为转录子对痛风性关节炎的抑癌 hi 的作用要强。

实施例五、

IL-37 重组蛋白治疗骨关节炎及痛风炎症的服用方法本发明提供 IL-37 或其变异体和衍生物及相应核苷酸作为活性成分制备药物的方法，药物服用形式不限制，根据不同服用方法选择合适的形式服用及剂量。

口服形式如药片、胶囊、小颗粒、微小颗粒、粉末可用普通方法生产，如淀粉、乳糖、海藻糖、甘露醇、羧甲基纤维素钠、玉米淀粉和无机盐，也可包括适当的添加剂， IL- 37 在制备剂中分量不一，根据合适的背景应用。

非经肠胃形式如注射剂栓剂、擦剂，注射剂制备方法为：将 IL-37 融合蛋白和甘露醇溶解于适量的注射用水中，在无菌条件下过滤并分装入西林瓶中，冻干。注射方法：包括局部、关节腔、动脉、肌肉内、皮下、骨髓内、囊内、心室内、静脉、腹膜内、粘膜或鼻腔注射等，剂量根据以下因素调整，如年龄，体重，疾病程度。非经肠胃形式可用普通方法生产，IL-37 的分量在制备剂中不特别限制，根据背景调整。

IL-37 也可用已知的药物运载系统将药物送入体内，如：将 IL-37 包裹在胶囊或脂质体内 , 或使用靶向纳米颗粒服用方法。 IL-37 或被用于食物组成物的粗原料，如功能性食物和补充剂用来生产具有防止炎症疾病的食物。

本发明不但提供了利用 IL-37 重组蛋白制备对骨关节炎和痛风治疗性药物的方法，而且体外证明 IL-37 对骨关节炎及痛风及一些自身免疫疾病的炎性细胞因子有显著抑制作用，综上所述，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。本领域的普通技术人员阅读本发明文件后，根据本发明的技术方案和技术构思无需创造性脑力劳动而作出其他各种相应的变换方案，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

实验结果 IL-37 重组蛋白药物的制备列表 1. IL-37 基因的改造：列表 1 A ：原始的 IL-37 基因核苷酸的序列与改造后的含 IL-37 基因活性片段序列的比较；上列核苷酸序列为原始的 IL-37 基因核苷酸的序列，优化改造后的含 IL-37 基因活性片段在比较的下列核苷酸序列。

ATGTCCTTTGTGGGGGAGAACTCAGGAGTGAAAATGGGCTCTGAGGACTGGGAAAAAG ATGAACCCCAGTGCTGCTTAGAAGACCCGGCTGGAAGCCCCC 100

------------------------------------------------------------------100TGGAACCAGGCCCAAGCCTCCCCACCATGAATTTTGTTCACACAAGTCCAA- AGGTGAAGAACTTAAACCCGAAGAAATTCAGCATTCATGACCAGGATC 200

|||||||| ||| | | || || ||| | |||||||| |||||| || || |||||||| |

-----------------------------------GTTCACACCTCTCCGAAA-GTTAAAAACCTGAACCCGAAAAAATTCTCTATCCACGACCAGGACC 200

ACAAAGTACTGGTCCTGGACTCTGGGAATCTCATAGCAGTTCCAGATAAAAACTACATA CGCCCAGAGATCTTCTTTGCATTAGCCTCATC-CTTGAGC- 300

||||||| ||||| ||||||||||| || || || || ||||| || ||||||||||| || || || |||||||| || | || || || | || |

ACAAAGTTCTGGTTCTGGACTCTGGTAACCTGATCGCTGTTCCGGACAAAAACTACATC CGTCCGGAAATCTTCTTCGCTCTGGCTTCTTCTC-TGT-CT 300

TCAGCCTCTGCGGAGAAAGGAAGTCCGATTCTCCTGGGGGTCTCTAAAGGGGAGTTTTG TCTCTACTGTGACAAGGATAAAGGACAAAGTCATCCATCCC 400

|| || ||||| || ||||| |||||| || ||||| || |||||||| || || || || ||||| ||||| || ||||| || ||| || || |

TCTGCTTCTGCTGAAAAAGGTTCTCCGATCCTGCTGGGTGTTTCTAAAGGTGAATTCTGC CTGTACTGCGACAAAGACAAAGGTCAGTCTCACCCGTCTC 400

TTCAGCTGAAGAAGGAGAAACTGATGAAGCTGGCTGCCCAAA- AGGAATCAGCACGCCGGCCCTTCATCTTTTATAGGGCTCAGGTGGGCTCCTGGAACA 500

| |||||||| || || ||||||||||| |||||||| || | | ||||| || || || || |||||||| || | |||||||| || || |||||||

TGCAGCTGAAAAAAGAAAAACTGATGAAACTGGCTGCTCAGAAA- GAATCTGCTCGTCGTCCGTTCATCTTCTACCGTGCTCAGGTTGGTTCTTGGAACA 500

TGCTGGAGTCGGCGGCTCACCCCGGATGGTTCATCTGCACCTCCTGCAATTGTAATGAGC CTGTTGGGGTGACAGATAAATTTGAGAACAGGAAACACAT 600

||||||| || || |||||||| || ||||||||||||||||| ||||| || || || || ||||| || || || ||||| || ||| | ||||||||

TGCTGGAATCTGCTGCTCACCCGGGTTGGTTCATCTGCACCTCTTGCAACTGCAACGAA CCGGTTGGTGTTACCGACAAATTCGAAAACCGTAAACACAT 600

TGAATTTTCATTT- - CAACCAGTTTGCAAAGCTGAAATGAGCCCCAGTGAGGTCAGCGATTAGG663

||||| || | | || || |||||||||||||||||| || ||| || || ||

CGAATTCTCTT - TCCAGCCGGTTTGCAAAGCTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAAA 663

列表 1 B ：优化的 IL-37 基因片段序列：

TGGATCCATGGTTCACACCTCTCCGAAAGTTAAAAACCTGAACCCGAAAA 50

AATTCTCTATCCACGACCAGGACCACAAAGTTCTGGTTCTGGACTCTGGT 100

AACCTGATCGCTGTTCCGGACAAAAACTACATCCGTCCGGAAATCTTCTT 150

CGCTCTGGCTTCTTCTCTGTCTTCTGCTTCTGCTGAAAAAGGTTCTCCGA 200

TCCTGCTGGGTGTTTCTAAAGGTGAATTCTGCCTGTACTGCGACAAAGAC 250

AAAGGTCAGTCTCACCCGTCTCTGCAGCTGAAAAAAGAAAAACTGATGAA 300

ACTGGCTGCTCAGAAAGAATCTGCTCGTCGTCCGTTCATCTTCTACCGTG 350

CTCAGGTTGGTTCTTGGAACATGCTGGAATCTGCTGCTCACCCGGGTTGG 400

TTCATCTGCACCTCTTGCAACTGCAACGAACCGGTTGGTGTTACCGACAA 450

ATTCGAAAACCGTAAACACATCGAATTCTCTTTCCAGCCGGTTTGCAAAG 500

CTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAATGA

列表 2. IL-37-HIV1 Tat 融合基因：

A 列表含 HIV1 Tat 含穿膜结构域氨基酸 49-59 的核苷酸序列及连接肽的核苷酸序列；

B 列表含 IL-37 基因活性片段的核苷酸序列；

C 列表含 IL-37- HIV1 Tat 的核苷酸序列；

列表 2 A HIV1 Tat 含穿膜结构域氨基酸 49-59 的核苷酸序列及连接肽的核苷酸序列

TACGTAAGGAAGAAGCGGAGACAGCGAAGAAGCGGAGGATCGGGTAGCGG 50

AGGAGGAGGAGAATTCGTCCG

列表 2 B 含 IL-37-HIV1 Tat 的核苷酸序列：

TGGATCCTATGTACGTAAGGAAGAAGCGGAGACAGCGAAGAAGCGGAGGA 50

TCGGGTAGCGGGTTCACACCTCTCCGAAAGTTAAAAACCTGAACCCGAAA 100

AAATTCTCTATCCACGACCAGGACCACAAAGTTCTGGTTCTGGACTCTGG 150

TAACCTGATCGCTGTTCCGGACAAAAACTACATCCGTCCGGAAATCTTCT 200

TCGCTCTGGCTTCTTCTCTGTCTTCTGCTTCTGCTGAAAAAGGTTCTCCG 250

ATCCTGCTGGGTGTTTCTAAAGGTGAATTCTGCCTGTACTGCGACAAAGA 300

CAAAGGTCAGTCTCACCCGTCTCTGCAGCTGAAAAAAGAAAAACTGATGA 350

AACTGGCTGCTCAGAAAGAATCTGCTCGTCGTCCGTTCATCTTCTACCGT 400

GCTCAGGTTGGTTCTTGGAACATGCTGGAATCTGCTGCTCACCCGGGTTG 450

GTTCATCTGCACCTCTTGCAACTGCAACGAACCGGTTGGTGTTACCGACA 500

AATTCGAAAACCGTAAACACATCGAATTCTCTTTCCAGCCGGTTTGCAAA 550

GCTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAATTAATGA

列表 3. IL-37-FC 融合基因：

A 列表含 IgG1 FC 核苷酸序列；

B 含 IL-37-FC 核苷酸序列；

列表 2 B 中的 IL-37 基因活性片段的核苷酸序列与本列表 A 含 IgG1 FC 核苷酸序列连接， IL-37 基因活性片段在氨端， IgG1 FC 核苷酸序列在羧端；

列表 3.A ： IgG1 FC 核苷酸序列

GAACCGAAATCTTGCGACAAAACCCACACCTGCCCGCCGTGCCCGGCTCC 50

GGAACTGCTGGGTGGTCCGTCTGTTTTCCTGTTCCCGCCGAAACCGAAAG 100

ACACCCTGATGATCTCTCGTACCCCGGAAGTTACCTGCGTTGTTGTTGAC 150

GTTTCTCACGAAGACCCGGAAGTTAAATTCAACTGGTACGTTGACGGTGT 200

TGAAGTTCACAACGCTAAAACCAAACCGCGTGAAGAACAGTACAACTCTA 250

CCTACCGTGTTGTTTCTGTTCTGACCGTTCTGCACCAGGACTGGCTGAAC 300

GGTAAAGAATACAAATGCAAAGTTTCTAACAAAGCTCTGCCGGCTCCGAT 350

CGAAAAAACCATCTCTAAAGCTAAAGGTCAGCCGCGTGAACCGCAGGTTT 400

ACACCCTGCCGCCGTCTCGTGAAGAAATGACCAAAAACCAGGTTTCTCTG 450

ACCTGCCTGGTTAAAGGTTTCTACCCGTCTGACATCGCTGTTGAATGGGA 500

ATCTAACGGTCAGCCGGAAAACAACTACAAAACCACCCCGCCGGTTCTGG 550

ACTCTGACGGTTCTTTCTTCCTGTACTCTAAACTGACCGTTGACAAATCT 600

CGTTGGCAGCAGGGTAACGTTTTCTCTTGCTCTGTTATGCACGAAGCTCT 650

GCACAACCACTACACCCAGAAATCTCTGTCTCTGTCTCCGGGTAAATAA

列表 3.B ： IL-37-FC 核苷酸序列

TTACGTAATGGTTCACACCTCTCCGAAAGTTAAAAACCTGAACCCGAAAA 50

AATTCTCTATCCACGACCAGGACCACAAAGTTCTGGTTCTGGACTCTGGT 100

AACCTGATCGCTGTTCCGGACAAAAACTACATCCGTCCGGAAATCTTCTT 150

CGCTCTGGCTTCTTCTCTGTCTTCTGCTTCTGCTGAAAAAGGTTCTCCGA 200

TCCTGCTGGGTGTTTCTAAAGGTGAATTCTGCCTGTACTGCGACAAAGAC 250

AAAGGTCAGTCTCACCCGTCTCTGCAGCTGAAAAAAGAAAAACTGATGAA 300

ACTGGCTGCTCAGAAAGAATCTGCTCGTCGTCCGTTCATCTTCTACCGTG 350

CTCAGGTTGGTTCTTGGAACATGCTGGAATCTGCTGCTCACCCGGGTTGG 400

TTCATCTGCACCTCTTGCAACTGCAACGAACCGGTTGGTGTTACCGACAA 450

ATTCGAAAACCGTAAACACATCGAATTCTCTTTCCAGCCGGTTTGCAAAG 500

CTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAATGAGAACCGAAATCTTGC 550

GACAAAACCCACACCTGCCCGCCGTGCCCGGCTCCGGAACTGCTGGGTGG 600

TCCGTCTGTTTTCCTGTTCCCGCCGAAACCGAAAGACACCCTGATGATCT 650

CTCGTACCCCGGAAGTTACCTGCGTTGTTGTTGACGTTTCTCACGAAGAC 700

CCGGAAGTTAAATTCAACTGGTACGTTGACGGTGTTGAAGTTCACAACGC 750

TAAAACCAAACCGCGTGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGTGTTGTTT 800

CTGTTCTGACCGTTCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGTAAAGAATACAAA 850

TGCAAAGTTTCTAACAAAGCTCTGCCGGCTCCGATCGAAAAAACCATCTC 900

TAAAGCTAAAGGTCAGCCGCGTGAACCGCAGGTTTACACCCTGCCGCCGT 950

CTCGTGAAGAAATGACCAAAAACCAGGTTTCTCTGACCTGCCTGGTTAAA 1000

GGTTTCTACCCGTCTGACATCGCTGTTGAATGGGAATCTAACGGTCAGCC 1050

GGAAAACAACTACAAAACCACCCCGCCGGTTCTGGACTCTGACGGTTCTT 1100

TCTTCCTGTACTCTAAACTGACCGTTGACAAATCTCGTTGGCAGCAGGGT 1150

AACGTTTTCTCTTGCTCTGTTATGCACGAAGCTCTGCACAACCACTACAC 1200

CCAGAAATCTCTGTCTCTGTCTCCGGGTAAATAATGA

图 1. IL-37 的 PCR 产物电泳检测结果图

A 图：泳道 1-2 是 IL-37-HIV1-Tat,3-4shi IL-37 ；

B 图：泳道 1-2 是 IL-37-FC 克隆的基因片段。

图 2. 重组 IL-37 蛋白的纯化和免疫印迹鉴定结果

1 ， 2 泳道分别为上样纯化后的 IL-37 基因片段表达的活性蛋白产物，泳道 3为阴性对比； B 图泳道 4 ， 5 分别为上样纯化后的 IL-37-HIV1 Tat 融合阳性基因活性片段表达的蛋白产物，泳道 6 为未纯化表达的菌液； C 图泳道 7 分为上样纯化后的 IL-37-IgG1 FC 融合阳性基因片段表达的蛋白产物， 6 为未纯化表达的酵母菌液。

图 3. 重组 IL-37 活性基因片段重组蛋白与 IL-37-IL-37-Fc 在体内血循环半衰期的比较。

图 4. 重组 IL-3-HIV1tat 蛋白可进入细胞。

骨关节炎实验结果

表 1. 参与实验的骨关节炎患者和健康对照组的人口学和临床特征

表 2. LL-37 水平与骨关节炎的临床和实验室检查具相关性

表 3 . 骨关节炎患者和健康对照检测的基因引物序列列表

图 5. IL-37 mRNA 和蛋白水平在骨关节炎患者比健康对照组显著增高。

图 6. 血清 IL-37 的水平与骨关节炎临床表现密切相关。

图 7. 骨关节炎患者的炎性细胞因子在 PBMC 和血清的水平增加。

图 8. 骨关节炎患者血清 IL-37 与骨关节炎促炎因子呈正相关。

图 9. IL-37 抑制骨关节炎患者炎性介质在 PBMC 中的表达。

图 10 ． IL-37 活性基因片段重组蛋白抑制骨关节炎患者炎性介质在滑膜细胞中中的表达。

图 11. IL-37 ， IL-37HIV Tat 和 IL-37FC 重组蛋白对骨关节炎患者外周血白细胞炎性因子 TNF α 表达抑制的比较。

痛风实验结果表 4 参与实验的痛风性关节炎患者和健康对照组的人口学和临床特征

表 5 IL-37 水平与痛风性关节炎患者的临床和实验室检查具相关性

表 6 痛风性关节炎患者和健康对照检测的基因引物序列列表

图 12. 比较骨关节炎患者和健康对照组之间 IL-37 mRNA 和蛋白的水平。

图 13. 比较 IL-37 mRNA 和蛋白在活动性、静止性痛风性关节炎患者和健康对照者及痛风性关节炎患者伴和没有伴有痛风石患者的表达水平。

图 14. IL-37 的水平与痛风性关节炎临床参数之间的相关性。

图 15. 炎性细胞因子在痛风性关节炎患者的表达水平。

图 16. IL-37 与骨关节炎性因子的相关性。

图 17. IL-37 重组蛋白对痛风性关节炎患者外周血白细胞炎性因子表达的作用， Gout （痛风）， HC （健康对照）。

图 18. IL-37(IL-37/IL-HIV1-Tat/IL-37-FC) 重组蛋白对痛风性关节炎患者滑膜细胞炎性因子水平的调节。

图 19. IL-37 ， IL-37HIV Tat 和 IL-37FC 重组蛋白对痛风性关节炎患者外周血白细胞炎性因子 IL-1 表达的作用。

<210> 1

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Phe Val Gly Glu Asn Ser Gly Val Lys Met Gly Ser Glu Asp

1 5 10 15

Trp Glu Lys Asp Glu Pro Gln Cys Cys Leu Glu Asp Pro Ala Gly Ser

20 25 30

Pro Leu Glu Pro Gly Pro Ser Leu Pro Thr Met Asn Phe Val His Thr

35 40 45

Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser Ile His Asp

50 55 60

Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val

65 70 75 80

Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser

85 90 95

Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly

100 105 110

Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln

115 120 125

Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala

130 135 140

Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln

145 150 155 160

Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp Phe

165 170 175

Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val Thr Asp Lys

180 185 190

Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys Lys

195 200 205

Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp

210 215

<210> 2

<211> 174

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Val His Thr Ser Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe

1 5 10 15

Ser Ile His Asp Gln Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn

20 25 30

Leu Ile Ala Val Pro Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe

35 40 45

Ala Leu Ala Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro

50 55 60

Ile Leu Leu Gly Val Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys

65 70 75 80

Asp Lys Gly Gln Ser His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu

85 90 95

Met Lys Leu Ala Ala Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe

100 105 110

Tyr Arg Ala Gln Val Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His

115 120 125

Pro Gly Trp Phe Ile Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly

130 135 140

Val Thr Asp Lys Phe Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln

145 150 155 160

Pro Val Cys Lys Ala Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp

165 170

<210> 3

<211> 201

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Tyr Val Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Phe Val Arg Val His Thr Ser

20 25 30

Pro Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser Ile His Asp Gln

35 40 45

Asp His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val Pro

50 55 60

Asp Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser Ser

65 70 75 80

Leu Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly Val

85 90 95

Ser Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln Ser

100 105 110

His Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala Ala

115 120 125

Gln Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln Val

130 135 140

Gly Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp Phe Ile

145 150 155 160

Cys Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val Thr Asp Lys Phe

165 170 175

Glu Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys Lys Ala

180 185 190

Glu Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp

195 200

<210> 4

<211> 430

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Tyr Val Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Phe Val Arg Ser Arg Val His Thr Ser Pro

20 25 30

Lys Val Lys Asn Leu Asn Pro Lys Lys Phe Ser Ile His Asp Gln Asp

35 40 45

His Lys Val Leu Val Leu Asp Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val Pro Asp

50 55 60

Lys Asn Tyr Ile Arg Pro Glu Ile Phe Phe Ala Leu Ala Ser Ser Leu

65 70 75 80

Ser Ser Ala Ser Ala Glu Lys Gly Ser Pro Ile Leu Leu Gly Val Ser

85 90 95

Lys Gly Glu Phe Cys Leu Tyr Cys Asp Lys Asp Lys Gly Gln Ser His

100 105 110

Pro Ser Leu Gln Leu Lys Lys Glu Lys Leu Met Lys Leu Ala Ala Gln

115 120 125

Lys Glu Ser Ala Arg Arg Pro Phe Ile Phe Tyr Arg Ala Gln Val Gly

130 135 140

Ser Trp Asn Met Leu Glu Ser Ala Ala His Pro Gly Trp Phe Ile Cys

145 150 155 160

Thr Ser Cys Asn Cys Asn Glu Pro Val Gly Val Thr Asp Lys Phe Glu

165 170 175

Asn Arg Lys His Ile Glu Phe Ser Phe Gln Pro Val Cys Lys Ala Glu

180 185 190

Met Ser Pro Ser Glu Val Ser Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

195 200 205

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

210 215 220

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

225 230 235 240

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

245 250 255

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

260 265 270

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

275 280 285

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

290 295 300

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

305 310 315 320

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

370 375 380

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

385 390 395 400

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

405 410 415

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

420 425 430

<210> 5

<211> 658

<212> DNA/RNA

<213> 人

<400> 5

atgtcctttg tgggggagaa ctcaggagtg aaaatgggct ctgaggactg ggaaaaagat 60

gaaccccagt gctgcttaga agacccggct ggaagccccc tggaaccagg cccaagcctc 120

cccaccatga attttgttca cacaagtcca aaggtgaaga acttaaaccc gaagaaattc 180

agcattcatg accaggatca caaagtactg gtcctggact ctgggaatct catagcagtt 240

ccagataaaa actacatacg cccagagatc ttctttgcat tagcctcatc cttgagctca 300

gcctctgcgg agaaaggaag tccgattctc ctgggggtct ctaaagggga gttttgtctc 360

tactgtgaca aggataaagg acaaagtcat ccatcccttc agctgaagaa ggagaaactg 420

atgaagctgg ctgcccaaaa ggaatcagca cgccggccct tcatctttta tagggctcag 480

gtgggctcct ggaacatgct ggagtcggcg gctcaccccg gatggttcat ctgcacctcc 540

tgcaattgta atgagcctgt tggggtgaca gataaatttg agaacaggaa acacattgaa 600

ttttcatttc aaccagtttg caaagctgaa atgagcccca gtgaggtcag cgattagg 658

<210> 6

<211> 535

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

<400> 6

tggatccatg gttcacacct ctccgaaagt taaaaacctg aacccgaaaa aattctctat 60

ccacgaccag gaccacaaag ttctggttct ggactctggt aacctgatcg ctgttccgga 120

caaaaactac atccgtccgg aaatcttctt cgctctggct tcttctctgt cttctgcttc 180

tgctgaaaaa ggttctccga tcctgctggg tgtttctaaa ggtgaattct gcctgtactg 240

cgacaaagac aaaggtcagt ctcacccgtc tctgcagctg aaaaaagaaa aactgatgaa 300

actggctgct cagaaagaat ctgctcgtcg tccgttcatc ttctaccgtg ctcaggttgg 360

ttcttggaac atgctggaat ctgctgctca cccgggttgg ttcatctgca cctcttgcaa 420

ctgcaacgaa ccggttggtg ttaccgacaa attcgaaaac cgtaaacaca tcgaattctc 480

tttccagccg gtttgcaaag ctgaaatgtc tccgtctgaa gtttctgact aatga 535

<210> 7

<211> 71

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

<400> 7

tacgtaagga agaagcggag acagcgaaga agcggaggat cgggtagcgg aggaggagga 60

gaattcgtcc g 71

<210> 8

<211> 590

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

<400> 8

tggatcctat gtacgtaagg aagaagcgga gacagcgaag aagcggagga tcgggtagcg 60

ggttcacacc tctccgaaag ttaaaaacct gaacccgaaa aaattctcta tccacgacca 120

ggaccacaaa gttctggttc tggactctgg taacctgatc gctgttccgg acaaaaacta 180

catccgtccg gaaatcttct tcgctctggc ttcttctctg tcttctgctt ctgctgaaaa 240

aggttctccg atcctgctgg gtgtttctaa aggtgaattc tgcctgtact gcgacaaaga 300

caaaggtcag tctcacccgt ctctgcagct gaaaaaagaa aaactgatga aactggctgc 360

tcagaaagaa tctgctcgtc gtccgttcat cttctaccgt gctcaggttg gttcttggaa 420

catgctggaa tctgctgctc acccgggttg gttcatctgc acctcttgca actgcaacga 480

accggttggt gttaccgaca aattcgaaaa ccgtaaacac atcgaattct ctttccagcc 540

ggtttgcaaa gctgaaatgt ctccgtctga agtttctgac taattaatga 590

<210> 9

<211> 699

<212> DNA/RNA

<213> 人

<400> 9

gaaccgaaat cttgcgacaa aacccacacc tgcccgccgt gcccggctcc ggaactgctg 60

ggtggtccgt ctgttttcct gttcccgccg aaaccgaaag acaccctgat gatctctcgt 120

accccggaag ttacctgcgt tgttgttgac gtttctcacg aagacccgga agttaaattc 180

aactggtacg ttgacggtgt tgaagttcac aacgctaaaa ccaaaccgcg tgaagaacag 240

tacaactcta cctaccgtgt tgtttctgtt ctgaccgttc tgcaccagga ctggctgaac 300

ggtaaagaat acaaatgcaa agtttctaac aaagctctgc cggctccgat cgaaaaaacc 360

atctctaaag ctaaaggtca gccgcgtgaa ccgcaggttt acaccctgcc gccgtctcgt 420

gaagaaatga ccaaaaacca ggtttctctg acctgcctgg ttaaaggttt ctacccgtct 480

gacatcgctg ttgaatggga atctaacggt cagccggaaa acaactacaa aaccaccccg 540

ccggttctgg actctgacgg ttctttcttc ctgtactcta aactgaccgt tgacaaatct 600

cgttggcagc agggtaacgt tttctcttgc tctgttatgc acgaagctct gcacaaccac 660

tacacccaga aatctctgtc tctgtctccg ggtaaataa 699

<210> 10

<211> 1237

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttacgtaatg gttcacacct ctccgaaagt taaaaacctg aacccgaaaa aattctctat 60

ccacgaccag gaccacaaag ttctggttct ggactctggt aacctgatcg ctgttccgga 120

caaaaactac atccgtccgg aaatcttctt cgctctggct tcttctctgt cttctgcttc 180

tgctgaaaaa ggttctccga tcctgctggg tgtttctaaa ggtgaattct gcctgtactg 240

cgacaaagac aaaggtcagt ctcacccgtc tctgcagctg aaaaaagaaa aactgatgaa 300

actggctgct cagaaagaat ctgctcgtcg tccgttcatc ttctaccgtg ctcaggttgg 360

ttcttggaac atgctggaat ctgctgctca cccgggttgg ttcatctgca cctcttgcaa 420

ctgcaacgaa ccggttggtg ttaccgacaa attcgaaaac cgtaaacaca tcgaattctc 480

tttccagccg gtttgcaaag ctgaaatgtc tccgtctgaa gtttctgact aatgagaacc 540

gaaatcttgc gacaaaaccc acacctgccc gccgtgcccg gctccggaac tgctgggtgg 600

tccgtctgtt ttcctgttcc cgccgaaacc gaaagacacc ctgatgatct ctcgtacccc 660

ggaagttacc tgcgttgttg ttgacgtttc tcacgaagac ccggaagtta aattcaactg 720

gtacgttgac ggtgttgaag ttcacaacgc taaaaccaaa ccgcgtgaag aacagtacaa 780

ctctacctac cgtgttgttt ctgttctgac cgttctgcac caggactggc tgaacggtaa 840

agaatacaaa tgcaaagttt ctaacaaagc tctgccggct ccgatcgaaa aaaccatctc 900

taaagctaaa ggtcagccgc gtgaaccgca ggtttacacc ctgccgccgt ctcgtgaaga 960

aatgaccaaa aaccaggttt ctctgacctg cctggttaaa ggtttctacc cgtctgacat 1020

cgctgttgaa tgggaatcta acggtcagcc ggaaaacaac tacaaaacca ccccgccggt 1080

tctggactct gacggttctt tcttcctgta ctctaaactg accgttgaca aatctcgttg 1140

gcagcagggt aacgttttct cttgctctgt tatgcacgaa gctctgcaca accactacac 1200

ccagaaatct ctgtctctgt ctccgggtaa ataatga 1237

Claims (2)

1.具有IL-37活性的重组蛋白在制备防治骨关节炎和痛风的药物中的应用，其特征是，

所述具有IL-37活性的重组蛋白为重组人IL-37-HIV1 Tat融合蛋白或重组人IL-37-Fc融合蛋白；

所述重组人IL-37-HIV1 Tat融合蛋白的氨末端为HIV-1 Tat穿模结构，羧末端为人IL-37活性部分，两者之间有一中间肽连接，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述重组人IL-37-Fc融合蛋白是重组蛋白的氨末端为IL-37活性部分，羧末端为人IgG1 Fc包括铰链CH2和CH3部分，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具有IL-37活性的重组蛋白的制备方法包括如下步骤：

（1）设计得到表达权利要求1所述氨基酸的核苷酸序列；

（2）构建表达权利要求1所述氨基酸的核苷酸序列表达系统，包括构建表达载体并将表达载体转入宿主细胞，形成可表达如权利1所述的具有IL-37活性的重组蛋白；

（3）培养表达权利要求1所述氨基酸的核苷酸序列表达系统的重组细胞，使其表达目的蛋白；

（4）分离纯化权利要求1所述的具有IL-37活性的重组蛋白。

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