CN110724711A - 一种联合调控系统及其应用 - Google Patents

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李晓芬
卢俊南
李姣姣
赵思婷
陈小平
秦莉
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Abstract

本发明涉及蛋白表达领域，尤其涉及一种联合调控系统及其应用，所述系统包括Tet‑On调控系统和DDD调控系统，所述Tet‑On调控系统和DDD调控系统融合表达在一个载体上。所述联合调控系统能够实现降低单独使用一种调控系统的本底的目的，从而实现联合调控系统在不需表达目标蛋白时具有更低本底目的蛋白表达量。

Description

一种联合调控系统及其应用
技术领域
本发明涉及蛋白表达领域，尤其涉及一种联合调控系统及其应用，具体为以Tet-On和DDD调控系统为基础的联合调控系统的构建及其在表达目标蛋白时的应用。
背景技术
Tet系统是利用四环素操纵子建立起来的一个在真核细胞中调控外源基因表达的一个成熟的调控系统，具有高效、无毒等特点。首先被建立的是反式激活的Tet-off系统，后来通过改造Tet-off系统中的tetR蛋白的基因编码的4个氨基酸，分别将71位的Glu突变为Lys，95位的Asp突变为Asn，101位的Leu突变为Ser，102位的Gly突变为Asp获得了可以正向诱导的Tet-on系统，通过在环境中添加四环素或者强力霉素时，rtTA可以与四环素或者强力霉素结合，然后与TetO结合启动下游基因转录，当撤去四环素或者强力霉素时下游基因不会转录，以此调控目的基因的转录。Tet-On调控系统目前存在缺陷，当不添加四环素或者强力霉素时依然有部分目的基因可以转录，因此使用Tet-On调控系统在不需要转录时会有较高的背景。
CN 107557389 A公开了一种微囊化hBMP-2/Tet-on系统的构建方法，该发明将Tet-on系统与hBMP-2同时构建于慢病毒载体上，提高了两个系统的转染效率和表达，更加稳定和持续表达目的基因。CN 103993029 A公开了利用四环素调控的dcf1基因诱导表达载体及其构建方法，该发明利用四环素来调控DCF1在哺乳动物中表达，与ptTS-Neo一起完成调控。当这两个利用Tet-on系统调控表达都存在无需转录背景较高的问题。
DDD(DHFR degradation domain)调控系统是一种利用泛素蛋白酶系统对目的蛋白进行调控的调控系统，它利用大肠杆菌的二氢叶酸还原酶(ecDHFR)与目标蛋白融合通过控制稳定剂添加与否对目的蛋白进行蛋白水平的调控。ecDHFR可以被DHFR抑制剂甲氧苄氨嘧啶(TMP)所稳定。当没有添加稳定剂TMP时，ecDHFR及与其融合的蛋白会被泛素标记，然后被蛋白酶体识别并降解，从而实现目的蛋白的不表达。而当添加稳定剂TMP时，TMP会与ecDHFR结合并且稳定ecDHFR，从而使ecDHFR及与其融合的蛋白保持稳定的状态不被泛素化降解，目的蛋白可以正常表达。TMP与ecDHFR结合从而稳定蛋白不被降解这个状态是可逆的，添加TMP可以稳定ecDHFR，而撤走TMP会导致ecDHFR及其融合蛋白的降解，所以通过控制TMP的量可以控制目的蛋白的表达水平。
DDD调控系统中使用到的稳定剂甲氧苄氨嘧啶TMP是一种常用并且廉价的人用药，可以直接在人体上使用，所以DDD调控药TMP可以用于人体的调节实验而不用经过额外的药物审批。另外TMP对DHFR有很强的稳定效果，而TMP对ecDHFR的稳定作用比哺乳动物的DHFR更强，所以只需要很小量的TMP就可以稳定ecDHFR，所以使用DDD调控系统的调控成本比较低。除此以外，TMP还能够通过血脑屏障以及胎盘屏障，所以DDD可以用于调控不同时期，不同范围的蛋白表达，具有很广阔的应用空间。
CN 1618955 A公开了一种CHO/dhfr-细胞定点整合表达系统，该系统能够实现外源基因在CHO/dhfr-细胞基因组中定点整合和有效表达，该系统可用于重组蛋白在CHO/dhfr-细胞中的高表达研究，可见，dhfr系统(DDD调控系统)是一种使用方便，应用广泛的蛋白调控系统，但与Tet-On系统类似，DDD调控系统也存在一定缺陷，在撤去TMP时同样存在部分目的蛋白不降解。现有技术中，并没有将两种调控系统联合的现有技术，也没有给出是否能够将两种系统联合使用，两种系统联合使用会带来什么样效果的技术启示。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明提供一种联合调控系统及其应用，所述联合调控系统能够实现降低单独使用一种调控系统的本底的目的。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种联合调控系统，所述系统包括Tet-On调控系统和DDD调控系统，所述Tet-On调控系统和DDD调控系统融合表达在一个载体上。
本发明中，发明人发现在单独使用Tet-on调控系统时，在不添加诱导剂诱导目标基因转录的情况下，实际上仍然有部分目标基因可以转录从而造成较高的本地表达，单独使用DDD调控系统，在不添加稳定剂的情况下，实际上仍然有部分的目标蛋白残留不被讲解；发明人发现将这两个调控系统通过一定的方式进行联合表达，这两个系统不仅能发挥原来系统的作用效果，其调控效果还能进一步相互叠加，解决本地表达较高的问题，降低了不需表达目标蛋白时的本底表达水平。
根据本发明，所述Tet-On调控系统包括rTRAD元件和TetO7元件，所述rTRAD元件位于单独的表达框内，所述TetO7元件位于目标基因表达框启动子的5’端。
根据本发明，所述rTRAD元件的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体SEQ ID NO.1所示的核酸序列如下：
atgtctagactggacaagagcaaagtcataaactctgctctggaattactcaatggagtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctgccaatcgagatgctggacaggcatcatacccactcctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcataccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggaacaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgaaacaagcaattgagctgttcgaccggcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcggggataaaaataatatgaaccatataccatattataacgatatgaataataacataacaaattatgctaacatgactggaatacaaaatttaaataatatgaatccaataatgatcgatccaaataataatgctgattctgtggaagagttttatgatgcaatcgatggatgtaatgtggttgataccaattatatggtaggtacaaataatatgattgatcaaattcattttaatgatgtaactagtaatgtaggaaatatgaataataattaa.
根据本发明，所述TetO7元件的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体SEQ ID NO.2所示的核酸序列如下：
ggggataacgtctcacttaatcgatgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagcatcgatacggctgagacgtatcc.
根据本发明，所述DDD调控系统包括ecDHFR元件，所述ecDHFR元件位于目标基因的表达框内，所述ecDHFR元件位于目标基因的C端或者N端均可，从而受到Tet-On调控系统的调控。
根据本发明，所述ecDHFR元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列如下：
MISLIAALAVDYVIGMENAMPWNLPADLAWFKRNTLNKPVIMGRHTWESIGRPLPGRKNIILSSQPGTDDRVTWVKSVDEAIAACGDVPEIMVIGGGRVIEQFLPKAQKLYLTHIDAEVEGDTHFPDYEPDDWESVFSEFHDADAQNSHSYCFEILERR.
根据本发明，所述载体为pl0018载体，本发明中通过在特定的pL0018质粒插入Tet-On调控系统和DDD调控系统，使得两个系统都能够共同发挥作用，且效果进一步叠加。
第二方面，本发明提供一种联合调控组合物，所述联合调控组合物包括如第一方面所述的联合调控系统。
优选地，所述联合调控组合物还包括稳定剂和诱导剂，所述稳定剂为甲氧苄氨嘧啶，所述诱导剂为强力霉素。
本发明中，所述甲氧苄氨嘧啶的给药浓度为1mg/mL，通过将100mgTMP溶于2mLDMSO中，三天一换；所述强力霉素的给药浓度为每kg小鼠体重给予0.1g强力霉素，通过腹腔给药小鼠，每隔24h给药一次；而发明人发现可以通过控制甲氧苄氨嘧啶(TMP)和强力霉素(Dox)的量从而实现控制目的蛋白表达。
第三方面，本发明提供如第一方面所述的联合调控系统或如第二方面所述的联合调控组合物用于调控目的蛋白的表达。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过将Tet-On调控系统和DDD调控系统进行联合表达，获得了优于原有调控系统的联合表达系统，解决了原有单一调控系统调控本底水平太高的问题，联合调控系统在不需表达目标蛋白时具有更低本底目的蛋白表达量；
(2)本发明通过大量实验验证，采用pl0018质粒将Tet-On调控系统和DDD调控系统这两个进行联合表达，使得这两个系统可以更好的发挥作用，再通过调节诱导剂和稳定剂的量，从而实现控制目的蛋白表达的结果。
附图说明
图1(A)为pl0018-TetO7-Pmin-DHFR-GFPm3-3’CAM-rTRAD载体示意图；
图1(B)为pl0018-TetO7-Pmin-GFPm3-DHFR-3’CAM-rTRAD载体示意图；
图2为基因组鉴定电转虫株凝胶电泳结果，其中，M：TAKARA DL2000Marker，W：P.bANKA基因组，A：pl0018-TetO7-Pmin-DHFR-GFPm3-3’CAM-rTRAD，B：pl0018-TetO7-Pmin-GFPm3-DHFR-3’CAM-rTRAD；
图3为荧光显微镜检测Tet-On/DDD-GFP及Tet-On/GFP-DDD虫株荧光结果；
图4为荧光显微镜检测虫株荧光结果，其中，图4(A)为荧光显微镜检测Tet-On/DDD-GFP虫株荧光结果；图4(B)为荧光显微镜检测DDD-GFP虫株荧光结果；图4(C)为荧光显微镜检测Tet-on-GFP虫株荧光结果；图4(D)为空白对照。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
1)实验材料
1.1质粒。该实验所用pL0018质粒。该实验所用pL0018质粒来源于MR4。pL0018质粒上含有鼠的弓形体二氢叶酸还原酶(tgdhfr/ts)基因，该基因具有乙胺嘧啶抗性。我们将合成的rTRAD基因插入BamH I位点，取代原有质粒上的gfp基因，另外在Kpn I插入TetO7-Pmin-DHFR-GFPm3-3’CAM表达框，其中TetO7-Pmin-DHFR为合成，GFPm3及3’CAM从pl0018扩增得到。
1.2引物。用Primer premier 5.0软件分别设计鉴定引物，由华大基因公司合成。实验所需的坚定引物可在实施例1中查找。
1.3克隆所用的主要酶类及相关试剂。Bam H I(Thermo,FD0054)，Kpn I(Thermo,FD0524)。
1.4小鼠、疟原虫。无特定病原体(Specific Pathogen Free SPF)级雌性C57BL/6小鼠，5周龄左右。购自于上海莱德尔实验动物有限责任公司(license:SCXK(HU)2007-0003,China)。小鼠由中国科学院广州生物医药与健康研究院实验动物中心饲养，规律12小时光照，12小时黑暗。动物实验的操作符合实验动物使用的相关规定，所有实验经中国科学院广州生物医药与健康研究院实验动物使用管理委员会认可。鼠非致死型伯氏疟原虫P.bANKA来源于MR4。
1.5其他主要试剂和实验器材。TOYOBOKOD Plus，TAKARA Ligation Mix，AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen，#AP-MN-P-50)，AxyPrep胶回收试剂盒(Axygen，AP-GX-50)，蛋白胨，酵母粉，NaCl，琼脂糖，乙胺嘧啶；PCR仪(美国通用生物公司)，琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一公司)，紫外分光光度仪(贝克曼公司)，光学显微镜(莱卡公司)，低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，生化培养箱(上海一恒仪器公司)，半干式转膜仪(Bio-Red公司)，电转染仪(德国Amaxa公司)，C6、Arial、Fortessa流式细胞仪(BD)，激光共聚焦显微镜(莱卡公司)。
一、本实验用到的基本分子克隆技术：
1)片段获取
使用TOYOBO公司的KOD Plus
TOYOBO KOD Plus PCR体系如下：
Figure BDA0002280767080000071
Figure BDA0002280767080000081
设置PCR的反应程序：扩增的条件为94℃预变性2min，循环开始，98℃变性10sec，55℃退火30sec，68℃延伸30sec/kbp，30个循环之后，68℃延伸5min，最后冷至16℃。
对PCR产物进行凝胶电泳并胶回收(胶回收按Axygen胶回收试剂盒说明书进行)。
2)质粒的提取。
参照Axygen公司AxyPrep质粒DNA小量试剂盒的说明书(Axygen，#AP-MN-P-50)进行。
3)凝胶DNA片段提取。
参照Axygen公司AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书进行。
4)DNA的酶切及载体鉴定。
将质粒DNA用所对应的限制性内切酶及其配套的缓冲液配置成合适的反应体系，37℃水浴0.5～1h，鉴定酶切结果。
Figure BDA0002280767080000082
Figure BDA0002280767080000091
在37℃酶切30min后进行胶回收
5)目的片段与载体的连接，转化。
参考TAKARA Ligation Mix说明书，
(1)将载体(例如pUC118 DNA(3,162bp)(50ng，25fmol))质粒载体和插入DNA片段(25～250fmol)混合配制成体积为5～10μl的DNA溶液＊1。
(2)向上述DNA溶液中加入等体积(5～10μl)的Ligation Mix，充分混合。
(3)16℃反应30分钟＊2。
(4)反应液直接用于转化时，将10μl＊3反应液加入到100μl Competent cells中。
＊1：使用TE Buffer(10mM Tris-HCl、1mM EDTA,pH8.0)溶解DNA。
＊2：插入DNA片段和质粒载体的连接效果不好时，可以延长反应时间至过夜。
＊3：直接进行热转化时，DNA连接液不要超过10μl。当使用大量的DNA连接液进行热转化或使用电穿孔法转化时，请先进行乙醇沉淀纯化DNA。
其中大肠杆菌感受态购买于南京诺唯赞公司。
具体的转化步骤：
(1)取两管冻存的感受态细胞，一管加入1μl待转化的质粒DNA或10μl DNA连接产物，混匀，另一管作阴性对照，不加DNA，其它处理相同；
(2)冰浴30min，42℃热激90sec，立即冰浴5min；
(3)加入500μl新无抗性LB37℃摇床培养1小时，将LB涂布于含对应抗生素的LB固体培养基平板上；
(4)倒置平皿，置于37℃恒温培养箱培养10～16h，观察菌落的生长情况；
(5)根据需要挑选单菌落数，并在对应抗生素的LB中扩陪，取部分于15％甘油，保菌存-80℃冰箱，同时，根据需要提取质粒。
(6)DNA序列的测定。
将DNA片段、载体或者菌液送英潍捷基公司进行DNA序列测定，软件检测序列，克隆是否正确。
实施例1构建联合调控系统调控报告基因GFP的伯氏疟原虫虫株
在pl0018载体的BamHI酶切位点插入所需的rTRAD基因，在KpnI位点插入TetO7-Pmin-DHFR-GFPm3以及TetO7-Pmin-GFPm3-DHFR构建pl0018-TetO7-Pmin-DHFR-GFPm3-3’CAM-rTRAD以及pl0018-TetO7-Pmin-GFPm3-DHFR-3’CAM-rTRAD两个载体，具体构建的载体如图1(A)-图1(B)所示。
对构建的pl0018-TetO7-Pmin-DHFR-GFPm3-3’CAM-rTRAD以及pl0018-TetO7-Pmin-GFPm3-DHFR-3’CAM-rTRAD两个载体转化大肠杆菌，挑选阳性转化子鉴定，质粒进行线性化以及浓缩后电转伯氏疟原虫P.bANKA。对电转后的疟原虫提取基因组进行鉴定，鉴定引物如下所示：
鉴定pl0018-TetO7-Pmin-DHFR-GFPm3-3’CAM-rTRAD(产物长度1120bp)：
AF(SEQ ID NO.4)：ACGGGGTACCGGGGATAACGTCTCACT；
AR(SEQ ID NO.5)：TTCTCCTTTACTCATCCGCCGCTCCAGAAT；
鉴定pl0018-TetO7-Pmin-GFPm3-DHFR-3’CAM-rTRAD(产物长度1146bp)：
BF(SEQ ID NO.6)：GATGAACTATACAAAATGATCAGTCTGAT；
BR(SEQ ID NO.7)：TCGGGGTACCGAACTTAATAAAAAAGAG；
对提取的基因组进行鉴定，结果如图2所示，鉴定证明成功将表达载体电转进入伯氏疟原虫P.bANKA，联合调控虫株构建成功。
实施例2验证联合调控系统能够正常诱导目标蛋白表达
对构建的联合调控疟原虫虫株按照以下方式给药：
TMP给药：TMP 1mg/mL浓度100mg TMP溶于2mL DMSO，溶于100ml水中，三天一换。
Dox给药：对小鼠腹腔给药：Dox(0.1g/kg，20g小鼠给药2mg，腹腔给药200μLDoxycycline(Dox)储液)，每隔24h给药一次。
pl0018-TetO7-Pmin-DHFR-GFPm3-3’CAM-rTRAD简称为Tet-On/DDD-GFP，pl0018-TetO7-Pmin-GFPm3-DHFR-3’CAM-rTRAD简称为Tet-On/GFP-DDD。
对不给药组(blank)以及给药组(TMP/Dox)的虫株以及对照的野生型P.bNAKA虫株进行荧光显微镜观察，结果如图3所示，结果显示联合调控系统在联合给药TMP/Dox后能够诱导目标蛋白GFP的荧光表达，在不给药TMP/Dox时没有检测到GFP荧光表达，证明联合调控系统可行。另外联合调控系统使用DHFR的N端以及C端跟目标蛋白融合均能表达目标蛋白。
实施例3验证联合调控系统与单独使用Tet-On以及DDD调控系统相比本底最低
将Tet-On/DDD-GFP虫株(联合调控)，DDD-GFP虫株(单独DDD调控)，Tet-On-GFP虫株(单独Tet-On调控)以及野生型对照P.bANKA虫株进行比较，在分别给药以及不给药后对各个虫株进行荧光显微镜检测目标蛋白GFP的荧光，结果如图4所示，从图4(A)-图4(D)结果显示联合调控系统的本底最低，跟野生型一致，单独使用DDD以及Tet-On调控均有较高的本底水平，联合调控系统有效。
综上所述，将Tet-On调控系统以及DDD调控体统联合，获得联合的Tet-On/DDD调控系统能够有效的降低单独使用Tet-On以及DDD调控系统的本底水平，让目标蛋白在不需要表达的时候不表达，降低本底水平，让调控效果更加有效。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120> 一种联合调控系统及其应用
<130> 2019
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<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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atgtctagac tggacaagag caaagtcata aactctgctc tggaattact caatggagtc 60
ggtatcgaag gcctgacgac aaggaaactc gctcaaaagc tgggagttga gcagcctacc 120
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<213> 人工合成序列
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Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu
35 40 45
Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser
50 55 60
Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu
65 70 75 80
Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly
85 90 95
Gly Arg Val Ile Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu
100 105 110
Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr
115 120 125
Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp
130 135 140
Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Cys Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg
145 150 155
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
acggggtacc ggggataacg tctcact 27
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
ttctccttta ctcatccgcc gctccagaat 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
gatgaactat acaaaatgat cagtctgat 29
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
tcggggtacc gaacttaata aaaaagag 28

Claims (10)

1.一种联合调控系统，其特征在于，所述系统包括Tet-On调控系统和DDD调控系统，所述Tet-On调控系统和DDD调控系统融合表达在一个载体上。
2.根据权利要求1所述的联合调控系统，其特征在于，所述Tet-On调控系统包括rTRAD元件和TetO7元件；
优选地，所述rTRAD元件位于单独的表达框内，所述TetO7元件位于目标基因表达框启动子的5’端。
3.根据权利要求1或2所述的联合调控系统，其特征在于，所述rTRAD元件的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述TetO7元件的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的联合调控系统，其特征在于，所述DDD调控系统包括ecDHFR元件；
优选地，所述ecDHFR元件位于目标基因的表达框内。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的联合调控系统，其特征在于，所述ecDHFR元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求1所述的联合调控系统，其特征在于，所述载体为pl0018载体。
7.一种联合调控组合物，其特征在于，所述联合调控组合物包括如权利要求1-5中任一项所述的联合调控系统。
8.根据权利要求7所述的联合调控组合物，其特征在于，所述联合调控组合物还包括稳定剂和诱导剂。
9.根据权利要求7或8所述的联合调控组合物，其特征在于，所述稳定剂为甲氧苄氨嘧啶；
优选地，所述甲氧苄氨嘧啶给药浓度为1mg/mL；
优选地，所述诱导剂为强力霉素；
优选地，所述强力霉素给药浓度为0.1g/kg小鼠。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的联合调控系统或如权利要求7-9中任一项所述的联合调控组合物用于调控目的蛋白的表达。
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