KR101584244B1 - 결실형 인간 보체 인자 h 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 결실형 인간 보체 인자 H(dCFH), 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 결실형 인간 보체 인자 H를 생산하는 방법, 및 상기 결실형 인간 보체 인자 H를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 결실형 인간 보체 인자 H는 전장의 인간 보체 인자 H에 비해 동물 세포에서의 발현량이 현저히 높으므로, 인간 보체 인자 H를 대체하여 치료제를 생산하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

결실형 인간 보체 인자 H 및 이의 용도{DELETION FORM OF HUMAN COMPLEMENT FACTOR H AND USE THEREOF}
본 발명은 결실형 인간 보체 인자 H 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 결실형 인간 보체 인자 H(deletion form of human complement factor H, dCFH), 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 결실형 인간 보체 인자 H를 생산하는 방법, 및 상기 결실형 인간 보체 인자 H를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
보체 시스템(complement system)은 생물로부터 병원균을 제거하는 항체 및 식세포의 작용을 도울 뿐만 아니라, 스스로도 세포의 분해(cytolysis), 식균작용 증진(opsonization), 염증반응(inflammation)의 활성화 및 면역복합체(immune complexes)의 제거 등과 같은 여러 가지 작용을 하여, 선천적 면역 체계의 일부분을 담당한다.
보체는 세 가지의 경로를 통하여 활성화되는 것으로 알려져 있다. 첫 번째는 고전 경로(classical pathway)로서, 일반적으로 항체 의존적 경로를 지칭하며, C1 복합체에 의해 활성이 시작된다. 두 번째는 대체 경로(alternative pathway)로서, C3 분자의 붕괴로 인해 활성이 시작된다 (Nat . Immunol ., 2010, Sep; 11(9):785-97). 그리고, 세 번째는 렉틴 경로(lectin pathway)로서, 고전 경로와 유사하나 옵소닌(opsonin)이나 만노오스 부착 렉틴(mannose-binding lectin) 등에 의해 활성이 유도된다.
주로 대체 경로를 조절하는 것으로 알려진 '인간 보체 인자 H'(human complement factor H, 이하 'hCFH'라고도 함)는 20개의 짧은 반복 도메인(short consensus repeats, SCRs)을 지닌 155kD 크기의 커다란 당단백질로서, 인체 혈액 내에 약 200~300 μg/mL의 양으로 존재한다(Invest . Ophthalmol . Vis . Sci ., 2008, May; 49(5):1983-90). hCFH는 보체 인자 I(Factor I)와 함께 C3b 제거 및 C3 전환효소에 의한 붕괴 가속화를 저해하는 역할을 할 뿐만 아니라, 자기(self)와 비자기(non-self) 세포를 구분하여 자기 세포만을 선택적으로 방어하는 기능을 지니고 있다(Immunopharmacology, 49 (1-2): 149-57).
hCFH는 막성증식형신염 타입 II(membranoproliferative glomerulonephritis type II, MPGN type II), 비전형적 용혈성 요독 증후군(atypical hemolytic uremic syndrome, aHUS) 및 노인황반변성(age-related macular degeneration, AMD)을 포함하는 각종 면역관련 질환에 관여하는 것으로 보고되고 있다(Clin . Exp . Immunol ., 2008, Jan; 151(1):1-13).
이에, 재조합 hCFH를 이용한 치료제 개발이 진행되고 있고, 이에 발맞추어 각종 발현 시스템을 활용하여 재조합 hCFH를 발현하는 시도들이 보고되고 있다. 예를 들어, 문헌[Gene, 1994, (143)301-2]에 따르면, 배큘로바이러스 시스템(Baculovirus system)에서 곤충 세포(insect cell)를 이용하여 5 mg/L의 수율로 재조합 hCFH를 얻을 수 있음이 보고되었다. 또한, 국제공개공보 제WO2008/113589호에 혈장 내 hCFH를 정제하는 방법이 개시되어 있으며, 미국 특허 제7745389호에 A549 세포를 이용하여 재조합 hCFH를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 나아가, 효모(yeast) 시스템을 이용하여 0.5 mg/L의 재조합 hCFH를 얻었다는 보고가 있었다(국제공개공보 제WO2011/077102호, Protein Expr . Purif., 2011, Apr; 76(2): 254-63). 하지만, 상기 선행기술들에 기술된 방법들은 hCFH의 발현량이 10 mg/L 이하로 매우 미미하여 실제 응용되기에 어려운 문제가 있다.
이에 본 발명자들은 동물세포에서 인간 보체 인자 H의 생산량을 증가시킬 수 있는 방법에 관해 연구하던 중, 인간 보체 인자 H의 일부분을 제거한 결실형 인간 보체 인자 H가 전장의 인간 보체 인자 H에 비해 동물세포에서의 발현량이 현저히 높음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 동물세포의 발현량이 우수한 결실형 인간 보체 인자 H(dCFH)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 결실형 인간 보체 인자 H의 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 결실형 인간 보체 인자 H를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 결실형 인간 보체 인자 H를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전장 인간 보체 인자 H의 1번째 내지 5번째 SCR(short consensus repeat) 도메인 또는 이의 단편; 및 전장 인간 보체 인자 H의 18번째 내지 20번째 SCR 도메인 또는 이의 단편을 포함하는, 결실형 인간 보체 인자 H(dCFH)를 제공한다.
다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 결실형 인간 보체 인자 H를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 결실형 인간 보체 인자 H의 생산 방법을 제공한다.
또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 면역관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 결실형 인간 보체 인자 H는 전장의 인간 보체 인자 H에 비해 동물 세포에서의 발현량이 현저히 높으므로, 인간 보체 인자 H를 대체하여 치료제를 생산하는데 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 hCFH 발현 벡터 pMSGneo-hCFH의 모식도이다.
도 2는 2단계의 PCR에 의해 결실형 보체 인자 H를 제작하는 과정을 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 3은 dCFH 발현 벡터 pMSGneo-dCFH의 모식도이다.
도 4는 dCFH 발현 벡터 pcDNA-dCFH의 모식도이다.
도 5는 dCFH 발현 벡터 pcDSW-dCFH의 모식도이다.
도 6은 CHO-S 세포에서의 hCFH와 dCFH의 일시적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 293-F 세포에서의 다양한 발현 벡터를 이용한 hCFH와 dCFH의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 CHO-K1 세포에서의 hCFH와 dCFH의 안정적 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 293-F 세포에서 발현된 dCFH의 활성을 확인한 그래프이다.
본 발명은 전장 인간 보체 인자 H의 1번째 내지 5번째 SCR(short consensus repeat) 도메인 또는 이의 단편; 및 전장 인간 보체 인자 H의 18번째 내지 20번째 SCR 도메인 또는 이의 단편을 포함하는, 결실형 인간 보체 인자 H(dCFH)를 제공한다.
상기 결실형 인간 보체 인자 H는 전장의 인간 보체 인자 H, 바람직하게는 Genbank Accession No. (BC142699.1)에 기술된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 전장의 인간 보체 인자 H로부터 유래된다. 상기 결실형 인간 보체 인자 H는 전장 CFH의 SCR(short consensus repeat)의 1번째 내지 5번째의 SCR 도메인('조절 영역'으로 알려짐) 및 이의 단편; 및 전장 CFH의 SCR의 18번째 내지 20번째의 SCR 도메인('결합 영역'으로 알려짐) 및 이의 단편을 포함한다. 상기에서 1번째 내지 5번째의 SCR 도메인의 단편은 1번째 내지 5번째의 SCR 도메인의 일부로서 조절 영역의 기능이 유지되는 단편을 지칭한다. 또한, 상기에서 18번째 내지 20번째의 SCR 도메인의 단편은 18번째 내지 20번째의 도메인의 일부로서 결합 영역의 기능이 유지되는 단편을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 1번째 내지 5번째의 SCR 도메인의 단편은 1번째 SCR 도메인, 2번째 SCR 도메인, 3번째 SCR 도메인, 4번째 SCR 도메인, 5번째 SCR 도메인, 또는 이의 조합일 수 있다. 또한, 바람직하게는 상기 18번째 내지 20번째의 SCR 도메인의 단편은 18번째 SCR 도메인, 19번째 SCR 도메인, 20번째 SCR 도메인, 또는 이의 조합일 수 있다.
상기 SCR의 1 내지 4번 도메인은 보조인자 활성(cofactor activity)을 지니고 있는 것으로 알려져 있으며(J. Immunol ., 1995, Jul. 1; 155(1): 348-56 참조), SCR의 18 내지 20번 도메인은 결합 기능을 지니고 있는 것으로 알려져 있다(Nat . Struct . Mol . Biol ., 2011, Apr; 18(4): 463-70). 전장 CFH는 상기 1~5 SCR 도메인 및 18~20 SCR 도메인 외에도 C-반응성 단백질 결합 기능을 하는 7~11 SCR 도메인, 및 헤파린(Heparin) 결합 기능을 하는 13~15 SCR 도메인이 존재하나, 본 발명의 결실형 인간 보체 인자 H는 1~5 SCR 도메인 및 이의 단편; 및 18~20 SCR 도메인 및 이의 단편만으로도 전장 CFH와 동일한 기능을 한다.
또한, 미국 특허 제7759304호는 보체 수용체2(CR2)의 결합 도메인인 SCR 1~4번과 CFH의 조절 도메인인 SCR 1~5번을 융합시켜 제조한 "TT30" 단백질이 각 SCR의 고유 기능을 가진다고 개시하고 있는데, 이 결과는 본 발명에 따른 결실형 인간 보체 인자 H가 CFH의 가장 중요한 기능인 보조인자 활성 및 결합 기능을 보유함으로써 CFH의 기능을 온전히 수행할 수 있음을 보여준다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 전장 인간 보체 인자 H의 1번째 내지 5번째 SCR 도메인 또는 이의 단편; 및 전장 인간 보체 인자 H의 18번째 내지 20번째 SCR 도메인 또는 이의 단편이 연결된 결실형 인간 보체 인자 H가 제공된다. 바람직하게는, 상기 전장 인간 보체 인자 H의 1번째 내지 5번째 SCR 도메인 또는 이의 단편; 및 전장 인간 보체 인자 H의 18번째 내지 20번째 SCR 도메인 또는 이의 단편은 N-말단으로부터 C-말단의 순서로 연결될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 결실형 인간 보체 인자 H는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 결실형 인간 보체 인자 H는 전장 CFH로부터 적절한 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 SCR 1~5번을 포함하는 단편을 얻고, 전장 CFH로부터 적절한 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 SCR 18~20번을 포함하는 단편을 얻은 후, 상기 두 단편으로부터 적절한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여, SCR 1~5번 및 SCR 18~20번으로 구성된 결실형 인간 보체 인자 H를 수득할 수 있다. 이렇게 얻어진 본 발명의 결실형 인간 보체 인자 H는 미국 특허 제7759304호에서 제시하고 있는 서로 다른 단백질의 도메인을 융합한 것이 아니라 전장 CFH에서 가장 중요한 기능을 하는 도메인만을 연결하여 제작한 것으로 그 차이를 명확히 구분할 수 있다. 한편, 상기 결실형 인간 보체 인자 H는 서열번호 3의 아미노산 서열을 바탕으로 당업계에 알려진 통상적인 단백질 합성 방법에 의해 수득할 수도 있다.
전술한 결실형 인간 보체 인자 H는 통상적인 유전공학방법에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 결실형 인간 보체 인자 H를 코딩하는 유전자를 발현 벡터에 삽입한 후, 이를 적합한 숙주세포에 형질전환시키고, 상기 숙주세포를 적합한 배양 조건에서 배양한 다음, 배양액 중 발현된 결실형 인간 보체 인자 H를 정제함으로써 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 결실형 인간 보체 인자 H를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기 서열을 가질 수 있으나, 유전 코드(genetic code)에 의해 서열번호 3의 아미노산 서열로 번역되는 한, 상기 서열에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 4의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전장의 인간 보체 인자 H를 코딩하는, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로부터 유래된다.
한편, 본 발명은 상기 결실형 인간 보체 인자 H를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 서열번호 4의 염기 서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공한다.
상기 발현 벡터의 구성은 결실형 인간 보체 인자 H를 생산하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 동물 세포에서 외래 유전자를 발현시킬 수 있는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 일 구체 예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 동물 세포에서 외래 단백질을 발현시킬 수 있는 공지된 발현 벡터(백본)에 본 발명의 목적 단백질인 dCFH를 코딩하는 유전자를 삽입함으로써 제조할 수 있다. 상기 백본 벡터로서 사용할 수 있는 벡터의 예로는 pMSGneo, pcDNA3.1(+) 등 일반 단백질 발현 벡터를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. pMSGneo 벡터의 경우 핵 기질(nuclear matrix)에 결합하는 MAR(Matrix attachment region) 인자가 포함된 발현 벡터로서, 상기 MAR 인자는 발현 벡터에 사용되는 경우 위치-독립적 발현(position-independent expression)을 유도하여 유전자 발현을 증대시키는 역할을 한다. 따라서, pMSGneo 벡터를 이용하는 경우 안정적이고 높은 발현량을 얻을 수 있다. 또한, pcDNA3.1(+) 벡터는 강력한 CMV 프로모터가 함유되어 있어 단백질 발현에 널리 사용되고 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 크게 제한되지 않으나, 포유동물 세포주인 것이 바람직하다. 포유동물 세포주로는 당업계에 공지된 CHO, BHK, COS7, HEK 세포주 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, CHO 세포주 또는 HEK 세포주, 더욱 바람직하게는 CHO-S 세포주, CHO-K1 세포주 또는 HEK293 세포주(예컨대, 293-F 세포주)를 사용할 수 있다. 상기 형질전환은 당업계에 알려진 통상적인 형질전환 방법에 의해 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
나아가, 본 발명은 상기 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 결실형 인간 보체 인자 H의 생산 방법을 제공한다. 본 방법에 사용되는 배지는 세포주에 따라 달라질 수 있으며, 각 세포주에 적합한 배지는 당업계에 널리 공지되어 있다. 또한, 형질전환체의 배양 방법 및 조건 등 역시 세포주에 따라 달라질 수 있으며, 각 세포주에 적합한 배양 방법 및 조건 역시 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 방법은 배지 중에 생산된 hCFH를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정제 방법은 당업계에 알려진 통상적인 단백질 정제 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서 결실형 인간 보체 인자 H는 프리스타일(FreeStyle) CHO 발현 배지에서 4일간 배양했을 때, CHO-S 세포주에서 전장 CFH에 비해 약 11배 높은 일시적 발현량을, 프리스타일 293 발현 배지에서 7일간 배양했을 때 293-F 세포주에서 약 4.8배 높은 발현량을, 그리고 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 7일간 배양했을 때 CHO-K1 세포주에서 약 20배 높은 안정적 발현량을 나타낸다.
이와 같이, 본 발명에 따른 결실형 인간 보체 인자 H는 전장 CFH에 비해 숙주세포에서의 발현량이 높아 숙주세포, 예를 들어 동물세포로부터 결실형 인간 보체 인자 H를 대량으로 수득할 수 있으며, 상기 수득된 결실형 인간 보체 인자 H는 인간 보체 인자 H를 이용한 치료제의 개발 또는 연구 등에 인간 보체 인자 H를 대신하여 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 결실형 인간 보체 인자 H를 유효성분으로 포함하는, 면역관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 면역질환의 예는 막성증식형신염 타입 II(MPGN type II), 비전형적 용혈성 요독 증후군(aHUS) 및 노인황반변성(AMD)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학적 조성물은 상기 결실형 인간 보체 인자 H 외에도 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체로서, 예를 들어 하나 이상의 용매, 희석제, 또는 다른 액체 비히클; 분산 또는 현탁 보조제; 표면 활성제; 등장화제; 농밀화제 또는 에멀션화제; 보존제; 고형물 결합제; 윤활제 등을 포함한다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, PA, 1975) and Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A.H. Kibbe ed. (American Pharmaceutical Assoc. 2000)]에는 상기 약학적 조성물을 제형화하는데 사용되는 다양한 담체 및 이의 제조를 위한 공지된 기법이 기술되어 있다. 상기 약학적 조성물은 전신(예, 정맥내 또는 주입에 의해서) 또는 국소(예, 기관 또는 조직, 예컨대, 눈 또는 간 내로 직접)적으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 결실형 보체 인자 H( deletion form of Complement Factor H, dCFH )의 유전자 확보
<1-1> 전장의 인간 보체 인자 H( hCFH )를 포함하는 발현 벡터의 제조
결실형 보체 인자 H(dCFH)의 유전자를 확보하기 위해, 먼저 전장의 인간 보체 인자 H를 포함하는 발현 벡터를 하기와 같이 제조하였다.
구체적으로, pCMV-SPORT6-hCFH 벡터(Imagene, #IRATp970B10140D)를 주형으로 프라이머쌍(서열번호 5 및 6)을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 pCMV-SPORT6-hCFH 5 ng에 각 프라이머(10 nmol/mL) 1 μl, PCR 프리-믹스 1μL(AccuPower® ProFi Taq PCR PreMix, Bioneer) 및 증류수 46 μL를 혼합하여 총 50 μL의 PCR 반응 혼합물을 만든 후, 상기 반응 혼합물을 94℃에서 30초, 65℃에서 60초 및 65℃에서 3분 20초간 30 사이클로 반응시켜 수행하였다. 상기 PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔에 전기영동한 후, 겔 용리(gel elution)를 수행하여 hCFH를 코딩하는 유전자 단편을 수득하였다.
이어서, 상기 수득한 hCFH를 코딩하는 유전자 단편과 백본 벡터로서 pMSGneo 벡터(목암연구소 제작)를 각각 NotI 및 XhoI으로 처리한 다음, T4 리가아제(ligase)를 이용하여 라이게이션하여 hCFH의 발현 벡터를 수득하였다. 상기 발현 벡터를 "pMSGneo-hCFH"로 명명하였다(도 1 참조).
상기 발현 벡터 내에 hCFH이 제대로 삽입되었는지 여부를 확인하기 위해, 상기 pMSGneo-hCFH 발현 벡터로 대장균 DH5α를 형질전환시키고, 상기 형질전환체로부터 플라스미드를 얻은 후, 이를 ScaI으로 처리하였다. 상기 플라스미드를 전기영동으로 확인한 결과, 목적하는 4kb의 hCFH를 코딩하는 유전자 단편이 올바르게 삽입되어 있음을 알 수 있었다.
<1-2> dCFH 유전자의 제작
하기 2단계의 PCR에 의해, CFH의 20개의 SCR(short consensus repeat) 중 1 내지 5번째의 SCR(조절 영역)과 18 내지 20번째의 SCR(결합 영역)이 연결된, 총 8개의 SCR로 구성된 결실형 보체 인자 H(dCFH)를 제작하였다.
PCR 반응은 표 1에 기재된 조건 하에서 Phusion High-Fidelity DNA 중합효소 및 표 2에 기재된 프라이머(서열번호 7 내지 10)를 사용하여 수행하였다. 상기 프라이머 중 SCR 1 F 프라이머에는 NotI 부위를 포함시켰고, SCR 20 B 프라이머에는 XhoI 부위를 포함시켜 추후에 클로닝에 이용할 수 있게 하였다.
① 1단계 PCR
실시예 1에서 제조된 pMSGneo-hCFH 발현 벡터를 주형으로 하여 SCR 1 F 프라이머 및 SCR 5번의 3' 영역과 SCR 18번의 5' 영역이 포함된 SCR 5(18) B 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 SCR 1~5번 단편을 얻었다. 또한, pMSGneo-hCFH를 주형으로 하여 SCR 5번의 3' 영역과 SCR 18번의 5' 영역이 포함된 SCR 18(5) F 프라이머와 SCR 20 B 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 SCR 18~20번을 포함하는 단편을 얻었다. 상기 두 단편을 위저드® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템(Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System; Promega사)으로 정제하였다(도 2 참조).
② 2단계 PCR
상기 1단계 PCR을 통해 얻은 두 가지 단편을 주형으로 하고, SCR 1 F 프라이머와 SCR 20 B 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 결실형 CFH(dCFH) 유전자를 얻었다(도 2 참조).
단계 온도 시간 사이클 횟수
초기 변성 98℃ 30초 1
변성 98℃ 10초 30
어닐링 55℃ 30초
확장 72℃ 30초1) / 45초2)
최종 확장 72℃ 5분 1
4℃ ∞
1) 1단계 PCR 조건
2) 2단계 PCR 조건
프라이머 염기서열 서열번호
SCR 1 F TA GCGGCCGC Catgagacttctagcaaagattatt 서열번호 7
SCR 5(18) B ACAGGAGGTGTCacatctcggagcaggtat 서열번호 8
SCR 18(5) F GCTCCGAGATGTgacacctcctgtgtgaatc 서열번호 9
SCR 20 B CGC CTCGAG ctatctttttgcacaagttgg 서열번호 10
상기 수득된 결실형 CFH(dCFH) 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것으로 확인되었고, CFH의 1 내지 5번째의 SCR과 18 내지 20번째의 SCR이 서로 연결되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 서열번호 4의 염기서열을 기초로, 상기 제작된 dCFH 유전자가 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하고 있음을 확인할 수 있었다.
상기 dCFH를 전장의 CFH와 비교하기 위하여, 이후 실험에서 dCFH를 다양한 발현 벡터를 사용하여 동물세포에서 발현시켰다.
실시예 2: 결실형 CFH 의 발현 벡터의 제조
<2-1> pMSGneo 벡터를 이용한 발현 벡터의 제조
실시예 1에서 수득한 결실형 CFH를 동물 세포에서 발현시키기 위해, 하기와 같이 백본으로서 pMSGneo 벡터를 이용하여 발현 벡터를 제조하였다.
실시예 1에서 획득한 dCFH 유전자와 pMSGneo-MCS 벡터(목암연구소 제작)를 NotI(NEB / R0189L) 및 XhoI(NEB / R0146S) 제한효소를 사용하여 37℃에서 약 3시간 동안 절단하였다. 상기 절단한 단편들을 아가로스 겔(agarose gel)에 의한 전기영동으로 확인한 후, 위저드® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템(Promega사)로 분리 및 정제하여 회수하고, DNA 라이게이션 키트 Ver.2.1(Takara/6022)을 이용하여 16℃에서 약 6시간 동안 라이게이션하여 dCFH 발현 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 벡터를 "pMSGneo-dCFH"로 명명하였다(도 3 참조).
<2-2> pcDNA3 .1(+) 벡터를 이용한 발현 벡터의 제조
실시예 1에서 수득한 결실형 CFH를 동물 세포에서 발현시키기 위해, 하기와 같이 백본으로서 pcDNA3.1(+) 벡터를 이용하여 발현 벡터를 제조하였다.
실시예 <2-1>에서 제조한 pMSGneo-dCFH 벡터 및 pcDNA3.1(+) 벡터(Invitrogen)를 NotI 및 XhoI 제한효소를 사용하여 37℃에서 약 3시간 동안 절단하였다. 상기 단편을 아가로스 겔에 의한 전기영동으로 확인한 후, 위저드® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 분리 및 정제하여 회수하고, DNA 라이게이션 키트 Ver.2.1(Takara / 6022)을 이용하여 16℃에서 약 6시간 동안 라이게이션하여 dCFH 발현 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 벡터를 "pcDNA-dCFH"로 명명하였다(도 4 참조).
<2-3> pcDSW 벡터를 이용한 발현 벡터의 제조
실시예 1에서 수득한 결실형 CFH를 동물 세포에서 발현시키기 위해, 하기와 같이 백본으로서 pcDSW 벡터를 이용하여 발현 벡터를 제조하였다.
pcDNA3.1(+) 벡터와 Y11 LC pcIW 벡터(목암연구소 제작; Nucleic Acids Res. 2008 Sep;36(15):e96)를 NheI(NEB / R0131S) 및 NotI 제한효소로 절단하였다. 절단한 단편을 아가로스 겔에 의한 전기영동으로 확인한 후, Y11 LC pcIW 벡터의 단편에서는 키메라 인트론(chimeric intron) 유전자를 오려내고, pcDNA3.1(+) 벡터는 벡터 크기의 유전자를 겔에서 오려내었다. 겔에서 오려낸 유전자들은 위저드® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 분리 및 정제하여 회수하고, DNA 라이게이션 키트 Ver.2.1(Takara / 6022)을 이용하여 16℃에서 약 6시간 동안 라이게이션하여 pcDS-MCS 벡터를 제조하였다.
한편, 폴리아데닐화, 핵에서 세포질로의 mRNA 배출 또는 번역에 관여하여 발현량을 높이는 인자로 알려진, 우드처크 간염 바이러스(Woodchuck hepatitis virus)에서 유래된 WPRE(Woodchuck post-regulatory element)를 이용하기 위하여, Y11 LC pcIW 벡터를 주형으로 PCR을 실시하여 상기 유전자를 확보하였다. PCR 반응은 표 3에 기재된 조건 하에서 Phusion High-Fidelity DNA 중합효소(Thermo / F-530S) 및 표 4에 기재된 프라이머(서열번호 11 및 12)를 사용하여 수행하였다. 상기 프라이머 중 WPRE F 프라이머에는 XhoI 부위를 포함시켰고, WPRE B 프라이머에는 XbaI 부위를 포함시켜 추후에 클로닝에 이용할 수 있게 하였다. 상기 PCR 산물을 위저드® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 정제하여 회수하였다.
단계 온도 시간 사이클 횟수
초기 변성 98℃ 30초 1
변성 98℃ 10초 30
어닐링 55℃ 30초
확장 72℃ 30초
최종 확장 72℃ 5분 1
4℃ ∞
프라이머 염기 서열 (5'→3') 서열번호
WPRE F CACTCGAGAATCAACCTCTGGAT 11
WPRE B ATTCTAGACGAAGACGCGGAAGA 12
상기 PCR을 통해 획득한 WPRE 유전자와 pcDS-MCS 벡터를 XhoI 및 XbaI(NEB / R0145S) 제한효소를 사용하여 37℃에서 약 1시간 동안 절단하였다. 절단한 단편들을 위저드® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 정제하여 회수한 다음, DNA 라이게이션 키트 Ver.2.1을 이용하여 16℃에서 약 3시간 동안 라이게이션하여 pcDSW-MCS 벡터를 제작하였다.
이후, pMSGneo-dCFH 벡터와 pcDSW-MCS 벡터를 NotI 및 XhoI 제한효소를 사용하여 37℃에서 약 3시간 동안 절단하였다. 상기 절단한 벡터를 아가로스 겔에서 전기영동하여 pMSGneo-dCFH 절단 유전자에서는 dCFH 유전자를 겔에서 오려내었고, pcDSW-MCS 벡터는 벡터 크기의 유전자를 겔에서 오려내었다. 겔에서 오려낸 유전자들을 위저드® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 정제하여 회수한 다음, DNA 라이게이션 키트 Ver.2.1를 이용하여 16℃에서 약 18시간 동안 반응시켜 결실형 CFH의 발현 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 벡터를 "pcDSW-dCFH"로 명명하였다(도 5 참조).
비교예 1: 전장 CFH 의 발현 벡터의 제조
<1-1> pcDNA3 .1(+) 벡터를 이용한 발현 벡터의 제조
pMSGneo-hCFH 벡터와 pcDNA3.1(+) 벡터(Invitrogen/V790-20)를 NotI 및 XhoI 제한효소를 사용하여 37℃에서 약 3시간 동안 절단하였다. 절단한 벡터를 아가로스 겔에서 전기영동하여 pMSGneo-hCFH 절단 유전자에서는 CFH 유전자를 겔에서 오려내고, pcDNA3.1(+) 벡터는 벡터 크기의 유전자를 겔에서 오려내었다. 겔에서 오려낸 유전자들을 위저드® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 정제하여 회수한 다음, DNA 라이게이션 키트 Ver.2.1을 이용하여 16℃에서 약 6시간 동안 라이게이션하여 전장 CFH의 발현 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 벡터를 "pcDNA-hCFH"로 명명하였다.
<1-2> pcDSW 벡터를 이용한 발현 벡터의 제조
pMSGneo-hCFH 벡터와 pcDSW-MCS 벡터를 NotI 및 XhoI 제한효소를 사용하여 37℃에서 약 3시간 동안 절단하였다. 상기 절단한 벡터를 아가로스 겔에서 전기영동하여 pMSGneo-hCFH 절단 유전자에서는 CFH 유전자를 겔에서 오려내고, pcDSW-MCS 벡터에서는 벡터 크기의 유전자를 겔에서 오려내었다. 겔에서 오려낸 유전자들을 위저드® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 정제하여 회수한 다음, DNA 라이게이션 키트 Ver.2.1을 이용하여 16℃에서 약 18시간 동안 라이게이션하여, 전장 CFH 발현 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 벡터를 "pcDSW-hCFH"로 명명하였다.
시험예 1: CHO -S 세포에서 일시적( transient ) hCFH 와 dCFH 발현량 확인
hCFH와 dCFH의 일시적 발현량을 확인하기 위해, CHO-S 세포(Invitrogen, #R800-07)을 준비하였다. 세포를 해동한 후, 125 ml 엘렌마이어 플라스크에 담긴 FreeStyle CHO 발현 배지(Invitrogen, #12651-014)에 3 X 105 세포/ml의 농도로 30 ml을 시딩(seeding)하였다. 2-3일 후, 세포가 1.2 내지 2.0 X 106 세포/ml 수준까지 성장할 수 있도록 2-3회 계대배양한 다음, 상기 제조한 pMSGneo-hCFH 벡터와 pMSGneo-dCFH 벡터를 Freestyle™ Max 시약(Invitrogen, #16447-100)을 이용하여 형질도입하였다. 형질도입 후, 3일 경과 시점부터 7일째까지 하루 한 차례 배양액을 1 mL씩 회수하였다. 회수한 배양액으로부터 세포 수와 생존율을 측정하고, 보체 인자 H, 인간 ELISA 키트(Complement factor H, Human, ELISA kit; Hycult biotech, #HK342)를 이용하여 CFH 발현량을 확인하였다.
상기 실험 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이, pMSGneo-hCFH 벡터가 형질도입된 CHO-S 세포의 경우 최대 약 0.073 μg/mL의 발현량을 나타낸 반면, pMSGneo-dCFH 벡터가 형질 도입된 CHO-S 세포의 경우 최대 약 0.815 μg/mL로 11배 가량 높은 발현량을 나타내었다.
시험예 2: 293-F 세포에서의 hCFH 와 dCFH 발현량 확인
FreeStyle™ 293-F 세포(Invitrogen / R790-07)를 Freestyle 293 발현 배지(Gibco / 12338-018)에서 배양하였다. 형질전환 24시간 전에 세포를 7×105 세포/mL로 계대하였다. 형질전환 날, 125 mL 엘른마이어 플라스크에 담긴 배양 배지에 세포를 7×106 세포/mL로 총 부피가 30 mL이 되도록 희석하였다. 1.5mL 튜브에 하기 표 5에 열거된 형질 전환용 플라스미드(하기 표 5 참조) 30 μg과 OptiPRO™ SFM(Gibco / 12309-019)을 이용하여 총 부피가 600 μL가 되도록 섞어주었다. 새로운 1.5 mL 튜브에 90 μL의 PEI MAX(Polyscience / 24765-2)(1 μg/μL)와 510 μL의 OptiPRO™ SFM을 섞어주었다. 플라스미드가 들어있는 용액과 PEI MAX가 들어있는 용액을 서로 섞어준 후, 상온에서 10분간 반응시켰다. 293-F 세포가 들어있는 엘른마이어 플라스크를 천천히 돌리면서 섞어준 용액을 첨가한 다음, 5% CO2 및 37℃ 현탁 배양기에서 130 rpm으로 7일간 배양하였다. 7일간 배양한 배지를 5000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 상층액에 대해 보체 인자 H, 인간, ELISA 키트(complement factor H, Human, ELISA kit; Hycult biotech / HK342)를 이용하여 발현량을 확인하였다.
플라스미드명 발현 단백질
pcDNA-hCFH 전장 CFH
pcDSW-hCFH 전장 CFH
pcDNA-dCFH 결실형 CFH
pcDSW-dCFH 결실형 CFH
상기 실험결과를 도 7에 나타내었다. 상기 도 7에서 보는 바와 같이, pcDNA3.1(+) 벡터의 백본을 갖는 pcDNA-hCFH로 형질전환된 293-F 세포는 최대 0.5 μg/mL의 발현량을 나타낸 반면, pcDNA-dCFH로 형질전환된 세포는 hCFH 대비 약 347배 상승한, 최대 138.9 μg/mL의 발현량을 나타내었다. 또한, 키메라 인트론과 WPRE를 보유하는 pcDSW 벡터의 백본을 갖는 pcDSW-hCFH로 형질전환된 293-F 세포는 최대 207.8 μg/mL의 발현량을 나타낸 반면, pcDSW-dCFH로 형질전환된 세포는 hCFH 대비 약 4.8배 증가한 최대 1011.8 μg/mL의 발현량을 나타내었다.
시험예 3: CHO - K1 세포에서의 안정적( stable ) hCFH 와 dCFH 발현량 확인
hCFH와 dCFH의 안정적 발현량을 확인하기 위해, CHO-K1 세포(ATCC, #CCL-61)를 준비하였다. 세포를 해동한 후, 10% FBS (LONZA, #14-501F)가 포함된 DMEM (LONZA, #12-604F) 배지에 3X106 세포/T75 플라스크로 시딩(seeding)하였다. 2-3일 후, 세포가 90% 수준의 컨플루언시까지 성장할 수 있도록 2-3회 계대배양한 다음, 리포펙타민 2000® 형질감염 시약(Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent; Invitrogen, #11668-027)을 이용하여 상기 제조한 pMSGneo-hCFH 또는 pMSGneo-dCFH 벡터로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 클론 선택(clone selection)을 위해 배지를 G418 500 ug/ml을 첨가한 배지로 교환해 주었다. 일주일 가량 세포의 성장을 살피면서 플라스크가 80-90% 차게 되었을 때 1차 계대를 해주었다. 1차 계대 후 2-3일에 플라스크가 80-90%가 차는 정도의 성장속도를 보이면 두 번 정도 계대를 진행한 후 T75 플라스크에 5X106 세포를 동일하게 T75 플라스크에 접종한 뒤, 3일 경과 시점부터 7일째까지 하루 한 차례 배양액을 1 mL씩 회수하였다. 마지막 7일째에는 세포에 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen, #25200-056)를 처리하여 세포수와 생존율을 측정하였으며, Complement factor H, Human, ELISA 키트(Hycult biotech, # HK342)를 이용하여 CFH 발현량을 확인하였다.
상기 실험결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 보는 바와 같이, pMSGneo-hCFH 벡터로 형질도입된 CHO-K1 세포의 경우 최대 약 0.015 μg/mL의 발현량을 나타낸 반면, pMSGneo-dCFH 벡터로 형질도입된 CHO-K1 세포의 경우 최대 약 0.306 μg/mL의 발현량을 나타내어 약 20배 높은 발현 정도를 보였다.
시험예 4: dCFH 의 활성 확인
본 발명의 dCFH 단백질이 CFH와 동일하게 인간 보체 인자로서의 기능을 하는지 확인하기 위해, 시험예 2에서 293-F 세포주에서 발현된 dCFH 단백질을 대상으로 활성을 확인하는 시험을 수행하였다. 시험예 2에서 얻은 293-F 세포주의 배양액을 정제하지 않고 배양액 내에 존재하는 단백의 활성 보유 여부를 직접 측정하였고, 그 대조물질로 dCFH가 발현되지 않은 순수 293-F 세포의 배양액을 사용하였다. 시험법으로는 인간 보체 C3 인자가 자이모산 A(zymosan A)에 축적되는 것을 방해하는 정도를 확인하는 시험 방법을 선정하였으며, 이는 이전부터 각종 보체 조절 인자들의 활성을 확인하는 시험법으로 사용되어 왔다(Eur . J. Immunol ., 1993.23: 1381-1384, J. Immunol ., 1998; 160:4553-4560, J. Immunol ., 2008 Dec 1;181(11):8068-76).
구체적으로, 1.5 mL 튜브를 이용하여 자이모산 A(Sigma, Z4250-250mg) 5 mg을 0.15 M NaCl 1 mL에 넣은 후 60분간 끓였다. 자이모산 A를 PBS 버퍼를 이용하여 2번 세척한 후, 0.1% BSA가 들어있는 PBS(PBSB) 1 mL을 이용하여 부유시켰다. 11개의 1.5mL 튜브에 10X 분석 버퍼(PBSB 중의 100 mM EGTA 및 50 mM MgCl2)를 20 μL씩 가하였다. 음성 대조 샘플에는 PBSB 160 μL를 첨가하였다. 백그라운드 대조 샘플에는 EDTA(Sigma, E7889, 0.5M) 4 μL, 인간 혈청 보체(human serum complement, HSC, Quidel, A113) 50 μL 및 PBSB 106 μL를 첨가하였다. 양성 대조 샘플에는 HSC 50 μL 및 PBSB 110 μL를 첨가하였다. 남은 6개의 샘플 튜브에도 HSC를 50 μL씩을 첨가하였다. 그리고 3개의 튜브 각각에 dCFH가 발현되어있는 배양액 110 μL, 59 μL 및 7.7 μL씩을 첨가하고 PBSB로 총 부피가 200 μL가 되도록 맞추었다. 나머지 3개의 튜브에도 각각 3일간 일반 293-F 배양한 배지를 110 μL, 59 μL 및 7.7 μL씩을 첨가하고 PBSB로 총 부피가 200 μL가 되도록 맞추었다. 그리고 나서, 상기 11개의 튜브에 자이모산 A를 20 μL씩 첨가한 후, 37℃에서 40분간 반응시켰다. 각 튜브에 EDTA를 4 μL씩 첨가하여 반응을 종료시킨 다음, PBSB로 2번 세척하였다. 그리고 나서, 튜브 당 항-보체 C3 항체(Anti-Complement C3 Antibody, FITC; LifeSpan BioSciences, LS-C62858)를 1 μL씩 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBSB로 1회 세척한 후 FACS를 이용하여 FITC 평균(FU) 값을 측정하였다. 그리고 나서, 하기 식에 의해 억제 정도를 계산하였다.
% 억제 = 1-[(샘플 평균 - 백그라운드) / (양성 대조군 평균 - 백그라운드)]×100
상기 실험 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, dCFH가 발현되지 않은 배양 배지 자체는 C3 축적을 전혀 억제하지 않은 반면, dCFH가 발현된 배양액의 경우 농도 의존적으로 억제 정도가 커지는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 본 발명의 결실형 CFH가 보체로서의 활성을 지님을 보여준다.
<110> Green Cross Corporation <120> DELETION FORM OF HUMAN COMPLEMENT FACTOR H AND USE THEREOF <130> FPD/201311-0349 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala 35 40 45 Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Ile Ile Met 50 55 60 Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys 65 70 75 80 Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr 100 105 110 Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu 115 120 125 Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val 130 135 140 Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser 145 150 155 160 Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe 165 170 175 Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys 180 185 190 Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile 195 200 205 Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys 210 215 220 Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly 225 230 235 240 Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp 245 250 255 Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile 260 265 270 Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp 275 280 285 Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly 290 295 300 Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys 305 310 315 320 Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr 325 330 335 His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr 340 345 350 Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr 355 360 365 Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro 370 375 380 Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln 385 390 395 400 Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys 405 410 415 His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met 420 425 430 Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys 435 440 445 Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln 450 455 460 Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly 465 470 475 480 Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys 485 490 495 Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro 500 505 510 Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu 515 520 525 Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr 530 535 540 Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp 545 550 555 560 Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val 565 570 575 His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val 580 585 590 Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser 595 600 605 Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys 610 615 620 Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn 625 630 635 640 Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu 645 650 655 Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln 660 665 670 Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu 675 680 685 Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu 690 695 700 Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser 705 710 715 720 Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly 725 730 735 Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys 740 745 750 Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys 755 760 765 Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys 770 775 780 Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu 785 790 795 800 Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln 805 810 815 Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly 820 825 830 Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly 835 840 845 Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys 850 855 860 Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr 865 870 875 880 Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys 885 890 895 Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu 900 905 910 Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly 915 920 925 Leu Pro Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His 930 935 940 Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe 945 950 955 960 Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu 965 970 975 Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu 980 985 990 Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr 995 1000 1005 Lys Ala Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys Met 1010 1015 1020 Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr Gly Arg 1025 1030 1035 1040 Pro Thr Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn 1045 1050 1055 Ala Tyr Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg 1060 1065 1070 Val Arg Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu 1075 1080 1085 Val Met Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp 1090 1095 1100 Ser Thr Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile 1105 1110 1115 1120 Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr 1125 1130 1135 Gln Cys Gln Asn Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys 1140 1145 1150 Arg Asn Gly Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val 1155 1160 1165 Ile Ser Arg Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr 1170 1175 1180 Ala Lys Gln Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val 1185 1190 1195 1200 Cys Lys Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr 1205 1210 1215 Thr Cys Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg 1220 1225 1230 <210> 2 <211> 3696 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 60 tgcaatgaac ttcctccaag aagaaataca gaaattctga caggttcctg gtctgaccaa 120 acatatccag aaggcaccca ggctatctat aaatgccgcc ctggatatag atctcttgga 180 aatataataa tggtatgcag gaagggagaa tgggttgctc ttaatccatt aaggaaatgt 240 cagaaaaggc cctgtggaca tcctggagat actccttttg gtacttttac ccttacagga 300 ggaaatgtgt ttgaatatgg tgtaaaagct gtgtatacat gtaatgaggg gtatcaattg 360 ctaggtgaga ttaattaccg tgaatgtgac acagatggat ggaccaatga tattcctata 420 tgtgaagttg tgaagtgttt accagtgaca gcaccagaga atggaaaaat tgtcagtagt 480 gcaatggaac cagatcggga ataccatttt ggacaagcag tacggtttgt atgtaactca 540 ggctacaaga ttgaaggaga tgaagaaatg cattgttcag acgatggttt ttggagtaaa 600 gagaaaccaa agtgtgtgga aatttcatgc aaatccccag atgttataaa tggatctcct 660 atatctcaga agattattta taaggagaat gaacgatttc aatataaatg taacatgggt 720 tatgaataca gtgaaagagg agatgctgta tgcactgaat ctggatggcg tccgttgcct 780 tcatgtgaag aaaaatcatg tgataatcct tatattccaa atggtgacta ctcaccttta 840 aggattaaac acagaactgg agatgaaatc acgtaccagt gtagaaatgg tttttatcct 900 gcaacccggg gaaatacagc caaatgcaca agtactggct ggatacctgc tccgagatgt 960 accttgaaac cttgtgatta tccagacatt aaacatggag gtctatatca tgagaatatg 1020 cgtagaccat actttccagt agctgtagga aaatattact cctattactg tgatgaacat 1080 tttgagactc cgtcaggaag ttactgggat cacattcatt gcacacaaga tggatggtcg 1140 ccagcagtac catgcctcag aaaatgttat tttccttatt tggaaaatgg atataatcaa 1200 aattatggaa gaaagtttgt acagggtaaa tctatagacg ttgcctgcca tcctggctac 1260 gctcttccaa aagcgcagac cacagttaca tgtatggaga atggctggtc tcctactccc 1320 agatgcatcc gtgtcaaaac atgttccaaa tcaagtatag atattgagaa tgggtttatt 1380 tctgaatctc agtatacata tgccttaaaa gaaaaagcaa aatatcaatg caaactagga 1440 tatgtaacag cagatggtga aacatcagga tcaattacat gtgggaaaga tggatggtca 1500 gctcaaccca cgtgcattaa atcttgtgat atcccagtat ttatgaatgc cagaactaaa 1560 aatgacttca catggtttaa gctgaatgac acattggact atgaatgcca tgatggttat 1620 gaaagcaata ctggaagcac cactggttcc atagtgtgtg gttacaatgg ttggtctgat 1680 ttacccatat gttatgaaag agaatgcgaa cttcctaaaa tagatgtaca cttagttcct 1740 gatcgcaaga aagaccagta taaagttgga gaggtgttga aattctcctg caaaccagga 1800 tttacaatag ttggacctaa ttccgttcag tgctaccact ttggattgtc tcctgacctc 1860 ccaatatgta aagagcaagt acaatcatgt ggtccacctc ctgaactcct caatgggaat 1920 gttaaggaaa aaacgaaaga agaatatgga cacagtgaag tggtggaata ttattgcaat 1980 cctagatttc taatgaaggg acctaataaa attcaatgtg ttgatggaga gtggacaact 2040 ttaccagtgt gtattgtgga ggagagtacc tgtggagata tacctgaact tgaacatggc 2100 tgggcccagc tttcttcccc tccttattac tatggagatt cagtggaatt caattgctca 2160 gaatcattta caatgattgg acacagatca attacgtgta ttcatggagt atggacccaa 2220 cttccccagt gtgtggcaat agataaactt aagaagtgca aatcatcaaa tttaattata 2280 cttgaggaac atttaaaaaa caagaaggaa ttcgatcata attctaacat aaggtacaga 2340 tgtagaggaa aagaaggatg gatacacaca gtctgcataa atggaagatg ggatccagaa 2400 gtgaactgct caatggcaca aatacaatta tgcccacctc cacctcagat tcccaattct 2460 cacaatatga caaccacact gaattatcgg gatggagaaa aagtatctgt tctttgccaa 2520 gaaaattatc taattcagga aggagaagaa attacatgca aagatggaag atggcagtca 2580 ataccactct gtgttgaaaa aattccatgt tcacaaccac ctcagataga acacggaacc 2640 attaattcat ccaggtcttc acaagaaagt tatgcacatg ggactaaatt gagttatact 2700 tgtgagggtg gtttcaggat atctgaagaa aatgaaacaa catgctacat gggaaaatgg 2760 agttctccac ctcagtgtga aggccttcct tgtaaatctc cacctgagat ttctcatggt 2820 gttgtagctc acatgtcaga cagttatcag tatggagaag aagttacgta caaatgtttt 2880 gaaggttttg gaattgatgg gcctgcaatt gcaaaatgct taggagaaaa atggtctcac 2940 cctccatcat gcataaaaac agattgtctc agtttaccta gctttgaaaa tgccataccc 3000 atgggagaga agaaggatgt gtataaggcg ggtgagcaag tgacttacac ttgtgcaaca 3060 tattacaaaa tggatggagc cagtaatgta acatgcatta atagcagatg gacaggaagg 3120 ccaacatgca gagacacctc ctgtgtgaat ccgcccacag tacaaaatgc ttatatagtg 3180 tcgagacaga tgagtaaata tccatctggt gagagagtac gttatcaatg taggagccct 3240 tatgaaatgt ttggggatga agaagtgatg tgtttaaatg gaaactggac ggaaccacct 3300 caatgcaaag attctacagg aaaatgtggg ccccctccac ctattgacaa tggggacatt 3360 acttcattcc cgttgtcagt atatgctcca gcttcatcag ttgagtacca atgccagaac 3420 ttgtatcaac ttgagggtaa caagcgaata acatgtagaa atggacaatg gtcagaacca 3480 ccaaaatgct tacatccgtg tgtaatatcc cgagaaatta tggaaaatta taacatagca 3540 ttaaggtgga cagccaaaca gaagctttat tcgagaacag gtgaatcagt tgaatttgtg 3600 tgtaaacggg gatatcgtct ttcatcacgt tctcacacat tgcgaacaac atgttgggat 3660 gggaaactgg agtatccaac ttgtgcaaaa agatag 3696 <210> 3 <211> 507 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of deletion form of CFH <400> 3 Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala 35 40 45 Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Ile Ile Met 50 55 60 Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys 65 70 75 80 Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr 100 105 110 Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu 115 120 125 Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val 130 135 140 Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser 145 150 155 160 Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe 165 170 175 Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys 180 185 190 Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile 195 200 205 Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys 210 215 220 Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly 225 230 235 240 Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp 245 250 255 Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile 260 265 270 Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp 275 280 285 Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly 290 295 300 Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys 305 310 315 320 Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn Ala Tyr Ile Val 325 330 335 Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg Val Arg Tyr Gln 340 345 350 Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu Val Met Cys Leu 355 360 365 Asn Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr Gly Lys 370 375 380 Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro 385 390 395 400 Leu Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys Gln Asn 405 410 415 Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg Asn Gly Gln 420 425 430 Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val Ile Ser Arg Glu 435 440 445 Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr Ala Lys Gln Lys 450 455 460 Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val Cys Lys Arg Gly 465 470 475 480 Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr Thr Cys Trp Asp 485 490 495 Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg 500 505 <210> 4 <211> 1524 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of deletion form of CFH <400> 4 atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 60 tgcaatgaac ttcctccaag aagaaataca gaaattctga caggttcctg gtctgaccaa 120 acatatccag aaggcaccca ggctatctat aaatgccgcc ctggatatag atctcttgga 180 aatataataa tggtatgcag gaagggagaa tgggttgctc ttaatccatt aaggaaatgt 240 cagaaaaggc cctgtggaca tcctggagat actccttttg gtacttttac ccttacagga 300 ggaaatgtgt ttgaatatgg tgtaaaagct gtgtatacat gtaatgaggg gtatcaattg 360 ctaggtgaga ttaattaccg tgaatgtgac acagatggat ggaccaatga tattcctata 420 tgtgaagttg tgaagtgttt accagtgaca gcaccagaga atggaaaaat tgtcagtagt 480 gcaatggaac cagatcggga ataccatttt ggacaagcag tacggtttgt atgtaactca 540 ggctacaaga ttgaaggaga tgaagaaatg cattgttcag acgatggttt ttggagtaaa 600 gagaaaccaa agtgtgtgga aatttcatgc aaatccccag atgttataaa tggatctcct 660 atatctcaga agattattta taaggagaat gaacgatttc aatataaatg taacatgggt 720 tatgaataca gtgaaagagg agatgctgta tgcactgaat ctggatggcg tccgttgcct 780 tcatgtgaag aaaaatcatg tgataatcct tatattccaa atggtgacta ctcaccttta 840 aggattaaac acagaactgg agatgaaatc acgtaccagt gtagaaatgg tttttatcct 900 gcaacccggg gaaatacagc caaatgcaca agtactggct ggatacctgc tccgagatgt 960 gacacctcct gtgtgaatcc gcccacagta caaaatgctt atatagtgtc gagacagatg 1020 agtaaatatc catctggtga gagagtacgt tatcaatgta ggagccctta tgaaatgttt 1080 ggggatgaag aagtgatgtg tttaaatgga aactggacgg aaccacctca atgcaaagat 1140 tctacaggaa aatgtgggcc ccctccacct attgacaatg gggacattac ttcattcccg 1200 ttgtcagtat atgctccagc ttcatcagtt gagtaccaat gccagaactt gtatcaactt 1260 gagggtaaca agcgaataac atgtagaaat ggacaatggt cagaaccacc aaaatgctta 1320 catccgtgtg taatatcccg agaaattatg gaaaattata acatagcatt aaggtggaca 1380 gccaaacaga agctttattc gagaacaggt gaatcagttg aatttgtgtg taaacgggga 1440 tatcgtcttt catcacgttc tcacacattg cgaacaacat gttgggatgg gaaactggag 1500 tatccaactt gtgcaaaaag atag 1524 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 5 tagcggccgc catgagactt ctagcaaag 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PCR <400> 6 cgcctcgagc tatctttttg cacaagttgg 30 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCR 1 F primer <400> 7 tagcggccgc catgagactt ctagcaaaga ttatt 35 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCR 5(18) B primer <400> 8 acaggaggtg tcacatctcg gagcaggtat 30 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCR 18(5) F primer <400> 9 gctccgagat gtgacacctc ctgtgtgaat c 31 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCR 20 B primer <400> 10 cgcctcgagc tatctttttg cacaagttgg 30 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE F primer <400> 11 cactcgagaa tcaacctctg gat 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE B primer <400> 12 attctagacg aagacgcgga ag 22

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는, 결실형 인간 보체 인자 H(dCFH).
  5. 제4항의 결실형 인간 보체 인자 H를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 서열번호 4의 염기 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제5항 또는 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
  8. 제7항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 형질전환체가 포유동물 세포주인 것을 특징으로 하는, 형질전환체.
  10. 제8항의 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 결실형 인간 보체 인자 H의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배양 단계 이후에 배지 중에 생산된 결실형 인간 보체 인자 H를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 결실형 인간 보체 인자 H의 생산 방법.
  12. 제4항의 결실형 인간 보체 인자 H를 유효성분으로 포함하는, 면역관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 면역관련 질환이 막성증식형신염 타입 II(membranoproliferative glomerulonephritis type II, MPGN type II), 비전형적 용혈성 요독 증후군(atypical hemolytic uremic syndrome, aHUS) 또는 노인황반변성(age-related macular degeneration, AMD)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  13. 삭제
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