CN109136170A - 一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用，属于鲤鱼细胞培养技术领域。为了解决鲤鱼三倍体细胞生长需求的问题，本发明提供了一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，所述无血清培养基包括DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素，所述培养添加剂包括重组人胰岛素样生长因子‑1、重组人碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、纤粘连蛋白、非必需氨基酸和4‑羟乙基哌嗪乙磺酸。本发明能减少了细胞污染，简化提纯和鉴定各种细胞产物的程序，适用于鲤鱼三倍体细胞的培养。

Description

一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用
技术领域
本发明涉及鲤鱼细胞培养技术领域，具体涉及一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用。
背景技术
细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。体外培养细胞在使用合成培养基时需要添加一些天然成分，其中最重要的是血清，血清所含成分复杂，不同批次血清间的生物活性和因子的不一致，导致产品和实验结果的重现性差，需要大量验证工作；血清存在污染外源病毒和致病因子的风险，容易被病毒和支原体感染；含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，影响细胞生长和细胞某些功能的表达，对某些细胞的体外培养有去分化作用。
市面上出售的培养基的组成成分，建立在对不同细胞系生长的研究之上的。三倍体细胞相对于二倍体细胞，具有细胞体积大、营养需求量大的特点，实验人员曾用市面上的培养基对三倍体细胞进行培养，会出现细胞生长缓慢、贴壁率低、传代时间长等问题，不利于三倍体细胞的培养。目前并没有专门针对鲤鱼三倍体体细胞培养的专用培养基，不能完全满足三倍体体细胞的生长要求，对三倍体体细胞的培养效果总是不很理想。
发明内容
为了解决鲤鱼三倍体细胞生长需求的问题，本发明提供了一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，所述无血清培养基包括DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素，所述培养添加剂包括重组人胰岛素样生长因子-1、重组人碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、纤粘连蛋白、非必需氨基酸和4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
进一步地限定，所述无血清培养基由DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素组成，所述培养添加剂中各成分及含量为：重组人胰岛素样生长因子-1为0.21-0.35μg、重组人碱性成纤维细胞生长因子0.24-0.33μg、血小板源性生长因子0.20-0.27μg、牛血清白蛋白4.71-5.90mg、牛转铁蛋白6.30-7.51mg、纤粘连蛋白0.81-1.32mg、非必需氨基酸1.90-2.51mg和4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.303-2.402g，所述含量为各成分在每升无血清培养基中的含量。
优选地，所述培养添加剂中各成分及含量为：重组人胰岛素样生长因子-1为0.30μg、重组人碱性成纤维细胞生长因子0.30μg、血小板源性生长因子0.22μg、牛血清白蛋白5.3mg、牛转铁蛋白6.8mg、纤粘连蛋白1.0mg、非必需氨基酸2.2mg和4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.383g，所述含量为各成分在每升无血清培养基中的含量。
进一步地限定，所述抗生素为青霉素和链霉素，所述青霉素在每升无血清培养基中的终浓度为100U/mL，所述链霉素在每升无血清培养基中的终浓度为100U/mL。
本发明还提供了所述的适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，在鲤鱼三倍体细胞培养中的应用。
所述鲤鱼三倍体细胞培养方法如下：
1)原代细胞的培养：采用组织块贴壁法对三倍体鲤鱼细胞进行原代细胞的培养；
2)传代细胞培养法：长满单层后进行传代培养，用胰蛋白酶消化液消化细胞系，弃掉消化液，加入完全培养液，将细胞吹散成单个后继续培养，细胞贴壁后换液去除死细胞，长满单层后继续传代培养；
3)无血清培养基培养：传代至鲤鱼三倍体细胞性状稳定，将细胞置于无血清培养基中培养。
进一步地限定，步骤1)所述组织贴壁法对三倍体鲤鱼细胞进行原代细胞的培养是指将三倍体鲤鱼尾鳍组织经灭菌后，23℃倒置培养12h，然后加入完全培养液正置培养。
进一步地限定，步骤2)所述胰蛋白酶消化液中胰蛋白酶质量分数为0.25％，消化时间为2min。
进一步地限定，步骤3)中鲤鱼三倍体细胞培养是置于细胞板中，每个孔中接种细胞1x105个，加入2.5ml无血清培养基，23℃培养，每天换液。
有益效果
1)无血清培养基是未来细胞培养的趋势，本发明无血清细胞培养添加剂的使用，添加剂成分确定，使用安全性高，全合成配方，无批间差异，培养条件容易保持一致，保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。
2)该培养基配方制作简便，成本低，降低了细胞培养的成本。
3)可以提高鲤鱼三倍体细胞原代培养的贴壁率，促进细胞生长，缩短传代时间，提高细胞得率。
采用本发明所述的无血清培养基培养鲤鱼三倍体细胞，能够满足三倍体细胞生长需要，保持快速的生长和增殖特性，2～3天传代一次，三倍体细胞健康良好生长，得到数量更多，纯度更高的细胞。本培养基对细胞的生长无毒、无抑制作用，不影响细胞的生长和功能的表达，具有安全稳定的优点。
附图说明
图1鲤鱼二倍体和三倍体红细胞直径与体积，a为鲤鱼二倍体细胞，b为鲤鱼三倍体细胞。
图2鲤鱼二倍体、三倍体细胞染色体中期分裂相，左为二倍体鲤鱼细胞，右为三倍体鲤鱼细胞。
图3鲤鱼三倍体与二倍体的细胞核DNA含量，横坐标为DNA相对含量，单位为ng/ul，纵坐标为细胞数目，鸡红细胞为对照。
图4完全培养基培养第4天的鲤鱼三倍体细胞(×400)H.E.染色。
图5无血清培养基培养第4天的鲤鱼三倍体细胞(×400)H.E.染色。
图6不同培养基培养下的鲤鱼三倍体细胞的生长曲线。
具体实施方式
所述完全培养基：DMEM培养基中添加质量含量为10％的胎牛血清、10mmol/L的HEPES、100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，所述浓度均为终浓度。调节PH至7.4，0.22μm微孔滤膜除菌，4℃冷藏备用。
所述基础培养基组：DMEM培养基中添加10mmol/L的HEPES、100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，所述浓度均为终浓度。调节PH至7.4，0.22μm微孔滤膜除菌，4℃冷藏备用。
所述DMEM基础培养基为低糖基础培养基，购买自GIBCO。
下述实施例所用到的二倍体鲤体细胞和三倍体鲤体细胞取自本实验室细胞培养中心。
本发明所述的所有药品均购自GIBCO。
实施例1.适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基。
本实施例所述的适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，由DMEM低糖基础培养基、抗生素和培养添加剂组成，每升无血清培养基中培养添加剂的含量如下表1所示：
表1无血清培养基中的培养添加剂含量
所述抗生素为青霉素和链霉素，每升无血清培养基中青霉素的终浓度为100U/mL，链霉素的终浓度为100U/mL。
所述适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基的配制方法如下：
(1)将本发明无血清培养基用的培养添加剂，各成分按剂量置于容器中，向容器中加入约300毫升蒸馏水，于室温下混合溶解，再加入适量的蒸馏水，混合均匀后待用；
(2)将100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，加入到(1)步骤的溶液中，充分混匀，直至全部溶解，加入DMEM基础培养基干粉，所述DMEM培养基购买自GIBCO，按照产品使用说明书定容至1000mL，用质量分数为5.6％的NaHCO3调节PH至7.4，然后经0.22μm微孔滤膜除菌，4℃冷藏备用。
实施例2.适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基。
重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例所述的无血清培养基配方中的培养添加剂的含量如下表2所示：
表2无血清培养基中的培养添加剂含量
编号 添加剂成分 终含量
1 重组人胰岛素样生长因子-1(Insulin-liked Growth Factor-1) 0.35μg
2 重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF) 0.33μg
3 血小板源性生长因子B(PDGF-B) 0.27μg
4 牛血清白蛋白(bovine serum albumin-V) 5.90mg
5 牛转铁蛋白 7.51mg
6 纤粘连蛋白 1.32mg
7 非必需氨基酸 2.51mg
8 Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸) 2.402g
实施例3.适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基。
重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例所述的无血清培养基配方中的培养添加剂的含量如下表3所示：
表3无血清培养基中的培养添加剂含量
编号 添加剂成分 终含量
1 重组人胰岛素样生长因子-1(Insulin-liked Growth Factor-1) 0.21μg
2 重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF) 0.24μg
3 血小板源性生长因子B(PDGF-B) 0.20μg
4 牛血清白蛋白(bovine serum albumin-V) 4.71mg
5 牛转铁蛋白 6.30mg
6 纤粘连蛋白 0.81mg
7 非必需氨基酸 1.90mg
8 Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸) 2.303g
实施例4.利用无血清培养基培养鲤鱼三倍体细胞的方法。
1)细胞系的培养：采用组织块贴壁法对鲤鱼三倍体红细胞的原代细胞进行培养，将三倍体鲤鱼浸泡在0.1％高锰酸钾中0.5h，用纱布擦去周身粘液后用流水冲洗，清洗干净后用纱布包好，带入无菌室。在无菌工作台上，用酒精棉球反复擦拭所取尾鳍组织3-4次，用灭菌手术剪刀剪下尾鳍组织，用镊子夹住，在75％酒精中漂洗5～10s，马上转移到准备好的Hanks液中洗3-4遍，最后用完全培养液清洗一遍，用灭菌手术剪将组织块剪成1mm3左右小块，摆放进培养瓶中，用镊子均匀铺开，放入培养箱23℃倒置培养，过12h加入培养液，正置静置培养。
2)传代细胞培养法：细胞长满单层就可进行传代培养，方法是：用质量分数为0.25％胰蛋白酶消化2min，倒掉胰酶，加入完全培养基，用吸管吸取培养液，轻轻吹到培养瓶壁上，将鲤鱼三倍体红细胞细胞吹散成单个(前几代原瓶培养，待稳定后可分瓶)，放入培养箱内23℃继续培养，细胞贴壁后换液去除死细胞，长满单层后可继续传代培养。传过5代的细胞，性状稳定，可以扩大培养，建立细胞系。
所述完全培养液为DMEM培养基中添加质量含量为10％的胎牛血清、10mmol/L的HEPES、100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，所述各浓度为终浓度。
3)无血清培养基培养：传过5代后，细胞生长稳定，将鲤鱼三倍体红细胞接种于6孔板中培养，每孔接种细胞1x105个，每孔加入实施例1所述的2.5mL无血清培养基，23℃细胞培养箱中培养，每天换液。
对比例1：利用无血清培养基培养鲤鱼二倍体细胞的培养方法。
重复实施例4，本对比例与实施例4的不同在于，本对比例所述的要培养的细胞为鲤鱼二倍体细胞。
对比例2.利用完全培养基培养鲤鱼三倍体细胞的方法。
重复实施例4，本对比例与实施例4的不同在于，本对比例步骤3)中所述的培养基为完全培养基。
对比例3.利用完全培养基培养鲤鱼二倍体细胞的方法。
重复实施例4，本对比例与实施例4的不同在于，本对比例步骤3)中所述培养的细胞为鲤鱼二倍体细胞。
对比例4.利用基础培养基培养鲤鱼三倍体细胞的方法。
重复实施例4，本对比例与实施例4的不同在于，本对比例步骤3)中所述的培养基为基础培养基。
对比例5.利用基础培养基培养鲤鱼二倍体细胞的方法。
重复实施例4，本对比例与实施例4的不同在于，本对比例步骤3)中所述培养的细胞为鲤鱼二倍体细胞。
一、细胞形态学观察：用倒置显微镜观察并记录各时间段的细胞生长情况和形态变化。
1.无血清培养基培养下的二倍体鲤鱼细胞与三倍体鲤鱼细胞细胞遗传学观察：
结果如图1所示，对比例1中的鲤鱼二倍体与实施例4中的鲤鱼三倍体红细胞直径比值为1:1.63；鲤鱼二倍体红细胞细胞核与鲤鱼三倍体红细胞细胞核体积比值为1:1.56。
2.不同培养基下三倍体细胞的形态和密度：
在400×的相差显微镜下观察分别使用完全培养基(对比例2)和无血清培养基(实施例4)的三倍体细胞，细胞多为梭形、长条形、多角形、多边形或不规则形，胞质近中央处有椭圆形细胞核，细胞之间排列疏松，细胞的直径约为26～42μm，呈典型成纤维细胞样，2组对比细胞形态结构无差异，采用本发明所述的无血清培养基的三倍体细胞明显贴壁数量增大，2～3天传代一次，细胞倍增时间为20～25小时，保持快速的生长和增殖特性，如图4，图5所示。
综上所述，在本发明所述的无血清培养基培养下的三倍体鲤鱼体细胞与二倍体的鲤鱼体细胞，细胞直径、细胞体积、染色体数目及DNA含量上均有显著性差异。细胞体积的不同导致对营养的需求不同，在完全培养基和本发明所述的无血清培养基培养下，三倍体鲤鱼体细胞的贴壁数量明显不同，本添加剂培养基下，贴壁数量显著增加。
三倍体细胞与二倍体细胞不同培养基贴壁率统计：
取24孔培养板，分别加入三组不同培养基，分别培养二倍体细胞与三倍体细胞，每组用3个孔，每孔接种细胞1x105个，放置于培养箱中培养4h，弃去培养液，使用本领域通用的PBS缓冲液(pH7.2～7.4)冲洗，然后消化并收集，计数统计，见表3：
表3不同培养基下细胞贴壁率检测结果
组2完全培养基组中，二倍体鲤鱼细胞的贴壁数显著多于三倍体鲤鱼细胞，完全培养基不能满足三倍体鲤鱼细胞的生长，更适用于二倍体鲤鱼细胞的培养；组1本发明实验组中，三倍体鲤鱼细胞的贴壁数显著高于组2，无血清培养基能显著促进三倍体鲤鱼细胞的贴壁数；组1和组2的结果显示，本发明所述的无血清培养基对二倍体鲤鱼细胞的贴壁数没有显著影响。
二、染色体组型分析：依据中华人民共和国国家标准GB/T 18654.12-2002(养殖鱼类种质检验第12部分染色体组型分析)进行检测。
图2所示为经本发明所述的无血清培养基培养的二倍体、三倍体鲤鱼红细胞染色体中期分裂相，二倍体鲤鱼红细胞染色体数目为2n＝100，三倍体鲤鱼红细胞染色体数目为3n＝150，二倍体鲤鱼红细胞和三倍体鲤鱼红细胞染色体数目上有显著差异，与理论预期相符。
图3所示为经本发明所述的无血清培养基培养的三倍体鲤鱼红细胞与二倍体鲤鱼红细胞的细胞核DNA含量，所述三倍体鲤鱼细胞与二倍体鲤鱼细胞的细胞核DNA含量比值约为1:1.58，与红细胞直径、体积及染色体数目呈正相关，以鸡红细胞为对照。
三、细胞生长曲线观察：
将各组培养基单独稳定培养的1×105细胞接种于6孔板中，2.5mL培养基，23℃细胞培养箱中培养，每天换液。24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取3复孔，分别进行计数。计算平均值。连续计数7d。根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。
二倍体鲤鱼细胞与三倍体鲤鱼细胞生长曲线分析：
三组培养基下三倍体鲤体细胞生长曲线如图6，在完全培养基培养下，细胞生长至第5天开始下降，细胞峰值出现于第5天，细胞数为(2.72±0.3)×106；实施例4中培养的三倍体鲤鱼细胞，从第2天开始，细胞密度明显高于对比例2和对比例4，具显著性意义(P>0.05)，峰值出现于第7天，为(3.68±0.8)×106，显著高于对比例2和对比例4。
综上所述，采用本发明所述的无血清培养基培养鲤鱼三倍体细胞，能够满足三倍体细胞生长需要，保持快速的生长和增殖特性，2～3天传代一次，三倍体细胞健康良好生长，得到数量更多，纯度更高的细胞。本培养基对细胞的生长无毒、无抑制作用，不影响细胞的生长和功能的表达，具有安全稳定的优点。

Claims (8)

1.一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包括DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素，所述培养添加剂包括重组人胰岛素样生长因子-1、重组人碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、纤粘连蛋白、非必需氨基酸和4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
2.根据权利要求1所述的适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基由DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素组成，所述培养添加剂中各成分及含量为：重组人胰岛素样生长因子-1为0.21-0.35μg、重组人碱性成纤维细胞生长因子0.24-0.33μg、血小板源性生长因子0.20-0.27μg、牛血清白蛋白4.71-5.90mg、牛转铁蛋白6.30-7.51mg、纤粘连蛋白0.81-1.32mg、非必需氨基酸1.90-2.51mg和4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.303-2.402g，所述含量为各成分在每升无血清培养基中的含量。
3.根据权利要求2所述的适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，其特征在于，所述培养添加剂中各成分及含量为：重组人胰岛素样生长因子-1为0.30μg、重组人碱性成纤维细胞生长因子0.30μg、血小板源性生长因子0.22μg、牛血清白蛋白5.3mg、牛转铁蛋白6.8mg、纤粘连蛋白1.0mg、非必需氨基酸2.2mg和4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.383g，所述含量为各成分在每升无血清培养基中的含量。
4.权利要求1-3任意一项所述的无血清培养基在鲤鱼三倍体细胞培养中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述鲤鱼三倍体细胞培养方法如下：
1)原代细胞的培养：采用组织块贴壁法对三倍体鲤鱼细胞进行原代细胞的培养；
2)传代细胞培养法：长满单层后进行传代培养，用胰蛋白酶消化液消化细胞系，弃掉消化液，加入完全培养液，将细胞吹散成单个后继续培养，细胞贴壁后换液去除死细胞；长满单层后继续传代培养；
3)无血清培养基培养：传代至鲤鱼三倍体细胞性状稳定，将细胞置于无血清培养基中培养。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤1)所述组织贴壁法对三倍体鲤鱼细胞进行原代细胞的培养是指将三倍体鲤鱼尾鳍组织经灭菌后，23℃倒置培养12h，然后加入完全培养液正置培养。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)所述胰蛋白酶消化液中胰蛋白酶质量分数为0.25％，消化时间为2min。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤3)中鲤鱼三倍体细胞培养是置于细胞板中，每个孔中接种细胞1x105个，加入2.5ml无血清培养基，23℃培养，每天换液。
CN201810949374.6A 2018-08-20 2018-08-20 一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用 Active CN109136170B (zh)

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