CN106939318A - 一种单细胞克隆分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种单细胞克隆分离方法，特别是一种贴壁生长的动物细胞进行单细胞克隆分离的方法，本发明在单细胞克隆分离过程中，创新地使用中性红溶液对细胞进行短时间染色，使得细胞小团快速着色，肉眼易见，提高操作准确性；本发明在细胞团挑取过程中，使用较低浓度的胰酶溶液，不仅能使细胞从器皿壁上脱落下来，又能减少对细胞损伤，有利于细胞的存活和增殖；本发明使用手动移液器吸取少量胰酶，局部消化细胞小团的方法，与传统的克隆环法相比步骤简化，且无需购买特殊材料‑‑克隆环；与有限稀释法比，更有利于细胞的生长，避免了很多细胞不能在独立环境中单个生长的问题；与借助显微镜的方法比较，操作方便，大大减少污染的几率。

Description

一种单细胞克隆分离方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及贴壁生长的动物细胞进行单细胞克隆分离的一种新方法。
背景技术
单细胞克隆是由单个细胞进行分裂、增殖，形成具有相同遗传性状的细胞群体。由于来源于同一个祖先细胞，扩增形成的细胞群还具有十分相近的形态特征和基本一致的生理、生化特性。
单细胞克隆是建立稳定细胞系的重要环节，因而在现代生物技术和医药研发领域中应用广泛。构建稳定细胞系的常用方法有质粒转染法和病毒侵染法，两种方法都需要借助抗生素筛选，通过单细胞克隆分离最终获得表型稳定、遗传特性一致的细胞群。质粒转染法是通过转染试剂将质粒DNA导入细胞，其中极少部分DNA会整合到基因组，通过单细胞克隆分离和抗生素筛选，获得表达效率高、整合稳定的细胞群，最终构建成稳定细胞系；而病毒侵染法则是通过将携带目的片段的病毒，常用的如慢病毒，转导入细胞，再通过单细胞克隆和抗生素筛选，获得稳定细胞系。
目前常规的单细胞克隆分离技术主要包括有限稀释法、克隆环法和显微操作法。有限稀释法是通过将细胞悬液连续梯度稀释，使最终在细胞培养板的一个孔中仅有1个细胞，再经过两周左右时间增殖，形成细胞群，再经过验证获得稳定克隆；克隆环法是通过在10-15cm的细胞培养皿中，将细胞接种低密度,使分散的单个细胞各自增殖成细胞群，用克隆环方式与周围的细胞隔离开，通过胰酶消化，转到新的孔板中继续培养扩增，并检测验证而获得稳定克隆；显微操作法是借助显微镜，在放大的视野下挑取单细胞，再转至培养孔中，逐渐扩增获得单克隆。
这三种方法有各自一定的局限性：有限稀释法对悬浮细胞较为合适，但是实际中贴壁细胞的需求占绝大多少，而且很多细胞在极低密度下生长极慢甚至不能生长，无法进行单细胞克隆；克隆环法不仅需要购买克隆环，而且因为细胞数量较少时肉眼难辨，必须等到细胞数量扩增到几百时才能进行分离，因此需要等待较长时间，而且操作步骤多、难度大，实验人员通常需要有丰富经验；显微操作法需要借助昂贵的特殊显微镜或将常规显微镜搬至安全柜内使用，操作难度加大，而且易造成细胞污染而前功尽弃。
本发明涉及到的染色试剂中性红(Neutral red)，学名“3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐”，是一种碱性吩嗪染料，常作为酸碱指示剂使用，变色范围在pH6.4-8.0之间(由红变黄)；在组织和细胞实验中通常用于细胞核和溶酶体的染色。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便有效，无需昂贵的设备就能实现的单细胞克隆分离方法。
本发明的技术方案为：
一种单细胞克隆分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养细胞：在培养箱中用适合待培养细胞的基础培养液培养细胞，培养温度为37℃，培养箱中控制二氧化碳含量为5％；细胞控制密度不超过90％，传代用0.25％胰酶，消化时间根据各细胞的具体特点调整，常规为1-2分钟；
2)质粒转染细胞：将对数生长期的细胞铺板，过夜后用脂质体转染试剂进行转染，4-6小时后换成完全培养液；
3)病毒侵染细胞：将对数生长期的细胞铺板，过夜后加入病毒液，病毒液的用量按照该细胞的病毒侵染参数(即MOI值)，侵染6小时至12小时，换成新鲜完全培养液；
4)加抗生素筛选：对(2)和(3)步骤中的细胞换液后，继续培养48小时，加入对应的抗生素，浓度参考该细胞的抗生素耐受浓度；1-2周后将细胞传代，计数并接种至新10cm皿中，使每个皿中细胞数100-200个；
5)再经过1-2周后，观察细胞克隆小团，一般在细胞数达到30-100个可进行克隆挑选：用中性红溶液对细胞染色1-3分钟，用移液器吸取少量低浓度胰酶，局部消化克隆团，将细胞吸至96孔板；
6)逐级扩大培养，直至细胞增殖至6孔板的一个孔长满；
7)进行目的基因表达检测，确认克隆细胞。
步骤1)所述的常规的基础培养液包括DMEM、1640等培养液，且需要加入10％胎牛血清和1％的青链霉素。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：
1.本发明在单细胞克隆分离过程中，创新地使用中性红溶液对细胞进行短时间染色，使得细胞小团快速着色，肉眼易见，提高操作准确性；
2.本发明在细胞团挑取过程中，使用较低浓度的胰酶溶液，不仅能使细胞从器皿壁上脱落下来，又能减少对细胞损伤，有利于细胞的存活和增殖；
3.本发明使用手动移液器吸取少量胰酶，局部消化细胞小团的方法，与传统的克隆环法相比步骤简化，且无需购买特殊材料--克隆环；与有限稀释法比，更有利于细胞的生长，避免了很多细胞不能在独立环境中单个生长的问题；与借助显微镜的方法比较，操作方便，大大减少污染的几率。
具体实施方式
实施例1：用质粒转染293细胞并构建单克隆细胞系
1.培养293细胞：将冻存的293细胞复苏，培养于DMEM+10％胎牛血清+1％青链霉素的完全培养基，置于含5％CO2的37℃培养箱培养；
2.转染前一天，将状态良好的细胞以6孔板每孔5*105数量接种；第二天用脂质体转染，常用的有Invitrogen公司的Lipofectamine 2000。
3.转染当天，将6孔板每孔换新鲜DMEM完全培养液，每孔2ml，取2个EP管，分别标记为A管和B管。A管：250ul无血清DMEM+4ug质粒DNA；B管：250ul无血清DMEM+10ulLipofectamine 2000。B管混匀后静置5分钟，再将A管液体加至B管中，混匀，静置15分钟后加至上述换液后的6孔板中，转染后5-6小时换成DMEM+10％胎牛血清的完全培养基，再以37℃CO2培养箱中温育48小时。
4.将细胞传至10cm细胞培养皿：将6孔板中细胞用PBS洗一次，加入300ul 0.25％胰酶消化1分钟，用600ul完全培养液终止消化，2000rpm 2分钟离心后，将细胞用完全培养液重悬，稀释后接种到10cm皿中，使每个10cm皿中细胞数约100左右，同时在培养液中加入该载体对应的抗生素以杀死未导入质粒的阴性细胞。
5.单细胞克隆的分离：上述细胞生长1-2周后，10cm培养皿中会出现显微镜下可见的293细胞小群，每个小群细胞含有几十个细胞(通常在30-100个范围)。(1)用PBS溶液洗一遍；(2)加入中性红溶液使终浓度为20ug/ml，37度二氧化碳培养箱静置3分钟,可看到细胞染成较明显的红色；(3)弃去中性红溶液，PBS洗一次，吸尽；(4)用移液器吸5ul 0.05％胰酶，局部消化细胞小团，并将细胞吸至预先加入完全培养液的96孔板中，37度培养。
6.扩增培养：每隔2-3天观察96孔板中细胞，至生长满整个孔。再用常规胰酶消化、传代方法将细胞接种至24孔板；长满后再接种至6孔板。
7.基因表达检测：取2*105细胞按照常规方法抽提RNA，再进行反转录合成cDNA，进行荧光定量PCR检测，确定每个克隆中特定基因的表达量。
我们采用本方法进行单细胞克隆分离，成功构建稳定细胞系，基因水平比对照细胞高500倍以上，达到预期目标。
实施例2：用慢病毒侵染NIH-3T3细胞并构建单克隆细胞系
1.培养NIH-3T3细胞：将冻存在液氮中的NIH-3T3细胞复苏，培养于DMEM+10％胎牛血清+1％青链霉素的完全培养基，置于含5％CO2的37℃培养箱培养；
2.侵染前准备：将状态良好的细胞用0.25％胰酶消化，计数，以6孔板每孔3*105数量接种；
3.侵染：侵染所用慢病毒为本公司产品(PDS019)，滴度为1*108TU/ml。向3*105细胞数的6孔板中加入30ul病毒液和终浓度8ug/ml的polybrene，混匀后静置于37度细胞培养箱，6小时后换新鲜培养液，再置于37℃CO2培养箱培养48小时。
4.将细胞传至10cm细胞培养皿：将6孔板中细胞用PBS洗一次，加入300ul 0.25％胰酶消化1分钟，用600ul完全培养液终止消化，2000rpm 2分钟离心后，将细胞用完全培养液重悬，计数，根据细胞数量，将细胞液稀释后接种到10cm皿中，使每个10cm皿中细胞数约100左右，同时在培养液中加入对应的抗生素杀稻瘟菌素，使终浓度2ug/ml，以杀死未侵染慢病毒的阴性细胞。
5.单细胞克隆的分离：上述细胞生长1-2周后，10cm培养皿中会出现显微镜下可见的小细胞群，每个小群细胞含有几十个细胞(通常在30-100个范围)。克隆的分离采用以下步骤：(1)弃去培养液，用PBS溶液洗一遍；(2)加入中性红溶液使终浓度为40ug/ml，37度二氧化碳培养箱静置2分钟,可看到细胞染成较明显的红色；(3)弃去中性红溶液，PBS洗一次，吸尽；(4)用移液器吸5ul 0.05％胰酶，局部消化细胞小团，并将细胞吸至预先加入完全培养液的96孔板中，37度培养。
6.扩增培养：每隔2-3天观察96孔板中细胞，至生长满整个孔。再用常规胰酶消化、传代方法将细胞接种至24孔板；随后再扩大培养至6孔板。
7.基因表达检测：荧光显微镜下观察抗生素筛选后细胞，是否有GFP荧光，也可以取2*105细胞按照常规方法抽提DNA，再用荧光定量PCR检测GFP的表达。
我们采用慢病毒侵染、抗性筛选并结合单细胞克隆分离方法，成功完成稳定的单克隆细胞系构建，通过扩增特定序列，验证了细胞基因组中含有病毒载体携带的目的基因。

Claims (2)

1.一种单细胞克隆分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养细胞：在培养箱中用适合待培养细胞的基础培养液培养细胞，培养温度为37℃，培养箱中控制二氧化碳含量为5％；细胞控制密度不超过90％，传代用0.25％胰酶，消化时间根据各细胞的具体特点调整，常规为1-2分钟；
2)质粒转染细胞：将对数生长期的细胞铺板，过夜后用脂质体转染试剂进行转染，4-6小时后换成完全培养液；
3)病毒侵染细胞：将对数生长期的细胞铺板，过夜后加入病毒液，病毒液的用量按照该细胞的病毒侵染参数，侵染6小时至12小时，换成新鲜完全培养液；
4)加抗生素筛选：对(2)和(3)步骤中的细胞换液后，继续培养48小时，加入对应的抗生素，浓度参考该细胞的抗生素耐受浓度；1-2周后将细胞传代，计数并接种至新10cm皿中，使每个皿中细胞数100-200个；
5)再经过1-2周后，观察细胞克隆小团，在细胞数达到30-100个进行克隆挑选：用中性红溶液对细胞染色1-3分钟，用移液器吸取低浓度胰酶，局部消化克隆团，将细胞吸至96孔板；
6)逐级扩大培养，直至细胞增殖至6孔板的一个孔长满；
7)进行目的基因表达检测，确认克隆细胞。
2.根据权利要求1所述的单细胞克隆分离方法，其特征在于，步骤1)所述的常规的基础培养液包括DMEM、1640等培养液，且需要加入10％胎牛血清和1％的青链霉素。
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