CN106520772A - 用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的sgRNA、载体对及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的sgRNA、载体对及应用，所述sgRNA由特异性识别Nrf2基因的sgRNA1和特异性识别Nrf2基因的sgRNA2组成，载体对由Nrf2‑CAS9‑1载体和Nrf2‑CAS9‑2载体组成，Nrf2‑CAS9‑1载体为含有sgRNA1片段的载体，Nrf2‑CAS9‑2载体为含有sgRNA2片段的载体，上述载体对能在定向敲除人源肝细胞系中Nrf2基因、构建Nrf2基因敲除型人源肝细胞系中应用。本发明在不对基因组做出较大长度改变的遗传背景下达到将Nrf2基因全部敲除，使肝细胞中不残留Nrf2蛋白。

Description

用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的sgRNA、载体对及应用

技术领域

本发明属于基因敲除技术领域，具体涉及用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的sgRNA、载体对及应用。

背景技术

核因子E2相关因子2（NFE2L2/Nrf2）通过结合调控抗氧化反应元件（ARE）来调节细胞内广泛的抗氧化应激基因的表达，具有十分重要的抗氧化应激功能，Nrf2与癌症的发生发展和癌细胞的迁移及耐药的直接关系，使得对于Nrf2的研究愈来愈受到科学家的重视。

传统的研究方法中，使用siRNA干扰技术研究Nrf2功能的原理是通过降解细胞中Nrf2的mRNA，从而达到降低细胞中Nrf2蛋白质水平，但不能完全消除细胞中的Nrf2蛋白，因此得出的研究结果不能排除残留的Nrf2蛋白的影响；此外siRNA技术还存在脱靶问题，siRNA技术的稳定性以及可重复性较差；利用同源重组系统基因敲出技术研究Nrf2则是在基因组上将Nrf2基因全部或大片段敲出，但此方法操作繁琐，在基因组上敲出片段较长对基因组造成的影响不可知。

如何使Nrf2的研究变的方便快捷，在不对基因组做出较大长度改变得遗传背景下达到Nrf2全部敲出，并且让研究结果稳定可靠可重复，是Nrf2研究领域亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明要解决的技术问题是：如何提供用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的sgRNA、载体对及应用，使该方法操作方便快捷，在不对基因组做出较大长度改变的遗传背景下达到将Nrf2基因全部敲除，使肝细胞中不残留Nrf2蛋白。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的sgRNA，所述sgRNA由特异性识别Nrf2基因的sgRNA1和特异性识别Nrf2基因的sgRNA2组成，所述sgRNA1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述sgRNA2的序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，所述表达载体对由Nrf2-CAS9-1载体和Nrf2-CAS9-2载体组成，所述Nrf2-CAS9-1载体为含有权利要求1所述sgRNA1片段的载体，所述Nrf2-CAS9-2载体为含有权利要求1所述sgRNA2片段的载体；所述载体带有嘌呤霉素抗性基因。

进一步，所述载体为Cas9/gRNA（puro-GFP）Vector载体。

所述用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的载体对在定向敲除人源肝细胞系中Nrf2基因、构建Nrf2基因敲除型人源肝细胞系中的应用。

作为优化，所述人源肝细胞为人源肝癌细胞系HepG2细胞。

Nrf2基因敲除型人源肝细胞系的构建方法，包括如下步骤：

1）采用转染法将所述载体对转染入人源肝细胞中；

2）用嘌呤霉素筛选步骤1）转染培养后的人源肝细胞，得到成功转染Nrf2-CAS9-1载体质粒和Nrf2-CAS9-2载体质粒的人源肝细胞；

3）将步骤2）筛选成功的转染Nrf2-CAS9-1载体质粒和Nrf2-CAS9-2载体质粒的人源肝细胞用胰酶消化悬浮后，继续培养至单细胞克隆长成，挑取由单个细胞长成且细胞状态良好的群落继续扩大培养，得到所述人源肝细胞中Nrf2基因敲除的细胞系。

进一步，采用转染法将所述载体对转染入人源肝细胞中的具体步骤为：

A、向细胞培养孔板中每孔加入人源肝细胞，采用DMEM培养基对所述人源肝细胞进行培养至所述人源肝细胞在孔板底部生长覆满80%后，将每孔中的DMEM培养基吸出并加入Opti-MEM，将细胞培养孔板中的各个孔分为转染组和对照组备用；

B、取Nrf2-CAS9-1载体质粒、Nrf2-CAS9-2载体质粒和Opti-MEM混合均匀，得到试剂1；其中，所述Nrf2-CAS9-1载体质粒、Nrf2-CAS9-2载体质粒和Opti-MEM的质量体积比为1.5 μg：1.5 μg：100μL；将Opti-MEM作为试剂2；将lipo 2000和Opti-MEM以9：100的体积比混合均匀，得到试剂3；

C、将试剂1和试剂3等体积混合并静置15 min后，加入步骤A转染组中，培养8 h；将试剂2和试剂3等体积混合并静置15 min后，加入步骤A对照组中，培养8 h；

D、将培养结束后的转染组和对照组中液体吸出，并分别向转染组和对照组孔中各加入含10 wt. %FBS的DMEM培养基，完成转染步骤。

进一步，步骤4）中所述用嘌呤霉素筛选步骤3）转染培养后的人源肝细胞的具体步骤为：将嘌呤霉素加入含10 wt.%FBS的DMEM培养基中混合均匀，得到含嘌呤霉素培养基，其中，所述嘌呤霉素在所述含嘌呤霉素培养基中的终浓度为2 μg/mL；在人源肝细胞转染Nrf2-CAS9-1载体质粒和Nrf2-CAS9-2载体质粒48 h后，用所述含嘌呤霉素培养基继续培养至对照组中人源肝细胞全部死亡为止，A孔中仍剩余存活的人源肝细胞即为成功转染Nrf2-CAS9-1载体质粒和Nrf2-CAS9-2载体质粒的人源肝细胞。

进一步，所述人源肝细胞为人源肝癌HepG2细胞。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明利用CRISPR/CAS9技术，使基因编辑变的简单易行，可对任意核酸碱基位点进行编辑，通过敲出非3倍数的碱基形成译码突变来实现基因编辑，在基因组上只有数个碱基的插入或缺失，却能在蛋白水平上完全消除目的基因的表达。具体地，本发明利用CRISPR/CAS9技术在人源肝癌细胞系HepG2细胞中编辑Nrf2基因组碱基序列，通过单克隆细胞系的筛选，培养和鉴定成功制造出Nrf2敲出的稳定单克隆细胞系H3。H3单克隆细胞系在基因组上将Nrf2的CDS区域缺失若干碱基，使Nrf2蛋白因编码区碱基的移码缺失而在蛋白水平上完全敲出，蛋白质免疫印迹实验检测Nrf2蛋白完全消失，实现了对基因组较小的改变达到Nrf2蛋白的完全敲出，取得了优良的基因编辑效果。

2、本发明基因敲除的H3细胞系是通过单克隆培养挑选技术获得的单细胞克隆细胞系，经过长达数月的培养，发现得到的H3细胞系状态优良形态稳定，说明本发明得到的基因敲除细胞系稳定性良好。

3、本发明利用H3细胞系研究肝细胞中Nrf2功能，只需将H3细胞系与对照细胞系共同对照处理即可，使得转录因子Nrf2功能研究简单易行，且能节省大量昂贵的生化试剂，本发明H3是Nrf2蛋白完全敲出的细胞系，用于研究得出的结果能完全体现出Nrf2在肝癌细胞中的功能，可作为Nrf2在肝癌细胞中功能研究的绝佳材料。

4、采用本发明方法构建得到的H3细胞系是单克隆细胞系，遗传表达稳定，得出的研究结果可重复性好，研究结果准确可靠。

附图说明

图1为蛋白质免疫印迹方法鉴定H3中Nrf2蛋白图；

图2为Nrf2下游基因mRNA表达水平检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

实施例1 编辑位点的选定及Nrf2-CAS9质粒的设计和构建

根据CAS9技术基因编辑原理，选取Nrf2基因组中2个CDS区域处作为Nrf2基因CAS9靶向编辑位点，1号识别序列为: 5’- tatttgacttcagtcagcga-3’（SEQ ID NO.1），2号识别序列为：5’-gttgatttagacggtatgca-3’（SEQ ID NO.2）。

根据选取的靶向编辑位点，设计sgRNA序列，所述sgRNA由特异性识别Nrf2基因的sgRNA1和特异性识别Nrf2基因的sgRNA2组成，sgRNA1的序列如SEQ ID NO.3所示（tatttgacttcagtcagcgagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttt，粗体字体部分为gRNA骨架序列），sgRNA2的序列如SEQ ID NO.4所示（gttgatttagacggtatgcagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttt，粗体字体部分为gRNA骨架序列）。

设计Nrf2敲出位点PCR反应扩增引物序列：

Nrf2 F：5- cggggtacccagcaggacatggatttgattgaca -3

Nrf2 R：5- ccccccgggtgtcagtttggcttctggacttgga -3

Nrf2 F引物插入Kpn I限制性核酸内切酶酶切位点，Nrf2 R引物插入Xma I限制性核酸内切酶酶切位点。（粗体标注碱基为对应限制性核酸内切酶识别位点。）

按照Nrf2-CAS9质粒试剂盒使用说明书，构建含有所述sgRNA1片段的Nrf2-CAS9-1载体和含有sgRNA2片段的Nrf2-CAS9-2载体；将sgRNA1片段、sgRNA2片段插入Cas9/gRNA（puro-GFP）Vector载体，所述载体带有嘌呤霉素抗性基因，并提取质粒，分别得到Nrf2-CAS9-1载体质粒和Nrf2-CAS9-2载体质粒。

实施例2 Nrf2基因敲出的单克隆细胞系的筛选、培养和鉴定

1）Nrf2-CAS9质粒转染HepG2细胞：

a、将HepG2细胞种六孔板中2个孔，分别记为A（质粒转染组）、B孔（对照组），每孔30万细胞，采用DMEM培养基进行培养过夜。待细胞在孔板底部生长至铺满底板80%左右开始准备转染Nrf2-CAS9质粒。

b、将A、B孔中DMEM培养基吸出，加入800 μL Opti-MEM。

c、准备液1、液2和液3；其中，液1配方如下：取Nrf2-CAS9-1质粒1.5μg、Nrf2-CAS9-2质粒1.5 μg加入100μL Opti-MEM，混匀放置5分钟；

液2：100μL Opti-MEM；

液3：取lipo2000 18μL加入200μL Opti-MEM，混匀放置5分钟；

d、取100μL 液3加入液1中，混匀后放置15分钟，加入A孔；

e、取100μL 液3加入液2中，混匀后放置15分钟，加入B孔；

f、将步骤d、e加入液体后的孔板放入培养箱中，于体积浓度5%CO₂、37℃下培养8小时后，吸出各孔中培养基，向A、B孔中各加入2mL含10 wt.% FBS的DMEM培养基。

2）嘌呤霉素筛选获得成功转染细胞：

配制含嘌呤霉素培养基：将嘌呤霉素加入含10 wt.% FBS的DMEM培养基中混合均匀，使嘌呤霉素终浓度为2 μg/ mL。

待步骤1）HepG2细胞转染Nrf2-CAS9质粒48小时后，用含嘌呤霉素培养基继续培养A、B孔中的细胞，于体积浓度5%CO₂、37℃下培养3-5天，直到对照组B孔中细胞全部死亡为止，此时A孔中剩余的细胞即为成功转染了Nrf2-CAS9质粒的HepG2细胞。

3）挑选单克隆细胞系：

将2）中得到的成功转染Nrf2-CAS9质粒的HepG2细胞用胰酶消化悬浮，具体地用无血清DMEM培养基清洗培养板中的细胞2次，除去原培养基中的血清残留，吸干培养基，加入2 mL胰酶，于37℃培养箱中消化3至5分钟。

待消化结束后，用血球计数板对消化后的细胞计数，根据细胞浓度，吸取100个细胞加入10 mL含10 wt.%FBS的DMEM培养基中并混匀。

将上述混匀后的含细胞培养基种96孔板，每孔接种量100 μL，置于培养箱中于体积浓度5%CO₂、37℃下培养至单细胞克隆长成。

显微镜下观察96孔板中细胞群落，选取由单个细胞长成且细胞状态良好的群落继续扩大培养，得到单克隆细胞系。

4）单克隆细胞系鉴定。

将步骤3）扩大培养的单克隆细胞系及对照细胞系（HepG2）提取基因组、总RNA、总蛋白。

用单克隆细胞系基因组做PCR，用Nrf2 F和Nrf2 R引物扩增出Nrf2-CAS9靶序列片段并测序，检测Nrf2基因的碱基编辑效果。

将单克隆细胞系的总RNA反转录为cDNA，用定量PCR技术检测单克隆细胞系中Nrf2的mRNA水平变化。

通过蛋白质免疫印迹技术使用Nrf2抗体检测单克隆细胞系总蛋白中Nrf2蛋白水平变化。

通过上述3种检测方法，鉴定出HepG2细胞中Nrf2成功敲出的单克隆细胞系H3细胞系。鉴定结果显示，H3细胞系中Nrf2基因组缺失1733个DNA碱基（两条染色体缺失的序列相同，CDS区域缺失124bp-525bp 片段共402个碱基），H3细胞系中正常大小Nrf2蛋白条带（100kDa处条带）完全消失，在正常大小条带下方出现一系列条带（图1），与对照组HepG细胞相比H3细胞系中转录因子Nrf2下游基因如GCLC、GCLM、HMOX1、NQO1等在mRNA水平出现显著下调（图2），证明Nrf2功能已丧失。成功获得人源肝癌细胞系中Nrf2蛋白完全敲出的单克隆细胞系H3。

对获得的H3细胞系进行传代培养时，使用含双抗和10% FBS的高糖DMEM培养基培养，培养环境为5% CO₂，37℃。每2-3天更换新鲜培养基，细胞铺满培养瓶底即可传代。细胞系传代时先用PBS缓冲液清洗贴壁细胞，再使用胰酶消化5-10分钟，加入含10% FBS的高糖DMEM培养基终止消化，用吸管将细胞吹散开，一瓶传2瓶或3瓶。

本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆大学；

<120> 用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的sgRNA、载体对及应用；

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.1的核苷酸序列

<400> 1

tatttgactt cagtcagcga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.2的核苷酸序列

<400> 2

gttgatttag acggtatgca 20

<210> 3

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.3的核苷酸序列

<400> 3

tatttgactt cagtcagcga gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcttt 99

<210> 4

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.4的核苷酸序列

<400> 4

gttgatttag acggtatgca gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgcttt 99

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nrf2 F的核苷酸序列

<400> 5

cggggtaccc agcaggacat ggatttgatt gaca 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nrf2 R的核苷酸序列

<400> 6

ccccccgggt gtcagtttgg cttctggact tgga 34

Claims (9)

1.用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA由特异性识别Nrf2基因的sgRNA1和特异性识别Nrf2基因的sgRNA2组成，所述sgRNA1的序列如SEQ IDNO.3所示，所述sgRNA2的序列如SEQ ID NO.4所示。

2.用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的表达载体对，其特征在于，所述表达载体对由Nrf2-CAS9-1载体和Nrf2-CAS9-2载体组成，所述Nrf2-CAS9-1载体为含有权利要求1所述sgRNA1片段的载体，所述Nrf2-CAS9-2载体为含有权利要求1所述sgRNA2片段的载体；所述载体带有嘌呤霉素抗性基因。

3.根据权利要求2所述表达载体对，其特征在于，所述载体为Cas9/gRNA（puro-GFP）Vector载体。

4.权利要求2或3所述用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的载体对在定向敲除人源肝细胞系中Nrf2基因、构建Nrf2基因敲除型人源肝细胞系中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述人源肝细胞为人源肝癌细胞系HepG2细胞。

6.Nrf2基因敲除型人源肝细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）采用转染法将权利要求2或3所述载体对转染入人源肝细胞中；

2）用嘌呤霉素筛选步骤1）转染培养后的人源肝细胞，得到成功转染Nrf2-CAS9-1载体质粒和Nrf2-CAS9-2载体质粒的人源肝细胞；

3）将步骤2）筛选成功的转染Nrf2-CAS9-1载体质粒和Nrf2-CAS9-2载体质粒的人源肝细胞用胰酶消化悬浮后，继续培养至单细胞克隆长成，挑取由单个细胞长成且细胞状态良好的群落继续扩大培养，得到所述人源肝细胞中Nrf2基因敲除的细胞系。

7.根据权利要求6所述Nrf2基因敲除型人源肝细胞系的构建方法，其特征在于，采用转染法将权利要求2或3所述载体对转染入人源肝细胞中的具体步骤为：

A、向细胞培养孔板中每孔加入人源肝细胞，采用DMEM培养基对所述人源肝细胞进行培养至所述人源肝细胞在孔板底部生长覆满80%后，将每孔中的DMEM培养基吸出并加入Opti-MEM，将细胞培养孔板中的各个孔分为转染组和对照组备用；

B、取Nrf2-CAS9-1载体质粒、Nrf2-CAS9-2载体质粒和Opti-MEM混合均匀，得到试剂1；其中，所述Nrf2-CAS9-1载体质粒、Nrf2-CAS9-2载体质粒和Opti-MEM的质量体积比为1.5 μg：1.5 μg：100μL；将Opti-MEM作为试剂2；将lipo 2000和Opti-MEM以9：100的体积比混合均匀，得到试剂3；

C、将试剂1和试剂3等体积混合并静置15 min后，加入步骤A转染组中，培养8 h；将试剂2和试剂3等体积混合并静置15 min后，加入步骤A对照组中，培养8 h；

D、将培养结束后的转染组和对照组中液体吸出，并分别向转染组和对照组孔中各加入含10 wt. %FBS的DMEM培养基，完成转染步骤。

8.根据权利要求6所述Nrf2基因敲除型人源肝细胞系的构建方法，其特征在于，步骤4）中所述用嘌呤霉素筛选步骤3）转染培养后的人源肝细胞的具体步骤为：将嘌呤霉素加入含10 wt.%FBS的DMEM培养基中混合均匀，得到含嘌呤霉素培养基，其中，所述嘌呤霉素在所述含嘌呤霉素培养基中的终浓度为2 μg/mL；在人源肝细胞转染Nrf2-CAS9-1载体质粒和Nrf2-CAS9-2载体质粒48 h后，用所述含嘌呤霉素培养基继续培养至对照组中人源肝细胞全部死亡为止，A孔中仍剩余存活的人源肝细胞即为成功转染Nrf2-CAS9-1载体质粒和Nrf2-CAS9-2载体质粒的人源肝细胞。

9.根据权利要求6所述Nrf2基因敲除型人源肝细胞系的构建方法，其特征在于，所述人源肝细胞为人源肝癌HepG2细胞。