CN115896112A - 靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，构建该基因缺失细胞株的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA、构建TMEM121基因缺失细胞株的方法及应用，属于生物医药技术领域。通过Cas9系统构建pX459‑TMEM121重组质粒，将Cas9重组质粒转染HEK293T细胞，通过Puromycin进行筛选、有限稀释法结合HEK293T筛选，获得稳定的TMEM121基因敲除的细胞株HEK293T细胞和Huh7细胞。DNA检测显示，基因敲除的细胞株TMEM121基因出现缺失。另外，TMEM121基因敲除的细胞株迁移和侵袭能力明显下降。结果表明，利用Cas9系统成功敲除TMEM121基因后，可阻碍肝癌细胞的恶性转化。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体是一种靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，构建TMEM121基因缺失细胞株的方法及应用。
背景技术
TMEM121基因位于人第14号染色体上(14q32.33)，含有2个外显子，转录1.5kb的mRNA，编码319个氨基酸残基，在成人组织中的心脏、肝脏、骨骼肌、胰腺中均有表达。TMEM121蛋白是一个跨膜蛋白，具有6个跨膜区，没有结构域。目前对TMEM121的功能研究尚少。仅有数篇文献报道：TMEM121基因抑制宫颈癌细胞的转移；TMEM121与前列腺患者的无复发生存率负相关，可能在前列腺癌发生过程中起致癌作用；在皮肤愈伤组织中，TMEM121表达上调，且与内皮细胞标记蛋白CD31共定位，影响人的原代内皮细胞的迁移和增殖，可能与真皮组织脉管系统的再生有关。但是TMEM121在肝癌的发生发展中的作用尚未报道。肝癌位居世界恶性肿瘤发病率的第三位，死亡率的第二位。晚期肝癌患者五年生存率低于30％，而目前仍缺乏有效的治疗方案。因此，深入研究肝癌发生发展的分子机制，对探索肝癌诊治的新靶点、促进精准医疗具有重要意义。我们的研究发现TMEM121在肝癌细胞中过表达，有促进肝癌细胞增殖及迁移和侵袭的作用。在裸鼠皮下成瘤的模型中，TMEM121过表达促进肿瘤的发生。在小鼠肝脏再生模型中，TMEM121与周期因子cyclinD1的表达图谱相似，其机理尚不清楚。
现有技术的研究方向以及缺陷包括：
(1)Cas9系统是一种后天免疫防御系统，用以保护细菌或古细菌免受外来质粒或噬菌体的侵入，这类细菌或古细菌基因组的序列能表达与入侵者基因组序列相识别的RNA，在相关酶(CAS9)的作用下切割外源基因组DNA，达到抵制入侵的目的，经过人为改造后，Cas9系统可以实现在真核细胞中高度灵活且特异的基因组编辑，是目前基因组编辑领域最受欢迎的新一代基因组编辑技术，Cas9基因编辑系统靶向位点选择灵活、效率高、载体构建方法简单，是近年来基因编辑领域的重大研究突破和研究热点，目前该技术已被用于构建各类基因敲除细胞系和基因敲除动物模型，然而还未与靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，构建TMEM121基因缺失细胞株的研究进行有机结合。
(2)有限稀释法挑选单克隆细胞的原理是利用梯度稀释，当稀释梯度足够高时，可以获得的单一细胞，培养增殖之后能获得背景单一的细胞株。有限稀释法的操作简单，容易得到单克隆细胞株。一般情况下，为了最大可能性的获得有敲除效应的sgRNA,一般研究者都会设计至少3条sgRNA，工作量比较大。
(3)肿瘤研究中最常用的实验方法利用Transwell培养小室研究肿瘤细胞的迁移与侵袭实验。Transwell培养小室外形为一个可放入孔板内的小杯子，杯子底部为带有微孔的通透性的聚碳酸酯膜。transwell培养小室为上室，培养板为下室，上室内加上层培养液，下室内加下层培养液，上下层培养液以膜相隔。当把细胞接种于上室后，由于transwell小室底部的膜具有通透性，下室培养液中成分可影响上室细胞的运动。通过此方法，可比较不同细胞的迁移能力。transwell铺上基质胶可以用来进行细胞趋化和肿瘤细胞侵袭等多方面的研究。然而，该方法在靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，构建TMEM121基因缺失细胞株研究上适应性较差。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题；为此，本发明提出了一种靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，构建TMEM121基因缺失细胞株的方法及应用。采用该系统进行特定基因的精准敲除、构建基因突变缺失细胞株，关键之处为sgRNA的设计。在sgRNA设计时，需注意位置、序列、特异性评分、有效性、脱靶等众多参数，才能提高sgRNA的打靶效率。当前国内尚未见研究报道TMEM121基因敲除的sgRNA设计，因此，通过设计TMEM121基因敲除的sgRNA，构建能在体外长期培养的TMEM121缺失的稳定人肝细胞株，在探索肝癌发生新机制和新诊治靶点中具有重要的研究和应用价值，本发明的最终目标是，设计靶向TMEM121的sgRNA，筛选具有敲除效应的sgRNA，构建靶向敲除人TMEM121的细胞株，探索TMEM121的功能，重点解析TMEM121在肝癌转移发生发展中的作用及其分子机制，为其在临床转化应用奠定基础。
为实现上述目的，本发明一方面提供了一种靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，包括：Sequence1:编码第92-98个氨基酸的序列CATCTTCCAGAACTACaagg；Sequence2:编码第182-188个氨基酸的序列TGTAGCAGTAGAAGAAGGTG；Sequence3:编码第212-218个氨基酸的序列GGGTACAGCATCATCTTCTG。
本发明的第二方面提供一种Cas9质粒，含有第一方面所述的靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA。
本发明的第三方面提供一种Cas9系统，利用第一方面所述的靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA构建而成。
本发明的第四方面提供一种Cas9系统的构建方法，包括：
1)分别在sgRNA两端加酶切位点，在每条sgRNA序列的正义链的5’端添加CACC，反义链的5’端添加AAAC，从而形成与px459质粒经Fast Digest BbsI酶切后互补的粘性末端。如果正义链的5’端第一个碱基不是G，则在5’端CACC后面增加一个G，相应的反义链3’端再增加一个C；合成三条gRNA的正反链，进行sgRNA正反链退火成双链DNA；
2)通过构建重组质粒pX459-TMEM121、将Cas9重组质粒转染HEK293T细胞，通过Puromycin进行筛选、有限稀释法结合HEK293T筛选，获得稳定的TMEM121基因敲除的细胞株HEK293T细胞和Huh7细胞；
3)选择pX459质粒作为Cas9载体，包含cas9、及Puromycin抗性基因表达框，使用限制性内切酶BbSI酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用QIAGEN胶回收试剂盒，按说明书进行操作回收线性化的pX459质粒作为载体；
4)PCR仪进行退火反应，设置退火条件：95℃，5min，然后梯度降温，-1℃/1min，降温至25℃；
5)将双链gRNA与线性化的pX459质粒载体连接，转化，提取重组质粒，转染细胞，利用有限稀释法构建单克隆细胞敲除株，获得靶向敲除人TMEM121基因的Cas9系统。
本发明的第五方面提供一种Cas9重组质粒，利用第三方面所述的Cas9系统获得。
本发明的第六方面提供一种试剂盒，其特征在于，包含第一方面所述的靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，和/或第二方面所述的Cas9重组质粒，和/或第三方面所述的Cas9系统，和/或第五方面所述的颗粒。
本发明的第七方面提供第一方面所述的靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA、第二方面所述的Cas9质粒、第三方面所述的Cas9系统和/或第五方面所述的重组质粒在制备治疗肝癌的药物和/或制剂中的用途。
本发明的第八方面提供一种TMEM121基因缺失的细胞株，利用第三方面所述的Cas9系统转染目的细胞株后获得。
本发明的第九方面提供第八方面所述的TMEM121基因缺失的细胞株的制备方法，包括：
将所述Cas9重组质粒系统通过转染HEK293T细胞，有限稀释法传代筛选，获得TMEM121基因缺失的细胞株。
优选的，所述目的细胞株为人肝癌细胞株。
本发明采用Cas9这一新型基因编辑方法，构建方法简单、基因编辑效率较高、可操作性强，提供的sgRNA能有效靶向TMEM121基因，成功构建稳定的TMEM121基因敲除细胞株。具体有益效果如下：
(1)相对于其他基因编辑技术，本发明采用的Cas9技术可以弥补传统基因敲除方法流程复杂、费用昂贵、技术设备要求较高而成功率较低等不足。
(2)本发明实现了在基因组水平上对特定基因的敲除，显著优于RNA干扰技术在mRNA或蛋白水平对基因的沉默不完全或者无法沉默等不足。
(3)TMEM121基因参与细胞的增殖行为，TMEM121基因敲除细胞株的建立可为研究细胞增殖在生命活动中的重要作用提供关键的研究模型。
(4)TMEM121基因敲除细胞株的建立为探索肝癌等肿瘤发生发展分子机制提供了有效的研究平台，为肿瘤的精准防治提供新型研究模型。
(5)利用HEK293T细胞进行筛选有敲除效果的sgRNA，提高了效率，也减少了工作量。
(6)获得的靶向敲除人TMEM121的HEK293T细胞和Huh7细胞，为研究TMEM121的功能提供了有力的工具。
附图说明
图1为本发明优选实施方式的重组质粒的部分测序图；
图2为本发明优选实施方式的3个重组质粒转染HEK293T细胞的多克隆的部分测序图；
图3为本发明优选实施方式的TMEM121单克隆敲除细胞株的鉴定示意图；
图4为本发明优选实施方式的TMEM121敲除抑制肝癌细胞的迁移和侵袭(200倍)示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种Cas9系统敲除人TMEM121基因的sgRNA，成功敲除人TMEM121基因，构建TMEM121基因缺失细胞株的方法，可应用于探索肝癌发生新机制和诊治新靶点。该靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA是利用在线网站(https://www.benchling.com/)设计的人TMEM121基因的sgRNA，选取得分最高的3条sgRNA；包括：Sequence1:编码第92-98个氨基酸的序列CATCTTCCAGAACTACaagg；Sequence2:编码第182-188个氨基酸的序列TGTAGCAGTAGAAGAAGGTG；Sequence3:编码第212-218个氨基酸的序列GGGTACAGCATCATCTTCTG。分别在sgRNA两端加酶切位点，在每条sgRNA序列的正义链的5’端添加CACC，反义链的5’端添加AAAC，从而形成与px459质粒经FastDigestBbsI酶切后互补的粘性末端。如果正义链的5’端第一个碱基不是G，则在5’端CACC后面增加一个G，相应的反义链3’端再增加一个C。在华大生物公司合成这三条gRNA的正反链，退火成双链DNA。
通过构建重组质粒pX459-TMEM121、将Cas9系统通过HEK293T细胞进行包装获得颗粒、将颗粒感染目的细胞株、有限稀释法结合HEK293T筛选，可获得稳定的TMEM121基因敲除的细胞株HEK293T细胞和Huh7细胞。DNA检测显示，基因敲除的细胞株TMEM121基因缺失。另外，TMEM121基因敲除的细胞株迁移和侵袭能力明显降低。结果表明，利用Cas9系统成功敲除人TMEM121基因后，可阻碍肝癌细胞的恶性转化。
下面结合图1-4所示的实验设计流程图，通过具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、使用Cas9技术构建敲除人TMEM121基因质粒
(1)sgRNA设计及合成
1)利用在线网站(https://www.benchling.com/)设计人TMEM121基因的sgRNA，选取得分最高的3条sgRNA。Sequence1:编码第92-98个氨基酸的序列CATCTTCCAGAACTACaagg；Sequence2:编码第182-188个氨基酸的序列TGTAGCAGTAGAAGAAGGTG；Sequence3:编码第212-218个氨基酸的序列GGGTACAGCATCATCTTCTG。
2)分别在sgRNA两端加酶切位点，在每条sgRNA序列的正义链的5’端添加CACC，反义链的5’端添加AAAC，从而形成与px459质粒经Fast Digest BbsI酶切后互补的粘性末端。如果正义链的5’端第一个碱基不是G，则在5’端CACC后面增加一个G，相应的反义链3’端再增加一个C。在华大生物公司合成这三条gRNA的正反链，退火成双链DNA。
(2)载体构建
1)进行sgRNA正反链退火：其中反应体系如表1所示，包括10*NEBbuffer1uL，sgRNA正链(100uM)1uL，sgRNA反链(100uM)1uL以及水7uL；混匀后，置于95°水浴5min,室温自然冷却1hour,取反应液1：250稀释后做后续的连接；
表1
2)选择pX459质粒作为Cas9载体，包含cas9、及Puromycin抗性基因表达框，使用限制性内切酶BbSI酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用QIAGEN胶回收试剂盒，按说明书进行操作回收线性化的PX459质粒作为载体。
3)PCR仪进行退火反应，设置退火条件：95℃,5min，然后梯度降温，-1℃/1min，降温至25℃；
4)将退火后形成的两组TMEM121sgRNA双链反应也和BbSI酶切后的线性化pX459质粒在4℃连接过夜，次日转化，挑取克隆送华大生物公司测序验证鉴定阳性克隆，测序引物为PX459载体上的U6引物：ATGGACTATCATATGCTTACCGTA.
(3)Cas9系统构建TMEM121基因敲除的稳定肝细胞株
1)筛选有敲除效应的sgRNA并进行病毒包装
HEK293T细胞培养：复苏冻存的HEK293T细胞，5％CO2、37℃恒温培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基。待其生长状态良好时，按1.35×106接种至6孔板。
细胞转染：使用
3000(Invitrogen,USA)将测序正确的3个重组质粒分别转染HEK293T细胞，puro筛选后得到多克隆细胞,提取多克隆细胞的DNA，在距离第一个sgRNA位置的大约200bp处设计正向引物(F)，在第三个sgRNA位置处设计反向引物(R),以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，送PCR产物到华大生物公司测序，测序结果显示有套峰的细胞，则暗示有基因编辑效果。本项目首先选择HEK293T细胞进行初步筛选，可以节省时间，因为HEK293T细胞转染效率高，容易挑选多克隆，能快速判断所设计的sgRNA是否具有敲除效应。
2、利用有限稀释法构建单克隆细胞敲除株
选择测序有套峰的细胞继续利用有限稀释法筛选单克隆，胰酶消化细胞后，稀释细胞直至100ul培养基含有1个细胞，按每孔100ul细胞稀释液加至96孔板中；
接种后第5至7天用显微镜观察细胞生长状况并初步筛选出单克隆细胞，待细胞长满96孔板底时，再用胰蛋白酶消化细胞并转移至24孔板中；
待细胞长满24孔板底时，一部分细胞用于传代留种，一部分细胞提取其基因组DNA；
经PCR扩增后测序，测序结果与原基因组进行比对，检测靶向敲除人TMEM121基因是否成功。选择有明显敲除效果的重组质粒转染肝癌细胞Huh7，挑选单克隆后继续后续的功能实验。
3、利用Tranwell小室研究TMEM121敲除的肿瘤细胞Huh7的迁移和侵袭能力
分别将TMEM121敲除的Huh7细胞和野生型的Huh7细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2.5×105/ml；
如果做侵袭实验，则选择铺有Matrigel胶的transwell；接种细胞，在下室(即24孔板底部)加入600－800μl含10％血清的培养基，上室加入200μl细胞悬液，继续在孵箱培养24h(侵袭实验培养48h)；将其下表面浸泡在4％多聚甲醛溶液中，固定30min-60min，用结晶紫染色，镜检，分析实验结果。
实验数据：
1、测序验证重组质粒构建成功：
如图1所示，将重组质粒的菌液送华大生物公司测序，测序引物为载体上的U6序列，黑色下划线区域表示插入的sgRNA序列。
2、通过PCR和测序筛选有敲除效应的sgRNA
如图2所示，将测序正确的3个重组质粒分别转染HEK293T细胞，转染后48小时，用2ug/ml的puro筛选，未转染质粒HEK293T细胞为对照，当对照细胞几乎全部杀死之后，将野生型的后得到多克隆细胞,提取细胞的DNA，在距离第一个sgRNA位置的大约200bp处设计正向引物(F)，在第三个sgRNA位置处设计反向引物(R),以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，送PCR产物到华大生物公司测序，测序结果显示有套峰，则暗示有基因编辑效果。如图2所示，px459-Seq-1没有套峰，暗示没有基因编辑，px459-Seq-2和px459-Seq-3在红色箭头处出现套峰，说明PCR产物有两种或两种以上的不同模板，暗示有基因编辑。后续选择px459-Seq-2和px459-Seq-3继续利用有限稀释方法，挑选单克隆。
3、提取px459-Seq-2和px459-Seq-3的单克隆细胞的DNA，确定敲除效果。
分别在敲除位置的上下游200bp处设计引物，以判断是否有敲除效果，结果发现在以px459-Seq-2细胞DNA为模板扩增的DNA片段比野生型细胞片段短大约200bp左右(图3)。将以px459-Seq-2细胞DNA为模板扩增的DNA片段纯化后送去华大基因测序，测序结果与TMEM121的DNA序列比对，发现px459-Seq-2细胞中TMEM121的DNA缺失256bp(绿色部分)。
图3中，A.PCR检测单克隆细胞的敲除效果；M:DNA marker,泳道1:野生型细胞；泳道2-4：px459-Seq-2细胞克隆；泳道5.px459-Seq-3细胞克隆。B.人TMEM121的基因序列。绿色部分为px459-Seq-2细胞中TMEM121基因的缺失片段,黄色部分为测序序列。
4、参见图4为选择px459-Seq-2靶向敲除人TMEM121的Huh7细胞，进行细胞功能实验，探究TMEM121对肝癌细胞的影响，TMEM121敲除抑制肝癌细胞的迁移和侵袭(200倍)示意图。
综合以上结果表明，本发明采用Cas9这一新型基因编辑方法，构建方法简单、基因编辑效率较高、可操作性强，提供的sgRNA能有效靶向TMEM121基因，成功构建稳定的TMEM121基因敲除细胞株。具体有益效果如下：
(1)相对于其他基因编辑技术，本发明采用的Cas9技术可以弥补传统基因敲除方法流程复杂、费用昂贵、技术设备要求较高而成功率较低等不足。
(2)本发明实现了在基因组水平上对特定基因的敲除，显著优于RNA干扰技术在mRNA或蛋白水平对基因的沉默不完全或者无法沉默等不足。
(3)TMEM121基因参与细胞增殖行为，TMEM121基因敲除细胞株的建立可为研究细胞增殖在生命活动中的重要作用提供关键的研究模型。
(4)TMEM121基因敲除细胞株的建立为探索肝癌等肿瘤发生发展分子机制提供了有效的研究平台，为肿瘤的精准防治提供新型研究模型。
(5)利用HEK293T细胞进行筛选有敲除效果的sgRNA，提高了效率，也减少了工作量。
(6)获得的靶向敲除人TMEM121的HEK293T细胞和Huh7细胞，为研究TMEM121的功能提供了有力的工具。
上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，都应作为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。以上实施例仅用以说明本发明的技术方法而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方法进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方法的精神和范围。
Claims (10)
1.一种靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，其特征在于，包括：Sequence1:编码第92-98个氨基酸的序列CATCTTCCAGAACTACaagg；Sequence2:编码第182-188个氨基酸的序列TGTAGCAGTAGAAGAAGGTG；Sequence3:编码第212-218个氨基酸的序列GGGTACAGCATCATCTTCTG。
2.一种Cas9系统，其特征在于，含有权利要求1所述的靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA。
3.一种Cas9系统，其特征在于，利用权利要求1所述的靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA构建而成。
4.一种Cas9系统的构建方法，特征在于，包括：
1)分别在sgRNA两端加酶切位点，在每条sgRNA序列的正义链的5’端添加CACC，反义链的5’端添加AAAC，从而形成与pX459质粒经Fast Digest BbsI酶切后互补的粘性末端。如果正义链的5’端第一个碱基不是G，则在5’端CACC后面增加一个G，相应的反义链3’端再增加一个C；合成三条gRNA的正反链，进行sgRNA正反链退火成双链DNA；
2)通过构建Cas9重组质粒pX459-TMEM121、将Cas9重组质粒转染HEK293T细胞，通过Puromycin进行筛选、有限稀释法结合HEK293T筛选，获得稳定的TMEM121基因敲除的细胞株HEK293T细胞和Huh7细胞；
3)选择pX459质粒作为Cas9载体，包含cas9及Puromycin抗性基因表达框，使用限制性内切酶BbSI酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用QIAGEN胶回收试剂盒，按说明书进行操作回收线性化的pX459质粒作为载体；
4)PCR仪进行退火反应，设置退火条件：95℃，5min，然后梯度降温，-1℃/1min，降温至25℃；
5)将双链gRNA与线性化的pX459质粒载体连接，转化，提取重组质粒，转染细胞，利用有限稀释法构建单克隆细胞敲除株，获得靶向敲除人TMEM121基因的Cas9系统。
5.一种Cas9重组质粒，其特征在于，利用权利要求3所述的Cas9系统获得。
6.一种试剂盒，其特征在于其特征在于，包含权利要求1所述的靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA，和/或权利要求2所述的Cas9重组质粒，和/或权利要求3所述的Cas9系统，和/或权利要求5所述的颗粒。
7.权利要求1所述的靶向敲除人TMEM121基因的sgRNA、权利要求2所述的Cas9质粒、权利要求3所述的Cas9系统和/或权利要求5所述的重组质粒在制备治疗肝癌的药物和/或制剂中的用途。
8.一种TMEM121基因缺失的细胞株，其特征在于，利用权利要求3所述的Cas9系统转染目的细胞株后获得。
9.如权利要求8所述的TMEM121基因缺失的细胞株的制备方法，其特征在于，包括：将所述Cas9重组质粒系统通过转染HEK293T细胞，有限稀释法传代筛选，获得TMEM121基因缺失的细胞株。
10.如权利要求9所述的TMEM121基因缺失的细胞株的制备方法，其特征在于，所述目的细胞株为人肝癌细胞株。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520772A (zh) * | 2017-01-11 | 2017-03-22 | 重庆大学 | 用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的sgRNA、载体对及应用 |
| CN107418974A (zh) * | 2017-07-28 | 2017-12-01 | 新乡医学院 | 一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法 |
| US20200326343A1 (en) * | 2017-08-20 | 2020-10-15 | Zhejiang University | Gene and its expression product promoting the occurrence and development of cancer and application |
| WO2022047222A2 (en) * | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Genentech, Inc. | Crispr/cas9 multiplex knockout of host cell proteins |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520772A (zh) * | 2017-01-11 | 2017-03-22 | 重庆大学 | 用于人源肝细胞中Nrf2基因定向敲除的sgRNA、载体对及应用 |
| CN107418974A (zh) * | 2017-07-28 | 2017-12-01 | 新乡医学院 | 一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法 |
| US20200326343A1 (en) * | 2017-08-20 | 2020-10-15 | Zhejiang University | Gene and its expression product promoting the occurrence and development of cancer and application |
| WO2022047222A2 (en) * | 2020-08-28 | 2022-03-03 | Genentech, Inc. | Crispr/cas9 multiplex knockout of host cell proteins |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| E. JOHN TOKARSKY等: "Mitochondrial Dysfunction is a Driver for SP-2509 Drug Resistance in Ewing Sarcoma", BIORXIV, pages 1 - 59 * |
| SIMONE BRONNEKE等: "Genome-wide expression analysis of wounded skin reveals novel genes involved in angiogenesis", ANGIOGENESIS, pages 361 * |
| 周军媚;姚峰;谢华平;叶湘漓;王跃群;: "靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体的构建和鉴定", 中国动脉硬化杂志, no. 05, pages 397 - 401 * |
| 徐伟;周军媚;叶湘漓;江志钢;李永青;范雄伟;吴秀山;王跃群;: "人类TMEM121基因的生物信息学分析", 湖南师范大学学报(医学版), no. 01, pages 1 - 4 * |
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| Publication number | Publication date |
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