CN101798581A

CN101798581A - 永生化am细胞株的建立方法

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Publication number: CN101798581A
Application number: CN201010104268A
Authority: CN
Inventors: 陶谦
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2010-08-11

Abstract

本发明提供一种永生化AM细胞株的建立方法，通过构建逆转录病毒载体，感染细胞激活端粒酶而建立永生化AM细胞株，过程包含构建pLXSNneo-hTERT逆转录病毒载体，经AM细胞原代培养、AM细胞免疫细胞化学鉴定、永生化AM细胞株建立形成稳定可靠的细胞株，该细胞株符合上皮细胞特征，可保证目的基因的稳定表达，为研究AM发生发展、侵袭特性提供了有价值的体外模型。

Description

永生化AM细胞株的建立方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的涉及一种通过构建逆转录病毒载体，感染细胞激活端粒酶，从而建立永生化AM细胞株的方法。

背景技术

成釉细胞瘤(ameloblastoma，AM)是最常见颌骨良性牙源性肿瘤，约占牙源性肿瘤的60％，占整个颌骨肿瘤的10％^[1-5]。临床上AM多发生于青壮年，国外学者Reichart等^[6]研究文献报道的3677例AM发现，AM平均发病年龄为35岁，男女发病比例约为1.4∶1，80％的AM发生在下颌骨，以下颌角及其邻近部位最常见。AM虽为良性肿瘤，但具有局部侵袭性生物学行为，术后复发率高，偶见远处转移^[7-8]，因此也被称为“临界瘤”。

AM局部侵袭性生长特点是术后容易复发的主要原因，其侵袭机制也是国内外众多学者研究的重点。近年来对AM侵袭性研究主要集中在细胞增殖凋亡^[9-15]、细胞外基质降解^[16-19]、癌基因与抑癌基因^[20-22]等几个方面，但AM局部侵袭及复发的分子机制至今尚未完全明确，一个重要的原因即是AM细胞的匮乏。AM肿瘤细胞是研究其侵袭性的重要对象，与其他良性肿瘤细胞一样，AM细胞体外培养时间一般不超过3-4个月^[23-24]。原代培养的AM细胞生长条件要求严格，生长时间短暂，经历短暂的增殖传代后即进入凋亡状态，使以AM细胞作为实验对象的研究受到限制。因此，建立稳定的、克隆化的具有AM细胞表型和功能的细胞株已成为急需，而采用永生化技术建立永生化AM细胞株，是解决细胞来源的重要途径之一。

近年来日本学者Harada^[25]和本课题组^[26]分别使用脂质体法转染HPV16E6/E7与SV40大T抗原(SV40)的方法尝试建立永生化AM细胞株，转染后细胞能够较稳定的增殖传代，同时仍保持了上皮细胞的特性，尽管两个实验各有一定不足，如：学者Harada导入HPV16基因片段较大，不能保证AM-1是否发生了恶性转化，其体内接种成瘤的生物学行为也未见报道；两位学者均采用脂质体转染法进行实验，不能保证目的基因的稳定表达；此外，HPV6和SV40均为DNA病毒，并不参与AM发生及发展的过程等，但以上研究为AM细胞永生化研究提供了实验的可能和经验。

研究表明，端粒动力学(telomere dynamics)是正常肿瘤组织的发生、发展过程的重要调节因素。正常细胞不表达端粒酶活性，端粒在分裂过程中进行性缩短，最终停止分裂、死亡；某些具有自我更新能力正常组织的快速增殖期、胚胎发育早期阶段以及绝大多数肿瘤组织中均存在端粒酶活性的表达。本实验通过构建含人端粒酶逆转录酶(human Telomerase ReverseTranscriptase，hTERT)基因的逆转录病毒载体，感染细胞激活端粒酶，建立永生化AM细胞株并初步探讨其永生化机制，克服了前期学者研究的缺点，为研究AM发生发展、侵袭特性提供了有价值的体外模型。

发明内容

本发明的目的正是针对现有技术存在的技术缺陷，提出一种永生化AM细胞株的建立方法，本发明的技术方案是这样实现的：

它由以下步骤构成：

(1)、构建pLXSNneo-hTERT逆转录病毒载体：

利用脂质体法将pLXSNneo-hTERT与空载体pLXSNneo转染至PA317细胞后，更换培养基(该培养基为GIBCO 11900干粉，含核糖核酸和脱氧核糖核酸，1000mg/L D-葡萄糖，292mg/LL-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠，2200mg/L碳酸氢钠，Millipore 0.22μm滤膜过滤除菌，PH值：7.0-7.4，内毒素≤0.1ng/ml)，部分细胞逐渐漂起、死亡，第5d未转染PA317细胞全部死亡，转染细胞见少数散在存活，再更换转染细胞培养基(为GIBCO 11900干粉，含核糖核酸和脱氧核糖核酸，1000mg/L D-葡萄糖，292mg/L L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠，2200mg/L碳酸氢钠，Millipore 0.22μm滤膜过滤除菌，PH值：7.0-7.4，内毒素≤0.1ng/ml)，以400ug/ml G418浓度维持培养1W，形成细胞克隆，将细胞克隆扩增后收集上清，得到含有pLXSNneo-hTERT与空载体pLXSNneo的病毒原液，分别命名为PA-hTERT与PA-pLXSN；

(2)、建立永生化AM细胞株，实施步骤包括：

a、配制并包被I型胶原溶液，将AM组织块接种至I型胶原包被的6孔板中，置培养箱中培养5h后，加入含有15％FBS、5mg/ml转铁蛋白和5mg/ml胰岛素的α-MEM培养基，去除少数漂起的组织块继续培养，3d后更换成含有15％FBS、5mg/ml转铁蛋白和5mg/ml胰岛素的α-MEM培养基；

b、待肿瘤细胞爬出后，去除组织块，采用差速消化法去除其中混杂的成纤维细胞，吸取1ml 0.25％胰酶加入培养孔板，摇动15s让胰酶流过所有细胞表面，然后弃去胰酶；直至成纤维细胞样细胞变圆，部分脱壁，加入2ml含有血清的培养基终止消化，弯头吸管吹打成纤维样细胞生长区域，用培养液漂洗后，再加入2ml培养液继续培养，采用0.25％胰酶消化传代；

c、0.25％胰酶消化第一代AM细胞制成P2细胞悬液，以105个/孔细胞接种于6孔板内，CO₂培养箱培养24h，

d、将6孔板中细胞分为A、B、C 3组，A组加入病毒液PA-hTERT，B组细胞加入病毒液PA-pLXSN，C组细胞常规培养传代；

e、将A、B组细胞培养液吸去1ml，加入3ul Polybrene、1ml病毒上清，轻混匀，CO₂培养箱培养；

f、次日更换转染液，至细胞铺满汇合达60％时，更换含15％FBS的α-MEM培养基培养24h；

g、更换含有1000ug/ml G418、15％FBS的α-MEM筛选培养基，隔日换液，经压力筛选后，更换含有800ug/ml G418、15％FBS的α-MEM培养基维持1W，待细胞克隆生长稳定后，更换无抗生素培养基，0.25％胰酶消化，将细胞悬液转至25cm²培养瓶中继续扩增培养，将转染hTERT基因的AM细胞命名为hTERT+-AM，转染空载体细胞命名为pLXSN-AM，做进一步实验检测。

所述PA-hTERT与PA-pLXSN两种病毒液的病毒滴度分别为：PA-hTERT 2.0×10⁶；PA-pLXSN 7.5×10⁵。

本发明与现有技术相比，具有以下显著的进步和突出的特点：通过永生化技术建立永生化AM细胞株，细胞株稳定可靠，符合上皮细胞特征，保证了目的基因的稳定表达，可以进行量化分析，为研究AM发生发展、侵袭特性提供了有价值的体外模型。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是本发明细胞计数实验的细胞生长曲线图。其中a：hTERT⁺-AM细胞；b：未转染AM细胞。横坐标：时间(d)；纵坐标：细胞数(×10⁴个)。

图2是本发明MTT比色实验的细胞生长曲线图。其中a：hTERT⁺-AM细胞；b：未转染AM细胞。横坐标：时间(d)；纵坐标：吸光值。

图3是本发明细胞群体倍增曲线图。其中a：hTERT⁺-AM细胞，细胞稳定增殖，PDL超过100；b：未转染AM细胞，细胞逐渐死亡。横坐标：时间(×10d)；纵坐标：PDL值。

具体实施方式

一、pLXSNneo-hTERT逆转录病毒载体的构建

1.主要材料与试剂

1.1质粒pCIneo-hTERT由美国麻省理工大学Weinberg RA教授赠，含氨苄青霉素(AMP)抗性标记基因，其中hTERT基因片段长度约为3kb。

1.2pLXSNneo逆转录病毒载体由本课题组保存，载体全长5.9kb，筛选标记为新霉素衍生物G418。

1.3大肠杆菌DH5a-α、PA317细胞系与NIH3T3细胞系由本课题组于-80℃冰箱保存。

1.4主要试剂：

1.5实验耗材：6孔细胞培养板、25cm²培养瓶、LB培养板、15ml离心管、细胞冻存管，美国Corning公司；0.45um微孔滤膜、血细胞计数板、1.0ml/1.5ml Eppendorf(EP)管、0.5ml平盖PCR管、0.5ul-10ul、200ul、1000ul灭菌吸头、载玻片、盖玻片，广州威佳科技有限公司。

1.6主要设备：CO₂培养箱、电热恒温水浴箱，美国SHEL LAB公司；倒置显微镜、倒置荧光显微镜，德国ZEISS公司；超净工作台，德国Kendrol Lab公司；台式冷冻离心机，美国Kendro公司；微型高速离心机、梯度PCR仪，德国Eppendorf公司；-80℃超低温冰箱、4℃冰箱，日本三洋公司；超纯水器，德国Sartorius公司；酶标仪，奥地利Tecan公司；紫外分光光度计，美国Variant公司；台式制冷摇床，美国NBS公司；White/UVTransilluminator凝胶成像仪，美国UVP公司。

2.实验方法

2.1.DH5a-α感受态细菌的制备

取-80℃保存的DH5a-α细菌室温下融化，吸取500ul菌液接种于4ml LB培养基中(为GIBCO 11900干粉，含核糖核酸和脱氧核糖核酸，1000mg/L D-葡萄糖，292mg/L L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠，2200mg/L碳酸氢钠，Millipore 0.22μm滤膜过滤除菌，PH值：7.0-7.4，内毒素≤0.1ng/ml)，在220r/min、37℃条件下培养过夜。将上述菌液1ml接种于50ml LB培养基(同上培养基)，220r/min、37℃培养3h。然后将培养液倒入50ml离心管中，4℃、5000r/min离心6min，弃上清，加入新鲜配制、预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液25ml，放置冰上45min，4℃、5000r/min离心8min，弃上清，加入0.1mol/L预冷的CaCl₂溶液2ml重悬沉淀，分装于无菌EP管中，4℃过夜或将感受态细胞冻存于-80℃备用。

2.2.酶切hTERT与pLXSNneo

(1)目的基因hTERT位于质粒pCIneo-hTERT的EcoR I与Sal I位点之间，pLXSNneo载体多克隆位点(MCS)含EcoR I与Xho I酶切位点，酶切hTERT与pLXSNneo为20ul反应体系。体系组份为：

(2)反应条件：37℃恒温水浴酶切1h，反应结束后将酶切产物与DNA Marker按顺序加入0.8％琼脂糖凝胶加样孔中，电压80V条件下进行电泳，时间30min，按说明进行回收、纯化电泳酶切产物hTERT与pLXSNneo，溶解于20ul DNA溶解液，备用。

2.3.连接、转化、筛选和鉴定

2.3.1.连接

重组逆转录病毒载体连接的20ul反应体系如下，反应条件为：16℃、30min。

2.3.2.转化

取3管DH5a-α感受态细菌，200ul/管，溶解后置冰上，分别加入：5ul连接产物、5ul质粒pCIneo-hTERT作为阳性对照、5ul感受态细菌阴性对照。混匀内容物冰上放置30min；42℃恒温水浴静置90s，快速转移至冰浴冷却2min；每管加入37℃预温的LB培养基800ul，37℃、200r/min摇床温育45min，使DH5a-α感受态细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因，然后将菌液均匀涂布于37℃预热的含有100ug/ml氨苄青霉素的琼脂平板表面；将平板置于室温直至表面液体被吸收，倒置平皿，37℃培养过夜。

2.3.3.筛选和鉴定

(1)挑取平皿上的单菌落，接种于3ml含100ug/ml氨苄青霉素LB培养基中，37℃，250r/min摇床中培养，14h后收集培养物，4℃、10000r/min离心5min，提取并纯化重组质粒。

(2)EcoR I和HindIII双酶切重组质粒反应体系：限制性内切酶各0.5ul、10×buffer 2ul、重组质粒10ul、加水补足至20ul，37℃酶切1h。酶切产物于80V电压条件下进行0.8％琼脂糖电泳，时间30min，凝胶成像系统拍照。

(3)重组质粒测序。

(4)重组质粒经酶切、测序鉴定准确后，将含有该质粒的细菌接种至LB培养液中，扩增培养，质粒抽提纯化，紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度后备用。

3.制备病毒包装细胞

3.1.目的基因导入

(1)复苏PA317细胞，含10％FBS的DMEM培养基培养。选择生长良好的细胞，以0.25％胰酶消化后接种于6孔培养板内，每孔约2.0×10⁵个细胞，37℃、5％CO₂培养箱培养，待细胞达约70％汇合时备用。

(2)取3支无菌1.5ml EP管，配制下列溶液：

A液：2ug质粒pLXSNneo-hTERT加入375ul无血清DMEM培养基。

B液：2ug空载质粒pLXSNneo加入375ul无血清DMEM培养基。

C液：12ul Lipofectamine 2000加入375ul无血清培养基。

(3)分别混合A液和C液、B液和C液，室温静置30min，形成Lipofectamine-DNA混合物。

(4)取备用PA317细胞，弃去上清，无血清DMEM洗涤细胞2次。

(5)加入750ul无血清培养液至Lipofectamine-DNA混合物中，轻轻混匀，小心滴加至培养孔中，37℃、5％CO₂培养箱中培养6h。

(6)弃去转染液，加入2ml含20％FBS的DMEM培养基培养48h，更换含10％FBS培养基继续培养48h，获得转染pLXSNneo-hTERT与空载体pLXSNneo的PA317细胞。

3.2.包装细胞筛选

(1)转染后48h，用0.25％胰酶消化未转染PA317细胞和转染后PA317细胞，1∶3传代至6孔板，培养8h后更换含800ug/ml G418、10％FBS的DMEM培养基筛选，48h后换液，维持G418药物浓度直至未转染组细胞全部死亡，挑选转染组病毒包装细胞阳性克隆，扩增培养。

(2)将病毒包装细胞阳性克隆的扩增培养液更换为含有400ug/ml G418、15％FBS的DMEM培养基继续培养1W，更换含10％FBS的DMEM培养基常规培养，待2-3d后培养液明显变黄时收集培养上清液，用0.45um微孔滤膜过滤，分装后-80℃保存备用。

3.3病毒滴度的测定

(1)复苏NIH3T3细胞，含10％FBS的DMEM培养基培养。取生长良好的细胞，以0.25％胰酶消化，接种于6孔板内，在37℃、5％CO₂培养箱中培养至细胞达60％-80％汇合，备用。

(2)将收集制备的两种病毒液作1/10²、1/10³、1/10⁴倍稀释，吸取NIH3T3细胞培养上清，分别吸取1ml不同倍数稀释液加入细胞培养孔中，37℃、5％CO₂培养2h后补加2ml含400ug/ml G418、10％FBS的DMEM培养基继续培养72h。

(3)更换含200ug/ml G418、10％FBS的DMEM培养基培养，期间每隔1d换液，10d后挑选阳性克隆，10％甲醛固定后进行Giemsa染色，计算阳性克隆数。

(4)病毒滴度(CFU/ml)的计算公式：病毒滴度＝克隆数/病毒液体积×稀释度。

结果

1.重组逆转录病毒载体pLXSNneo-hTERT的构建及鉴定

质粒转化至感受态细菌经氨苄青霉素筛选后，阳性对照见克隆菌落，阴性对照未见菌落生长，说明感受态细菌及转化条件正确无误，含有重组质粒的菌落同样见克隆菌落。

重组逆转录病毒载体经EcoR I与HindIII酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后得到约3kb与5kb两个条带，3’端和5’端经测序也表明重组逆转录病毒载体构建无误。

紫外分光光度计分析在A260/A280处的比值分别为1.90，浓度约为1ug/ul，说明载体纯度合格。

2.病毒包装细胞的制备

脂质体法将pLXSNneo-hTERT与空载体pLXSNneo转染至PA317细胞后48h，细胞生长良好，更换含有800ug/ml G418的培养基后，部分细胞逐渐漂起、死亡，第5d未转染PA317细胞全部死亡，转染细胞见少数散在存活，此时更换转染细胞培养基，以400ug/ml G418浓度维持培养1W，细胞克隆形成，将细胞克隆扩增后收集上清，得到含有pLXSNneo-hTERT与空载体pLXSNneo的病毒原液，分别命名PA-hTERT与PA-pLXSN，经测定两种病毒液的病毒滴度分别约为：PA-hTERT2.0×10⁶；PA-pLXSN 7.5×10⁵。

二、永生化AM细胞株的建立及生物学特性

材料与方法

1.主要材料与试剂

1.1组织来源：AM肿瘤组织来源于在中山大学附属口腔医院口腔颌面外科接受手术治疗的1例57岁男性患者，术后病理报告为丛状型AM(病理号：2008-691)。

1.2实验动物：3周龄BALB/C裸小鼠9只，购自南方医科大学实验动物中心，于中山大学北校区实验动物中心饲养并进行实验。

1.3主要试剂：

1.4实验耗材：6、24、96孔细胞培养板、25cm²培养瓶、15ml离心管、细胞冻存管，美国Corning公司；0.22um微孔滤膜、血细胞计数板、1.0ml Eppendorf(EP)管、0.5ml平盖PCR管、0.5ul-10ul、200ul、1000ul灭菌吸头、载玻片、盖玻片，广州威佳科技有限公司。

1.5主要设备：CO₂培养箱、电热恒温水浴箱，美国SHEL LAB公司；倒置显微镜、倒置荧光显微镜，德国ZEISS公司；超净工作台，德国Kendrol Lab公司；台式冷冻离心机，美国Kendro公司；微型高速离心机、梯度PCR仪，德国Eppendorf公司；-80℃超低温冰箱、4℃冰箱，日本三洋公司；电子天平、超纯水器，德国Sartorius公司；酶标仪，奥地利Tecan公司；紫外分光光度计，美国Variant公司；垂直电泳及转移电泳仪，美国BioRad公司；White/UV Transilluminator凝胶成像仪，美国UVP公司。

1.6 Western blot主要试剂的配制：

(1)分离胶配方：

(2)4％浓缩胶配方：

(3)5×SDS上样缓冲液配方：

(4)1×电泳缓冲液配方：

(5)1×转膜缓冲液配方：

(6)TBS缓冲液配方：

(7)TBST缓冲液配方：

2.实验方法

2.1.AM细胞培养与鉴定

2.1.1.I型胶原溶液配制与包被

(1)称取0.1mg I型胶原，在玻璃试管中加入100ml 0.1mol/L的醋酸溶液，室温静置1-3h，直至胶原完全溶解，形成浓度为0.1％(w/v)的原溶液。

(2)小心将10ml氯仿加入试管中液体底部，尽量避免振荡试管，4℃冰箱静置过夜，无菌条件下小心吸取上层含有胶原的母液。

(3)吸取1ml母溶液稀释至10ml，包被6孔板时每个培养孔加入1ml稀释液，室温下晾干，紫外线照射2h，备用。

2.1.2.AM细胞原代培养

(1)细胞培养室及超净工作台常规消毒30min，将手术切除AM组织去除包膜，用含有100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的PBS洗涤3次，每次3min。

(2)将洗涤后的实体组织放入含15％FBS α-MEM培养基中，用眼科剪剪成大小约1mm×1mm×1mm的组织块。

(3)用眼科探针将组织块接种至I型胶原包被的6孔板中，37℃、5％CO₂培养箱中培养5h，加入含有15％FBS、5mg/ml转铁蛋白和5mg/ml胰岛素的α-MEM培养基，去除少数漂起的组织块继续培养，3d后更换成含有15％FBS、5mg/ml转铁蛋白和5mg/ml胰岛素的α-MEM培养基。

(4)待肿瘤细胞爬出后，去除组织块，采用差速消化法去除其中混杂的成纤维细胞。吸取1ml 0.25％胰酶加入培养孔板，稍加摇动15s让胰酶流过所有细胞表面，然后弃去胰酶；在倒置显微镜下观察直至成纤维细胞样细胞变圆，部分脱壁，立即加入2ml含有血清的培养基终止消化；用弯头吸管轻轻吹打成纤维样细胞生长区域，再用少量培养液漂洗1遍，然后加入2ml培养液继续培养，隔日常规用0.25％胰酶消化传代。

2.1.3.AM细胞的免疫细胞化学(Immunocytochemistry，ICC)鉴定

(1)原代培养的AM细胞采用0.25％胰酶消化，制成单细胞悬液。将细胞悬液接种至24孔培养板中，置CO₂培养箱培养2d后取出。PBS振洗2次，加入95％乙醇室温下固定20min，弃去固定液，PBS振洗2次。

(2)在固定好的细胞培养孔中加入2ml 0.75％H₂O₂-PBS(30％H₂O₂5ml+PBS 200ml)，37℃孵育30min，以阻断内源性过氧化物酶。

(3)PBS振洗2次，每次3min。

(4)滴加BSA，在湿盒内37℃孵育30min，消除非特异性染色。

(5)弃去BSA，加入一抗(pCK或Vim，稀释比率1∶100)，湿盒内4℃条件下过夜。

(6)PBS振洗3次，每次3min。

(7)滴加生物素化二抗，湿盒内37℃孵育30min。

(8)PBS振洗3次，每次3min。

(9)滴加ABC复合物，湿盒内37℃孵育30min。

(10)PBS振洗2次，每次3min。

(11)滴加新鲜配制的DAB溶液，室温下置暗处5min。

(12)自来水洗5min，加入苏木素染液染色2min，自来水冲洗。

(13)迅速过1％盐酸乙醇溶液，自来水冲洗，过氨水溶液，自来水冲洗。

(14)逐级脱水，过70％乙醇1次，95％乙醇2次，100乙醇3次，每次1min。

(15)加入PBS，镜下观察，拍照。

2.2.永生化AM细胞株hTERT⁺-AM建立

(1)0.25％胰酶消化第一代AM细胞制成P2细胞悬液，以10⁵个/孔细胞接种于6孔板内，CO₂培养箱培养24h。

(2)将6孔板中细胞分为A、B、C 3组，其中A组加入病毒液PA-hTERT，B组细胞加入病毒液PA-pLXSN，C组细胞常规培养传代。

(3)将A、B组细胞培养液吸去1ml，加入3ul Polybrene、1ml病毒上清，轻混匀，CO₂培养箱培养。

(4)次日更换转染液，至细胞铺满汇合达60％时，更换含15％FBS的α-MEM培养基培养24h。

(5)更换含有1000ug/ml G418、15％FBS的α-MEM筛选培养基，隔日换液，压力筛选1W，然后更换含有800ug/ml G418、15％FBS的α-MEM培养基维持1W，待细胞克隆生长稳定后，更换无抗生素培养基，0.25％胰酶消化，将细胞悬液转至25cm²培养瓶中继续扩增培养，将转染hTERT基因AM细胞命名为hTERT⁺-AM，转染空载体细胞命名为pLXSN-AM。

2.3.永生化细胞株hTERT⁺-AM的生物学特性

2.3.1.倒置显微镜观察

采用倒置相差显微镜对原代培养AM细胞、hTERT⁺-AM细胞及pLXSN-AM细胞进行形态观察，拍照。

2.3.2.转染细胞的ICC鉴定

采用SABC法对转染细胞的pCK、Vim表达情况进行检测，具体步骤同2.1.3。

2.3.3.细胞生长曲线的绘制

2.3.3.1.细胞计数法

(1)取生长状态良好的hTERT⁺-AM细胞，0.25％胰酶消化成细胞悬液并细胞计数，按10⁴个/孔接种至24孔板，CO₂培养箱培养。

(2)每24h取样一次，每次选取4孔用0.25％胰酶消化传代并计数，计算平均值，同时给未消化细胞换液。

(3)直至第6d培养结束，以培养时间为横坐标、细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线，以未转染细胞作对照。(参照图1)

2.3.3.2.MTT比色法

(1)配制MTT液：称取250mg MTT粉，放入小烧杯中，加入50ml PBS搅拌溶解30min(5mg/ml)，用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，分装后-20℃长期保存，频繁使用时放4℃保存。

(2)0.25％胰酶消化hTERT⁺-AM细胞，用含10％FBS的α-MEM培养基制备细胞悬液并计数，以10³个/孔接种至96孔板中，每孔体积200ul，CO₂培养箱培养。

(3)每24h选取6孔，每孔加入MTT液20ul，放入CO₂培养箱继续培养。4h后取出终止培养，小心吸去培养孔内的培养上清，尽量避免触及培养孔底壁，然后每孔加入150ulDMSO，振荡10min。

(4)在Tecan酶标仪上选择490nm波长，测定各孔吸光值(Absorbance，A)，取平均值，记录。待全部取样结束，以培养时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。(参照图2)

2.3.4.细胞群体倍增时间及倍增曲线

(1)细胞群体倍增时间(Doubling time，DT)计算公式：DT＝t·Lg2/(LgN_t-LgN₀)，其中t为细胞培养时间，N₀与N_t分别代表接种细胞时细胞计数及培养t小时后时的细胞计数，每传代10次计算一次DT值，取平均值。

(2)细胞群体倍增数(Population Doublings，PDL)计算公式：PDL＝Log₂(N_h/N_p)，其中N_p与N_h分别代表接种及消化时的细胞计数。

(3)以时间为横坐标，细胞总的PDL值为纵坐标作细胞倍增曲线，未转染AM细胞作为对照。(参照图3)

2.3.5.细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色

(1)SA-β-Gal试剂盒工作染液配方如下：

(2)每传代20次收集一次hTERT⁺-AM细胞，0.25％胰酶消化后接种至6孔板中常规培养24h。

(3)吸去孔板中细胞培养上清液，PBS振洗3min，加入1ml SA-β-Gal固定液，室温固定15min。

(4)吸取固定液，PBS振洗2次，每次3min。

(5)加入1ml新鲜配制的SA-β-Gal染色工作液，轻混匀。

(6)用保鲜膜严密封住6孔板，37℃恒温过夜。

(7)倒置显微镜观察，拍照，以PDL达最大值的未转染AM细胞作对照。

2.3.6.hTERT⁺-AM细胞的端粒酶活性检测

2.3.6.1.PTRAPeze试剂盒组份

2.3.6.2.制备细胞抽提物

(1)使用25cm²培养瓶培养PDL分别为5、15、45、65的hTERT⁺-AM细胞以及PDL值为6的未转染AM细胞至细胞铺满瓶底，0.25％胰酶消化，在离心管中成细胞悬液，细胞数约10⁶个。

(2)PBS洗涤2次，加入1ml预冷的Wash buffer，吹打均匀，冰上放置5min。

(3)4℃、3000r/min离心5min，弃上清。

(4)加入200ul预冷的Lysis solution，吹打均匀，冰上放置30min。

(5)4℃、13000r/min离心30min。

(6)小心将上清液转移至另一EP管中，取样测定蛋白浓度，-80℃保存。

(7)同样方法提取舌癌Tca8113细胞蛋白做阳性对照。

2.3.6.3.PCR扩增

(1)用Lysis buffer将蛋白浓度调整为5ug/ul。在0.5ml PCR管中依次加入下列试剂：

(2)将以上各PCR管于PCR扩增仪上25℃维持30min。

(3)上述PCR管各加入1ul CX primer，混匀，总反应体系为50ul。

(4)在PCR仪上进行扩增，反应条件如下：

94℃，5min；

72℃，5min.

2.3.6.4.电泳分析

(1)按说明配制12.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶：

(2)取5ml电泳液M，用超纯水稀释至500ml，为电泳工作液。

(3)加入适量电泳工作液至电泳巢中，4℃、150V电压下预电泳1h。

(4)取9ul PCR产物加入1ul上样液I，加样后150V电压下运行2h，取出电泳板，切除胶底，将胶体放入染色盒中。

(5)在染色盒中加入20ml染色液，室温下暗处振动孵育30min。

(6)小心倒去染液，加入40ml超纯水，慢速振洗1min，小心倒去振洗液。

(7)在90ml超纯水中加入10ml中和液，10ul显影液，混匀，小心倒入适量至染色盒。室温下，慢速振动孵育6min，小心倒去显影液。

(8)吸取5ml终止液用超纯水稀释至50ml，小心倒入染色盒内，室温下慢速振动孵育30min后小心取出胶体，成像系统拍照。

2.3.7.两步法RT-PCR检测hTERT、p16、p21、p53 mRNA表达

2.3.7.1.细胞总RNA提取

(1)准备工作：实验用各种吸头、EP管等塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水(1mlDEPC水用超纯水稀释至1000ml)中，37℃过夜，然后高温高压消毒备用。

(2)收集hTERT⁺-AM细胞和未转染AM细胞各约10⁶个，置冰上吸去培养液，PBS洗涤2次。

(3)直接加入1ml Trizol试剂，反复吹打，使细胞裂解。

(4)将细胞裂解液转移至1.5ml EP管中，颠倒混匀10s，室温静置5min。

(5)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡混匀15s，室温静置5min。

(6)4℃、12000r/min离心15min。

(7)离心完毕小心取出EP管，见管内液体分上中下3层，小心转移上层约0.5ml液体至新的EP管。

(8)加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。

(9)4℃、12000r/min离心10min。

(10)弃去上清液，见管底部有白色沉淀，加入新鲜预冷75％乙醇(按乙醇∶1‰DEPC＝3∶1配制)1ml，剧烈混匀。

(11)4℃、9000r/min离心5min。

(12)弃去上清，在超净工作台开风机干燥，直至白色沉淀透明(约30min)。

(13)加入DEPC水20ul，置55℃水浴助溶5min。

(14)取1ulRNA稀释至50ul，于紫外分光光度计读数计算RNA浓度，其余置-80冰箱保存备用。

2.3.7.2逆转录合成cDNA

(1)逆转录合成cDNA的反应体系之hTERT⁺-AM细胞

(2)逆转录合成cDNA的反应体系之未转染AM细胞

(3)在PCR仪上设定反应参数：25℃、10min；42℃、60min；70℃、10min；4℃、10min。

反应结束后将产物cDNA于-20℃保存备用。

2.3.7.3.hTERT、p16、p21、p53基因PCR扩增

(1)目的基因引物设计如下：

上述目的基因引物的设计方法参照现有公开文本：①Band V，Zajchowski D，Kulesa V，etal.Human papilloma virus DNAs immortalize normal human mammary epithelial cells and reducetheir growth factor requirements.Proc Natl Acad Sci，1990，87：463-467。②Cao ZY，Zhao J，LiaoQP，et al.Immortalization of human embryonic cervical epithelial cells induced by E6，E7 genes ofhuman papillomavirus 16.Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2004，39(7)：486-488.

(2)PCR反应体系之hTERT

反应参数设定：

94℃，5min；

72℃，5min.

(3)PCR反应体系之p16、p21与p53

反应参数设定：

94℃，2min；

72℃，5min.

(4)反应结束后将PCR产物行2.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外成像系统分析。

2.3.8.Western blot检测hTERT、p16、p21与p53蛋白的表达

(1)提取细胞总蛋白：收集hTERT+-AM细胞和未转染AM细胞各约10⁶个，预冷PBS洗涤3次，转移至1.5ml EP管中，4℃、1200r/min离心5min，弃去上清后置冰上。每EP管细胞加入100ul蛋白提取液(RIPA裂解液∶PMSF＝100∶1)，混匀后冰上裂解30min。4℃、12000r/min离心15min，取上清分装转移至0.5ml的PCR管中，按说明书进行BCA法测定总蛋白量，-80℃保存。

(2)SDS-PAGE电泳：20ul蛋白上清液(含蛋白20-50ug)中加入5ul 5×SDS上样缓冲液，PCR仪中100℃变性5min。按要求配制分离胶与浓缩胶，小心灌胶，凝胶后放入垂直电泳槽，加入电泳缓冲液，将可视Marker及变性的总蛋白样品按顺序上样，60V电压电泳2-3h，直至溴酚蓝到达分离胶底部位置。剥胶，在转膜缓冲液中进行转膜实验。

(3)转膜：转膜专用夹黑面在下，上面依次放置海绵、3层滤纸、电泳凝胶、PVDF膜、3层滤纸、海绵。标记PVDF膜正、反面并去除凝胶与PVDF膜之间的气泡。转膜电泳槽周围放置冰块，60V电压下转膜2h。

(4)封闭：取出PVDF膜，正面向上浸泡与20ml含有5％脱脂奶粉的TBS缓冲液中，室温下脱色摇床上缓慢摇动封闭2h。

(5)免疫反应：用TBST缓冲液将hTERT按1∶500稀释，p53、p21、p16按1∶1000稀释。封闭结束后，TBST缓冲液洗涤3次，每次10min，加入10ml按比例稀释的抗体液，4℃冰箱过夜孵育。弃去一抗反应液，TBST洗涤3次，每次10min，加入10ml TBST稀释的HRP标记二抗(稀释比例1∶5000)，脱色摇床缓慢孵育2h，结束后TBST洗涤3次，每次10min。

(6)显色、曝光：ECL发光液A液与B液各0.5ml混合备用。在保鲜膜上将PVDF膜正面向上放置，滴加发光液显色1-2min。暗室内取出X线胶片曝光约30s，放入显影液2min，定影液5min，自来水冲洗后晾干，拍照分析。

2.3.9.裸鼠致瘤实验

(1)0.25％胰酶常规消化传代，收集hTERT⁺-AM细胞、未转染AM细胞、舌癌Tca8113细胞悬液，细胞密度为2×10⁶个/ml。

(2)将裸鼠随机分为3组。其中3只注射hTERT⁺-AM细胞，3只注射未转染AM细胞，1只注射Tca8113细胞做阳性对照。

(3)每只裸鼠注射3个部位：耳后、背部及腹部皮下，每个部位注射细胞悬液0.5ml，注射后饲养观察。

3.统计学处理

细胞生长特性的资料应用SPSS统计软件进行两独立样本分布位置相同的非参数Wilcoxon秩和检验，当P＜0.05时，认为两组差异具有统计学意义。

结果

1.AM细胞的原代培养

AM组织块接种5h后加入少量含15％FBS、5mg/ml转铁蛋白和5mg/ml胰岛素的α-MEM培养液，多数组织块贴壁，小部分漂起。去除漂起组织块继续培养24h，可见少量细胞由组织块周边爬出，72h半量更换培养液。96h后见大量细胞爬出，细胞在组织块周围呈“同心圆”样生长，以小多边形细胞为主，中间混杂少量梭形细胞。

1W后去除组织块，因为上皮样细胞与成纤维细胞样细胞耐受消化时间不同，细胞传代时利用差速消化法，将AM细胞中混杂的少量成纤维细胞去除，细胞纯化后呈典型的“铺路石”样生长。本实验AM细胞体外传代8次，体外增殖时间43d，细胞PDL值达6，细胞最后停止增殖，逐渐脱落、死亡。免疫细胞化学pCK阳性、Vim阴性，证实细胞为上皮细胞来源。

2.转染前后AM细胞对比

转染并筛选后hTERT⁺-AM与pLXSN-AM细胞形态较未转染AM细胞稍不规则，以多边、多角形细胞为主。相比未转染AM细胞，hTERT⁺-AM细胞培养时增殖迅速，生长稳定，传代、冻存、复苏对细胞增殖无影响；而pLXSN-AM细胞形态变化异常，胞体不规则，增殖速度稍慢，细胞寿命明显缩短，PDL值约为2.5时停止增殖，逐渐死亡。

3.永生化hTERT⁺-AM细胞株的生物学特性

3.1.ICC鉴定：

ICC染色结果显示hTERT⁺-AM细胞pCK阳性、Vim阴性，与未转染AM细胞相同，符合上皮细胞特征。

3.2.细胞生长曲线

细胞计数法及MTT比色法绘制的细胞生长曲线显示：hTERT⁺-AM细胞增殖活跃，接种后短时间即进入对数生长期，而未转染AM细胞增殖缓慢，无明显快速增殖期，两者差别具有统计学意义(P＜0.05)。

3.3.细胞群体倍增时间及倍增曲线

hTERT⁺-AM细胞生长稳定后，每传代10次计算一次细胞群体倍增时间，取平均值得DT＝23.5h。细胞倍增曲线显示hTERT⁺-AM细胞呈现稳定持续增殖状态；未转染AM细胞增殖缓慢，PDL值达6后增殖停滞，两者差异具有统计学意义(P＜0.05)。

3.4.SA-β-Gal染色

hTERT⁺-AM细胞SA-β-Gal染色未见阳性蓝染的衰老信号，并且不受细胞传代次数的影响，PDL为6的未转染AM细胞可见明显的阳性蓝染信号。

3.5.端粒酶活性检测

PDL为5、15、45、65的hTERT⁺-AM细胞均表达明显端粒酶活性，而PDL为6的未转染AM细胞表达与阴性对照相似。

3.6.hTERT、p16、p21与p53mRNA的表达

hTERT⁺-AM细胞可见hTERT基因表达，未转染AM细胞表达阴性；P21、P53基因在未转染AM细胞与hTERT⁺-AM细胞中均有表达，但P16基因仅在未转染细胞中表达，hTERT⁺-AM细胞P16表达丢失。

3.7.hTERT、p16、p21与p53蛋白的表达

p53、p21蛋白在hTERT⁺-AM细胞与未转染AM细胞中均有表达，p16在hTERT⁺-AM细胞中表达丢失，hTERT在未转染AM细胞中几乎未见表达。

3.8.裸鼠致瘤实验

注射hTERT⁺-AM细胞与未转染AM细胞的裸鼠连续观察2个月未见注射部位肿瘤形成，对照组注射舌癌Tca8113细胞的裸鼠2W后皮下形成肿瘤。

序列表

<110>陶谦

<120>永生化AM细胞株的建立方法

<160>5

<170>PatentIn Version 2.1

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<400>1

CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA 20

GGATGAAGCGGAGTCTGGA 39

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

GACATCCCCGATTGAAAGAA 20

TTTACGGTAGTGGGGGAAGG 40

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<400>3

GACACCACTGGAGGGTGACT 20

CAGGTCCACATGGTCTTCCT 40

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<400>4

GGCCCACTTCACCGTACTAA 20

GTGGTTTCAAGGCCAGATGT 40

<210>5

<211>42

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<400>5

CCTTCCTGGGCATGGAGTCC 20

TGGAGCAATGATCTTGATCTTC 42

Claims

1.一种永生化AM细胞株的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、构建pLXSNneo-hTERT逆转录病毒载体：

利用脂质体法将pLXSNneo-hTERT与空载体pLXSNneo转染至PA317细胞后，更换培养基，部分细胞逐渐漂起、死亡，第5d未转染PA317细胞全部死亡，转染细胞见少数散在存活，再更换转染细胞培养基，以400ug/ml G418浓度维持培养1W，形成细胞克隆，将细胞克隆扩增后收集上清，得到含有pLXSNneo-hTERT与空载体pLXSNneo的病毒原液，分别命名为PA-hTERT与PA-pLXSN；

(2)、建立永生化AM细胞株，实施步骤包括：

g、更换含有1000ug/ml G418、15％FBS的α-MEM筛选培养基，隔日换液，经压力筛选后，更换含有800ug/ml G418、15％FBS的α-MEM培养基维持1W，待细胞克隆生长稳定后，更换成无抗生素培养基，0.25％胰酶消化，将细胞悬液转至25cm²培养瓶中继续扩增培养，将转染hTERT基因的AM细胞命名为hTERT+-AM，转染空载体细胞命名为pLXSN-AM。

2.根据权利要求1所述的永生化AM细胞株的建立方法，其特征在于，所述PA-hTERT与PA-pLXSN两种病毒液的病毒滴度分别为：PA-hTERT 2.0×10⁶；PA-pLXSN 7.5×10⁵。