CN105838662A - 一种自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法 - Google Patents

一种自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法，利用刚出生未哺乳仔猪口腔黏膜上皮组织进行原代培养、连续传代培养，最终获得一株纯度高、稳定性好的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系。本发明获得的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系生长迅速、性能稳定，第110代的细胞仍保持着原代细胞的形态特征，核型分析表明细胞没有发生突变。本发明构建的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系为连续传代后自发形成，不存在外源基因的插入和基因突变，作为疫苗研发中的基质细胞，没有生物安全风险。本发明的细胞系可以为分子生物学和病毒学研究提供一个良好的细胞模型，也可用于猪源病毒疫苗的研发。

Description

一种自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法。
背景技术
自然条件下，病毒、细菌等病原体入侵宿主大都是通过口鼻途径。口腔黏膜上皮细胞作为动物免疫系统的第一道防线，是病毒、细菌感染宿主遇到的最早的一类细胞。口腔黏膜上皮细胞表面表达多种模式识别受体，能够识别大多数入侵病原表达的病原体相关分子模式，口腔黏膜免疫是机体天然免疫的重要组成部分。
口腔黏膜上皮细胞体外培养存在很大的困难，传代次数有限，细胞稳定性、均一性很差，极大地限制了相关科学研究和应用。目前国内外尚未有自发永生化的口腔黏膜上皮细胞系报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法，旨在解决口腔黏膜上皮细胞体外培养存在的传代次数有限，细胞稳定性、均一性很差，极大地限制了其应用的问题。
本发明是这样实现的，一种自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，所述自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法包括：
首先将未哺乳的仔猪麻醉后，心脏采血致死。酒精消毒，剪取面颊部位对应的口腔上皮组织，无菌条件下PBS漂洗数遍，除去肉眼可见的非上皮组织，将口腔上皮组织剪成0.2cm×1cm组织块，移入离心管中，加入2.5mg/mLDispaseII溶液；
然后将组织剪成小块，PBS漂洗，离心，接种于培养板，加入原代培养用生长液，置于培养箱中进行培养，每日观察细胞形态及生长情况；
原代细胞生长至80％～90％融合时，吸去培养液，PBS洗一遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞变圆脱落时，加入含10％血清的培养基终止消化，消化后的细胞按1∶2或1∶3的比例进行传代，置于37℃/5％CO2条件下培养，当细胞再次生长至80％～90％融合时，继续传代培养，当传代细胞能够度过衰老危机传代超过50代时，获得自发永生化的细胞系。
进一步，所述PBS含600IU/ml双抗，5μg/mL的两性霉素B。
进一步，所述加入2.5mg/mL DispaseII溶液，4℃消化18～20h；
所述PBS漂洗3遍，1000r/min离心5min，接种于96孔培养板，静置10min。
进一步，所述置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，24h观察有无细菌污染，每3d换一次液，每日动态观察细胞形态及生长增殖情况，培养7～12d。
本发明的另一目的在于提供一种所述自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法建立的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系。
本发明提供的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法，利用刚出生尚未吃初乳的新生仔猪口腔黏膜上皮组织进行原代培养、传代培养最终获得一株纯度高、稳定性好的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系。本发明获得的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系生长迅速、性能稳定，传代110代以后的仍保持着原代细胞的形态特征，核型分析表明细胞没有发生突变。本发明构建的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系为连续传代后自发形成，不存在外源基因的插入和基因突变，作为疫苗研发中的基质细胞，没有生物安全风险。本发明的细胞系可以为分子生物学和病毒学研究提供一个良好的细胞模型，也可用于猪源病毒疫苗的研发。。本发明通过不断传代培养，最终获得了一株自发永生化的仔猪口腔黏膜上皮细胞系；自发永生化的细胞系能够为研究口蹄疫病毒、猪水泡病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒的入侵、复制、致病等机理提供一个可供选择的细胞模型，并为相关病原疫苗的研发提供了基础材料。
与现有技术先比，本发明有以下进步：
1.本发明的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系是保持着正常猪口腔黏膜上皮细胞的基本生物学特性，是研究口蹄疫病毒、猪水泡病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒的入侵、复制、致病等机理的理想的细胞模型。
2.本发明自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞是通过正常体细胞自发永生化获得的，不是通过转基因等细胞工程手段所得，在作为研发猪源病毒疫苗的基质细胞，不存在生物安全隐患。
3.本发明的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系，形态均一，生长迅速，解决了原代猪口腔黏膜上皮细胞培养难的问题。
附图说明
图1是本发明实施例提供的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法流程图。
图2是本发明实施例提供的组织块法培养的原代仔猪口腔黏膜上皮细胞示意图。
图3是本发明实施例提供的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系第100代示意图。
图4是本发明实施例提供的间接免疫荧光鉴定角蛋白表达示意图。
图5是本发明实施例提供的核型分析结果照相示意图。
图6是本发明实施例提供的核型分析结果染色体配对示意图。
图7是本发明实施例提供的第80代永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞致瘤实验示意图。
图8是本发明实施例提供的Hela细胞致瘤实验示意图。
图9是本发明实施例提供的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系第95代细胞周期分布示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法包括以下步骤：
S101：将未哺乳的仔猪麻醉后，心脏采血致死，酒精消毒，剪取面颊部位对应的口腔上皮组织，无菌条件下PBS(含600IU/ml双抗，5μg/mL的两性霉素B)漂洗数遍，除去肉眼可见的非黏膜上皮组织，将口腔黏膜上皮组织剪成0.2cm×1cm组织块，移入离心管中，加入2.5mg/mL DispaseII溶液，4℃消化18～20h；
S102：然后将组织剪成＜1mm3的组织小块，PBS漂洗3遍，1000r/min离心5min，接种于96孔培养板，静置10min，小心加入原代培养用生长液，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，24h观察有无细菌污染，每3d换一次液，每日动态观察细胞形态及生长增殖情况，培养7～12d；
S103：原代细胞生长至80％～90％融合时，吸去培养液，PBS洗一遍，加入0.025％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞变圆脱落时，加入含10％血清的培养基终止消化，消化后的细胞按1∶2或1∶3的比例进行传代，置于37℃/5％CO2条件下培养。当细胞再次生长至80％～90％融合时，继续传代培养。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的说明。
实施例1原代培养仔猪口腔黏膜上皮细胞
将未哺乳的仔猪麻醉后，心脏采血致死，酒精消毒，剪取面颊部位对应的口腔上皮组织，无菌条件下PBS(含600IU/ml双抗，5μg/mL的两性霉素B)漂洗数遍，，除去肉眼可见的非黏膜上皮组织，将口腔黏膜上皮组织剪成0.2cm×1cm组织块，移入离心管中，加入2.5mg/mL Dis paseII溶液，4℃消化18～20h，然后将组织剪成＜1mm3的组织小块，PBS漂洗3遍，1000r/min离心5min，接种于96孔培养板，静置10min，小心加入原代培养用生长液，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，24h观察有无细菌污染，每3d换一次液，每日观察细胞形态及生长情况，培养7～12d。原代培养的猪口腔黏膜上皮细胞见图2，呈典型上皮样细胞特征。
实施例2.传代培养仔猪口腔黏膜上皮细胞
原代细胞生长至80％～90％融合时，吸去培养液，PBS洗一遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞变圆脱落时，加入含10％血清的培养基终止消化，消化后的细胞按1∶2或1∶3的比例进行传代，置于37℃/5％CO2条件下培养。当细胞再次生长至80％～90％融合时，用此方法继续传代培养。目前细胞已传代超过100代(图3)，细胞依然保持着正常上皮细胞的特征。
实施例3.间接免疫荧光法鉴定细胞类型
1.铺板：在24孔细胞培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5cm×0.6cm，将仔猪口腔黏膜上皮细胞用胰酶消化成单细胞，计数后调整细胞浓度至2×105个/mL，每孔中接种0.5mL细胞悬液。
2.固定：待细胞生长至近融合状态(低密度单层)时，用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)洗3遍，加入0.4g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，细胞面朝上，室温固定10min，用PBS洗涤3次，每次3min。
3.穿透：加入1％的Triton穿透液(PBS配制)，37℃作用15min，用PBS洗涤3次，每次3min。
4.封闭：5％的脱脂奶粉PBS溶液，37℃，封闭1h。
5.孵育一抗：甩去封闭液，加入1∶300倍稀释的广谱角蛋白抗体Anti-panCytokeratin antibody[PCK-26](Abcam，货号ab6401)50μL于盖玻片上，放入湿盒内4℃过夜。同时滴加等量PBS溶液代替一抗作为阴性对照，用PBS洗涤3次，每次3min。
6.孵育二抗：弃去PBS，滴加1∶100倍稀释的FITC Goat anti MouseIgG(H+L)，于37℃孵育1h。PBS洗涤3次，每次3min。
7.核染：用DAPI复染，37℃、5min。然后立即在荧光显微镜下观察，照相。
间接免疫荧光结果如图4所示，细胞被绿色荧光标记，说明仔猪口腔黏膜上皮细胞表达角蛋白，是上皮细胞来源。
实施例4.核型分析
1.在培养36h的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞的细胞瓶中添加秋水仙素溶液，使终浓度为0.2μg/mL，于培养箱中继续培养5～6h；
2.倒掉细胞瓶中的培养基，加入2mL 0.25％的胰酶，显微镜下观察细胞变圆脱壁后加入2mL含血清培养基终止消化；
3.收集细胞于15mL离心管中，1000r/min离心10min；
4.加入37℃预热的低渗液(0.075mol/L)5mL，吹打至均匀，37℃水浴15-20min，离心，1200r/min 10min，弃上清；
5.沿管壁缓慢加入固定液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1)0.5-1.0mL，边滴加边震荡均匀，静置5min后离心弃上清；
6.加入3mL固定液，吹打均匀，静置30min，离心弃上清；再次加入3mL固定液，吹打均匀并静置30min；
7.离心弃上清液，根据细胞数量情况，加入1～2mL固定液，吹打细胞制成悬液，悬液呈微白色时为最佳；
8.用滴管吸取细胞悬液，高空滴在冰冻玻片(4℃)上，立即在酒精灯的火焰下过火几次固定，室温下放置，空气干燥后，置-20℃保存备用；
9.Giemsa染色10min，清水冲洗染液，用吹风机吹干；
10.在分裂相区域滴加PBS后，镜检，照相，进行核型分析。
正常猪体细胞有19对染色体。染色体核型分析结果显示，永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞含有19对38条染色体(图5、图6)，没有发生染色体条数变异，明显的XY基因型，与细胞取材来源于雄性小猪一致。
下面结合实验对本发明的应用效果作详细的说明。
细胞致瘤试验
动物试验中使用Hela细胞作为阳性对照，第80代自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞为试验组进行裸鼠致瘤试验。具体操作步骤如下：
1.将处于对数生长期的细胞胰酶消化并计数，调整细胞密度为1×106个/mL。
2.用一次性注射器将0.2mL的细胞悬液注射到裸鼠右侧后腿臀部。
3.饲养裸鼠至肉眼可见瘤体。
4.继续饲养1～2周，结束实验，采集数据。
饲养8d后，Hela细胞对照组裸鼠接种部位有瘤体形成，而自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞接种的裸鼠，臀部无瘤体形成。通过组织切片，可以看出，实验组组织仍保持着正常组织的纹理(图7)；对照组细胞成弥散样分布，排列紊乱，可见大量核分裂相(图8)。结果表明，自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系没有致瘤性。
细胞周期分析
应用流式细胞术分析自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系第95代的生长周期。具体步骤如下：
1.将待测细胞样本制成单细胞悬液，然后1000r/min离心5min，弃上清。
2.用4℃预冷的70％乙醇固定，4℃保存，至少固定18h。
3.调整细胞浓度为106个/mL，取1mL细胞悬液，用PBS洗3次，细胞重悬于1mL PI染液(终浓度为50μg/mL)中，37℃孵育30min，进行流式细胞仪分析。
细胞周期检测结果如图9所示，细胞处于G1期、S期、G2期的比例分别是67.96％、24.13％、7.91％。S期直接反映增殖过程的本质——具有一定时间跨度的大量合成细胞物质以备紧接而至的细胞等分的显著胞内变化，排除人为的周期阻滞，S期所占比例越多说明细胞的增殖活性越好。由此可知S期所占24.13％的自发永生化细胞具有旺盛的分裂增殖能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，其特征在于，所述自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法包括：
首先将未哺乳的仔猪麻醉后，心脏采血致死。酒精消毒，剪取面颊部位对应的口腔上皮组织，无菌条件下PBS漂洗数遍，PBS含600IU/ml双抗，5μg/mL的两性霉素B；除去肉眼可见的非上皮组织，将口腔上皮组织剪成组织块，移入离心管中，加入2.5mg/mL Dispase II溶液；
将表皮组织剪成小块，PBS漂洗，离心，接种于培养板，加入原代培养用生长液，置于37℃、5％CO2条件下培养，每日观察细胞形态及生长情况；
原代细胞生长至80％～90％融合时，吸去培养液，PBS洗一遍，加入0.25％胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞变圆脱落时，加入含10％血清的培养基终止消化，消化后的细胞按1∶2或1∶3的比例进行传代，置于37℃、5％CO2条件下培养，当细胞再次生长至80％～90％融合时，继续传代培养，当传代细胞能够传代超过50代时，获得自发永生化的细胞系。
2.如权利要求1所述的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，其特征在于，所述PBS含600IU/ml双抗，5μg/mL的两性霉素B。
3.如权利要求1所述的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，其特征在于，所述加入2.5mg/mL Dispase II溶液，4℃消化18～20h；
所述PBS漂洗3遍，1000r/min离心5min，接种于96孔培养板，静置10min。
4.如权利要求1所述的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，其特征在于，所述置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，24h观察有无细菌污染，每3d换一次液，每日动态观察细胞形态及生长增殖情况，培养7-12d。
5.一种如权利要求1～4任意一项所述自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法建立的自发永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系。
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