CN107641613A - 异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201733，其细胞形态为典型的成纤维状细胞，染色体众数为4n＝172，染色体数目正确，可以进行冷冻保存及细胞复苏；该细胞系可以连续传代，目前已传代150代以上，且细胞增殖稳定，能提供大量的细胞用于鱼类免疫学及病毒学研究；同时该细胞系可以进行转染和用于基因功能研究，这为进行该鱼的免疫学及病毒学研究奠定了基础，还为多倍体鱼功能基因体外研究奠定了坚实的平台。本发明还提供了异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF的构建方法，以改良四倍体尾鳍鳍组织为材料，将尾鳍组织剪碎后采用组织块贴壁法启动原代培养所获得。

Description

异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于鱼类细胞生物学领域，尤其涉及一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF及其构建方法和应用。

背景技术

真骨鱼类目前是脊椎动物中种类最多的一个类群，确认的物种数目超过了32000个，超过了现存脊椎动物物种数目的一半。早在上个世纪七十年代，Ohno便通过对鱼类染色体和基因组大小关联的一些证据，提出了真核生物中可能存在全基因组加倍的现象(Wholegenome duplication)，即基因复制(Gene duplication)的进化理论，认为早期的脊椎动物进化过程中经历了两轮多倍体化过程。随着基因组信息的大量积累，特别是对一些重要的保守线性复制片段 (Duplicates in synteny)的分析表明，脊椎动物这些复制片段发生复制的时间均很集中，这是对 Ohno提出的假说的佐证。脊椎动物中最繁盛的类群真骨鱼类中很可能还发生了第三次多倍化事件，主要的证据也是发现了复制时间相对较集中的基因及基因家族。由于推测多倍体化发生的时间在几百个百万年之前，大部分科学家只能根据保守的复制基因数和基因组大小来推测多倍化发生的可能性，缺乏更直接的证据。因此，能够获得背景清晰的的多倍化体系来研究脊椎动物中的多倍化问题具有重要意义。

20世纪80年代，本研究室以刘筠院士为首的研究团队，打破了鲤鲫杂交鱼雄性完全不育的传统观念，发现红鲫和湘江野鲤杂交F1代中的部分雄性为完全能育型，通过选育，从中获得了世界上第一例两性可育的异源四倍体鱼。20世纪90年代末以来，本研究室科研团队在成功制备了两性可育异源四倍体鲫鲤的基础上，开展了新型及改良多倍体鱼的研制工作。通过雌核发育和雄核发育方法分别建立了雌核发育和雄核发育二倍体鲫鲤克隆体系，并用之制备了在繁殖力、生长速度、抗逆性都得到了提高的改良四倍体鲫鲤。目前该杂交品系已繁殖到F₂₅代(F₂-F₂₅；4n＝200；或者2n＝4x＝200)。

可育异源四倍体鱼不仅可作为进化生物学基础研究上重要的模式动物，而且在生产应用上同样具有重要价值。利用四倍体鱼与二倍体鱼杂交可以实现不育三倍体鱼的大规模制备，不育三倍体生物可将用于繁殖的能量转化到生长能量方面，形成生长快、个体大、肉肥味美、抗逆性强的经济鱼类，对控制养殖鱼类的过度繁殖和保护天然种质资源也具有重要意义。研究室已利用异源四倍体鲫鲤与日本白鲫杂交，获得了生长速度快、抗逆性强、肉质好、不育的水产养殖良种三倍体湘云鲫；利用改良异源四倍体鲫鲤与高背型二倍体红鲫杂交，获得了具有明显改良性状(体背更高、无须、肉质更鲜)的水产养殖良种湘云鲫2号；这些三倍体鱼已在全国28个省市推广养殖，产生了显著的经济和社会效益。

异源四倍体鱼为在体外开展多倍体鱼抗病抗逆研究提供了良好理想的实验材料，但是长期以来，一直缺少合适的在体外研究四倍体鱼免疫学的合适模型。因此建立四倍体鲫鲤体外细胞系不仅实现了首例人工合成多倍体鱼体外细胞系的建立，并且还可以利用该细胞系在体外研究四倍体鱼这一重要模型抗病、抗逆的分子和细胞生物学机制，在多倍体鱼基础研究及应用研究上均具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前研究四倍体鱼抗病机制缺乏合适的体外细胞系，而提供一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF及其构建方法和应用。

为解决上述问题，本发明提供了一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201733。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF的构建方法，主要包括以下步骤：

(1)从四倍体鲫鲤尾鳍进行取材，消毒漂洗后剪成尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用胎牛血清浸泡后，在DMEM培养基中进行原代培养；

(3)待步骤(2)后得到的细胞生长至形成单层后，加入胰酶进行消化，终止消化后进行传代培养。

上述的构建方法，优选的，所述构建方法具体包括以下步骤：

(1)用浓度为20～30mg/L的高锰酸钾浸泡鱼体10～20min后，再用体积浓度为70％～ 75％的酒精对要取材的四倍体鲫鲤尾鳍进行消毒后，剪取尾鳍组织，用体积浓度为70％～75％的酒精浸泡，再用磷酸缓冲液漂洗后剪成0.5～1mm²的尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用磷酸缓冲液清洗，进行离心，去上清，再用磷酸缓冲液重复清洗，加入尾鳍组织小块5～10倍体积的胎牛血清浸泡0.5～1h，进行离心，去上清后，将得到的尾鳍组织小块均匀接种于培养皿底部，25℃下倒置干贴1～1.5h后，往培养皿中加入DMEM培养基，置于25℃且含体积5％CO₂的培养箱中培养；

(3)当细胞生长至形成单层后，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度0.25％的胰酶进行消化，除去胰酶，加入DMEM培养基终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，以1：1.5～2的细胞数量比进行传代，然后仍置于培养箱中继续培养，待其再次长至单层后，依照上述方法再进行传代培养，将得到的异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF进行细胞冻存和细胞复苏。

本制备方法以四倍体鲫鲤尾鳍成纤维细胞系4nF为转染材料，以PEGFP-N1进行基因转染实验，可以看到明显的绿色荧光存在，证明四倍体鲫鲤尾鳍成纤维细胞系4nF可以用于基因功能研究。本制备方法的尾鳍组织小块在进行干贴前用胎牛血清进行了浸泡，充分吸收了胎牛血清后的尾鳍组织小块，在后续干贴过程中可以更好地维持细胞的活性，大大减少了细胞迁出所需时间(约10-14天左右，便有细胞从组织块中迁出，比不用血清浸泡的对照组要快10天以上)。培养箱中CO₂的作用在于稳定培养基的pH值。

优选的，所述四倍体鲫鲤为3～9月龄的改良四倍体鲫鲤，更优选为无病无伤、鲜活的改良四倍体鲫鲤。

优选的，所述步骤(2)和(3)中的DMEM培养基，其中还包括青霉素、链霉素、人碱性成纤维细胞生长因子和胎牛血清，使青霉素的浓度为100Iμ/mL，链霉素的浓度为100 μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为20ng/mL，胎牛血清的体积百分比为15％～30％。

优选的，所述胎牛血清所占的比例根据培养细胞所处的代数来调整，第一代到第十代细胞用含有体积30％胎牛血清的DMEM培养基培养，第十一代到第三十代细胞培用含有体积 20％胎牛血清的DMEM培养基培养，第三十一代后的细胞用含有体积15％胎牛血清的DMEM 培养基中培养。不仅节省了用料成本，而且可以明显缩短细胞培养的时间。

优选的，所述步骤(1)中，高锰酸钾浸泡时间为10～20min，酒精浸泡时间为10～30s，漂洗遍数为2～3遍；所述步骤(2)中，离心使用的转速为500～800rpm，离心时间为3～5min，磷酸缓冲液重复清洗1～2次，定期更换培养基的方式是每隔5～7天更换培养皿中一半的培养基；所述步骤(3)中，消化时间为1～1.5min。

优选的，所述细胞冻存的具体步骤为：选取生长旺盛且细胞密度达到90％以上的一皿细胞，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度 0.25％的胰酶消化1～1.5min，除去胰酶，加入含有体积15～30％胎牛血清的新鲜DMEM终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，然后将细胞移入冻存管中，以转速为500～800 rpm离心3～5min，去上清，用冻存液悬浮细胞，将冻存管置于冻存盒中，4℃条件下放置1～ 2h，然后移至-20℃条件下放置1～2h，再将其放到-80℃条件下放置12～24h，最后移至液氮罐中保存；所述冻存液中含体积20％的胎牛血清、10％二甲基亚砜和70％DMEM。

优选的，所述细胞复苏的具体步骤为：从液氮罐中取出保存的冻存管，将其管盖朝上置于25℃水中融化，细胞完全融化后用移液器将其轻轻混匀，并转入盛有培养基的培养皿中，放置于25℃的培养箱中培养。

基于一个总的技术构思，本发明还提供一种上述异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF或由上述构建方法得到的异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF在人工合成的不同倍性鱼类抗病毒免疫研发领域的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明提供的异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF，其细胞形态为典型的成纤维状细胞，染色体众数为4n＝172，染色体数目正确，可以进行冷冻保存及细胞复苏；该细胞系可以连续传代，目前已传代150代以上，且细胞增殖稳定，能提供大量的细胞用于鱼类免疫学及病毒学研究；同时该细胞系可以进行转染和用于基因功能研究，这为进行该鱼的免疫学及病毒学研究奠定了基础，还为多倍体鱼功能基因体外研究奠定了坚实的平台。

2、本发明还提供了异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF的构建方法，以改良四倍体鲫鲤尾鳍组织为材料，将尾鳍组织剪碎后采用组织块贴壁法启动原代培养所获得，本方法在原代培养时，采用高锰酸钾对实验鱼整体进行了消毒，降低了细胞培养污染发生的可能；同时在进行干贴前将尾鳍组织小块用胎牛血清进行了浸泡，充分吸收了胎牛血清后的尾鳍组织小块，在后续干贴过程中可以更好地维持细胞的活性，大大减少了细胞迁出所需时间(约10～14天左右，便有细胞从组织块中迁出，比不用血清浸泡的对照组要快10天以上)；此外本方法还对胎牛血清的浓度根据培养细胞所处的代数进行了调整，不仅节省了用料成本，而且可以明显缩短细胞培养的时间。

一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏机构地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201733，保藏时间为2017年2月16日。

四倍体鲫鲤尾鳍的直接来源由湖南师范大学生命科学学院傅永明于2010年8月自行采集于中国湖南省长沙市，原始来源年代久远，无法查证原始采集者和具体获取时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中相差显微镜下低细胞密度的第十代异源四倍体鲫鲤尾鳍成纤维细胞。

图2为本发明中相差显微镜下高细胞密度的第十代异源四倍体鲫鲤尾鳍成纤维细胞。

图3为本发明中异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF的染色体分布图。

图4为本发明中异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF的中期分裂相示意图。

图5为本发明中二倍体红鲫血细胞的DNA含量。

图6为本发明中异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF的DNA含量。

图7为本发明中异源四倍体鱼尾鳍细胞与二倍体、三倍体尾鳍细胞抗病能力比较。

图8为本发明中异源四倍体鱼尾鳍细胞与二倍体、三倍体尾鳍细胞病毒感染多倍体细胞后MAVS基因的转录情况。

图9为本发明中异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF转染PEGFP-N1后的荧光图片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

本发明的一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：C201733。该异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF的构建方法包括如下步骤：

(1)尾鳍取材：取6月龄，无病无伤、鲜活的异源改良四倍体鲫鲤鱼体，用质量浓度为 20mg/L的高锰酸钾浸泡10min，然后用体积浓度为75％的酒精对要取材的四倍体鲫鲤尾鳍进行消毒，置于生物安全柜中剪取尾鳍组织，用体积浓度为75％的酒精浸泡20s，再用磷酸缓冲液漂洗3遍后剪成0.5～1mm²的尾鳍组织小块；

(2)原代培养：将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块收集并置于1.5mL EP管中，加入1mL的磷酸缓冲液进行漂洗，以800rpm的转速进行离心3min，去上清，再用1mL磷酸缓冲液重复清洗1次，加入尾鳍组织小块10倍体积的胎牛血清浸泡1h，以800rpm的转速进行离心3min，去上清后，用无菌的解剖镊将湿润的尾鳍组织小块均匀接种于60mm培养皿底部，25℃下倒置干贴1～1.5h，培养皿中加入适合的培养基，置于25℃含体积5％CO₂的培养箱中培养，一般在10～14天后会有细胞从组织块周围游离出来，每隔5～7天去除培养皿中一半的培养基并添加入新鲜培养基；所述适合的培养基，选用GIBICO公司的DMEM瓶装液体培养基，向培养基中加入青霉素、链霉素、人碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清，使青霉素的浓度为100Iμ/mL，链霉素的浓度为100μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为 20ng/mL，胎牛血清占总体积的15％～30％(第一代到第十代细胞培养于含有30％胎牛血清的DMEM培养基中，第十一代到第三十代细胞培养于含有20％胎牛血清的DMEM培养基中，第三十一代后的细胞培养于含有15％胎牛血清的DMEM培养基中)；

(3)传代培养：当细胞生长至形成单层后，去除培养皿中的培养基并加入3mL磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入500μL质量浓度0.25％的胰酶消化1min，除去胰酶，加入1mL含有胎牛血清的新鲜DMEM终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，以1： 1.5～2的细胞数量比进行传代；然后仍置于培养箱中继续培养，待其再次长至单层后，依照上述方法再进行传代培养，得到所述的异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF；传至第十一代时，培养基中胎牛血清含量减为总体积的20％，传至第三十一代时，培养基中胎牛血清含量减为总体积的15％；从启动原代培养至今，该细胞系已经传至150代，细胞已能稳定增殖，可以定为细胞系，命名为4nF，该细胞系的细胞类型为成纤维细胞(见图1和图2)；

(4)细胞冻存：选取生长旺盛的且细胞密度达到90％以上的一皿细胞，去除培养皿中的培养基并加入3mL的磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入500μL 0.25％的胰酶消化 1min，除去胰酶，加入1mL含有胎牛血清的新鲜DMEM终止消化；用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，将消化好的细胞移入冻存管中，以500rpm的转速离心3min，去上清，用500 μL冻存液(含20％胎牛血清，10％二甲基亚砜，70％的DMEM)悬浮细胞，将冻存管置于冻存盒中，4℃放置1h，然后移至-20℃冰箱中放置1h，再将其放到-80℃放置12h，最后移至液氮罐中保存，并做好记录；

(5)细胞复苏：从液氮罐中取出保存的冻存管，用一次性手套包好，管盖朝上置于25℃水中融化，细胞完全融化后用移液器将其轻轻混匀，并转入盛有培养基的培养皿中，放置于 25℃培养箱培养。

尾鳍组织消毒方法优化：

原代培养时，无菌操作是实验成功的首要条件。由于实验鱼生活在自然水体中，其尾鳍表面含有大量的微生物，而细胞体外培养必须在无菌的操作下进行，因此在原代培养前必须对培养的尾鳍组织进行无菌处理。本方法中我们采用了高锰酸钾和酒精两种消毒剂相结合的方法，对实验鱼体表进行消毒，与单独使用酒精作为唯一消毒剂相比，原代培养被污染的风险降低了50％以上，显著提高了原代培养的成功率。

上述得到的二倍体尾鳍成纤维细胞系的鉴定包括以下两个方面：

1、染色体分析

培养细胞至对数生长期，然后在培养基中加入10μg/mL的秋水仙碱至终浓度为0.1μg/mL，继续培养3h；收集细胞，1000rpm离心5min，去上清；加入5mL磷酸缓冲液洗涤细胞一次，1000rpm离心5min，去上清，加入低渗KCl液讲细胞悬浮并且在室温下静置10 min；以1000rpm离心5min沉淀低渗后的细胞，去上清；加入4mL新鲜配制的卡诺氏固定液(冰醋酸：甲醇＝1：3)，用滴管将细胞轻轻悬浮，室温静置30min，1000rpm离心5min，去上清；细胞重新悬浮于4mL新鲜配制的卡诺氏固定液中，室温静置30min；以1000rpm 离心5min沉淀固定好的细胞，用少量的固定液(1～2mL)重悬细胞，从高处将细胞悬液滴至-20℃预冷的干净的载玻片上，并小心在酒精灯上烤干载玻片的背面；将制备的染色体片用吉姆萨染液染60min，之后用流水洗去染液，烘干备用；在油镜下观察染色体成片，选择25～ 50个良好的分裂相，使用Olympμs CX401显微镜进行拍照保存，统计分析各分裂相中染色体的数目。如图3和图4，结果显示改良四倍体鲫鲤尾鳍成纤维细胞的染色体数目为172，染色体数目正确，可以进行冷冻保存及细胞复苏。

2、流式细胞仪分析

收集4皿已长满的细胞，于4℃预冷的体积75％酒精中固定24h以上，实验前将固定好的细胞用磷酸缓冲液(PBS)洗一遍，1000rpm，3min，吸走PBS，并加500μLDAPI轻轻吸打悬浮细胞，置于暗处染色10min，上机前将细胞悬液过滤，以得到单个悬浮的细胞悬液。测定时，以二倍体红鲫血细胞作参照，测定四倍体鲫鲤尾鳍细胞中DNA含量，测量结果用卡平方检测好适度。如图5和图6，结果表明四倍体鲫鲤尾鳍培养细胞的平均DNA含量为 204，是红鲫血细胞DNA含量的1.96倍。

本发明的异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF可应用于人工合成的不同倍性鱼类抗病毒免疫研发领域，具体包括以下两个方面：

1.不同倍性鱼对病毒的抗病能力比较

1)病毒感染

为检测多倍体鱼细胞系的抗病能力是否存在差异，我们使用SVCV分别对三种细胞进行感染并通过上清液病毒滴度测定和结晶紫染色实验检测细胞的抗病毒能力。利用MOI为 3×10^-3的SVCV感染细胞，结果表明：三倍体细胞的抗病能力明显高于二倍体和四倍体细胞，见图7。

2.病毒感染后不同倍性鱼细胞MAVS基因的mRNA转录水平研究

为了研究在病毒感染过程中宿主细胞内源天然免疫相关基因转录情况是否有所差异，我们选取MAVS基因为主要研究对象并用qPCR对该基因的mRNA转录水平进行检测。本实验使用MOI为SVCV感染二/三/四倍体细胞，感染MOI为3×10^-3，结果表明：SVCV的感染能够导致2nMAVS、3nMAVS和4nMAVS在mRNA水平的表达上调，但感染0h-24h时MAVS 的表达量趋于平稳，直至感染24h后才明显升高并持续上升至60h，见图8；

同时本发明中的四倍体尾鳍细胞系也可直接应用于基因转染及功能分析。以绿色荧光蛋白为例：在转染前的12～24h，接种1×10⁶个细胞于盛有2mL DMEM完全培养基的6孔板中，直到细胞长到90％～95％的满度，转染前1h，将培养基换成不含双抗的培养基，以减少转染过程中对细胞的损伤；取4μg转染质粒用不含双抗也不含有血清的DMEM稀释至250 μL，并用枪头吸打混匀；取10μL Lipofectamin2000用不含双抗也不含有血清的DMEM稀释至250μL，并用枪头吸打混匀，室温静置5min；将混匀的质粒与混匀的转染试剂混合在一起，并将混合液均匀的加到待转染细胞中；在培养箱中培养6～8h后即可将培养基移除，并换入新鲜的完全培养基培养，在细胞转染后48h便可在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光的表达，发现约有10％的细胞表达较强荧光(见图9)，证明异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF可以用于基因功能研究。

综上所述，本发明提供的异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF，其细胞形态为典型的成纤维状细胞，染色体众数为4n＝172，染色体数目正确，可以进行冷冻保存及细胞复苏；该细胞系可以连续传代，目前已传代150代以上，且细胞增殖稳定，能提供大量的细胞用于鱼类免疫学及病毒学研究；同时该细胞系可以进行转染和用于基因功能研究，这为进行该鱼的免疫学及病毒学研究奠定了基础，还为多倍体鱼功能基因体外研究奠定了坚实的平台。本发明还提供了四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF的构建方法，以改良四倍体尾鳍鳍组织为材料，将尾鳍组织剪碎后采用组织块贴壁法启动原代培养所获得，本方法在原代培养时，在进行干贴前将尾鳍组织小块用胎牛血清进行了浸泡，充分吸收了胎牛血清后的尾鳍组织小块，在后续干贴过程中可以更好地维持细胞的活性，大大减少了细胞迁出所需时间(约10-14天左右，便有细胞从组织块中迁出，比不用血清浸泡的对照组要快一周以上)。

Claims (10)

1.一种异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201733。

2.一种如权利要求1所述的异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF的构建方法，主要包括以下步骤：

(1)从四倍体鲫鲤尾鳍进行取材，消毒漂洗后剪成尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用胎牛血清浸泡后，在DMEM培养基中进行原代培养；

(3)待步骤(2)后得到的细胞生长至形成单层后，加入胰酶进行消化，终止消化后进行传代培养。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：

(1)用浓度为20～30mg/L的高锰酸钾浸泡鱼体10～20min后，再用体积浓度为70％～75％的酒精对要取材的四倍体鲫鲤尾鳍进行消毒后，剪取尾鳍组织，用体积浓度为70％～75％的酒精浸泡，再用磷酸缓冲液漂洗后剪成0.5～1mm²的尾鳍组织小块；

(2)将步骤(1)后得到的尾鳍组织小块用磷酸缓冲液清洗，进行离心，去上清，再用磷酸缓冲液重复清洗，加入尾鳍组织小块5～10倍体积的胎牛血清浸泡0.5～1h，进行离心，去上清后，将得到的尾鳍组织小块均匀接种于培养皿底部，25℃下倒置干贴1～1.5h后，往培养皿中加入DMEM培养基，置于25℃且含体积5％CO₂的培养箱中培养；

(3)当细胞生长至形成单层后，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度0.25％的胰酶进行消化，除去胰酶，加入DMEM培养基终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，以1：1.5～2的细胞数量比进行传代，然后仍置于培养箱中继续培养，待其再次长至单层后，依照上述方法再进行传代培养，将得到的异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF进行细胞冻存和细胞复苏。

4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述四倍体鲫鲤为3～9月龄的改良四倍体鲫鲤。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中的DMEM培养基，其中还包括青霉素、链霉素、人碱性成纤维细胞生长因子和胎牛血清，使青霉素的浓度为100Iμ/mL，链霉素的浓度为100μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为20ng/mL，胎牛血清的体积百分比为15％～30％。

6.根据权利要求5所述所述的构建方法，其特征在于，所述胎牛血清所占的比例根据培养细胞所处的代数来调整，第一代到第十代细胞用含有体积30％胎牛血清的DMEM培养基培养，第十一代到第三十代细胞培用含有体积20％胎牛血清的DMEM培养基培养，第三十一代后的细胞用含有体积15％胎牛血清的DMEM培养基中培养。

7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，高锰酸钾浸泡时间为10～20min，酒精浸泡时间为10～30s，漂洗遍数为2～3遍；

所述步骤(2)中，离心使用的转速为500～800rpm，离心时间为3～5min，磷酸缓冲液重复清洗1～2次，定期更换培养基的方式是每隔5～7天更换培养皿中一半的培养基；

所述步骤(3)中，消化时间为1～1.5min。

8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述细胞冻存的具体步骤为：选取生长旺盛且细胞密度达到90％以上的一皿细胞，去除培养皿中的培养基并加入磷酸缓冲液润洗细胞，去除磷酸缓冲液，加入质量浓度0.25％的胰酶消化1～1.5min，除去胰酶，加入含有体积15～30％胎牛血清的新鲜DMEM终止消化，用移液器轻轻吸打使细胞充分分离，然后将细胞移入冻存管中，以转速为500～800rpm离心3～5min，去上清，用冻存液悬浮细胞，将冻存管置于冻存盒中，4℃条件下放置1～2h，然后移至-20℃条件下放置1～2h，再将其放到-80℃条件下放置12～24h，最后移至液氮罐中保存；所述冻存液中含体积20％的胎牛血清、10％二甲基亚砜和70％DMEM。

9.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述细胞复苏的具体步骤为：从液氮罐中取出保存的冻存管，将其管盖朝上置于25℃水中融化，细胞完全融化后用移液器将其轻轻混匀，并转入盛有培养基的培养皿中，放置于25℃的培养箱中培养。

10.一种如权利要求1所述或由权利要求2～9中任一项所述构建方法得到的异源四倍体鲫鲤尾鳍细胞系4nF在人工合成的不同倍性鱼类抗病毒免疫研发领域的应用。