CN103642751B - 一种从人羊膜中制取干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法，具体指一种羊膜中分离上皮细胞和间充质干细胞方法，涉及细胞分离技术领域。通过自制的无菌、高效、稳定的胎盘保护液对胎盘进行采集，利用消化法和爬片法的组合，将羊膜上皮细胞与羊膜间充质干细胞分离开来，分别得到高纯度的羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞。本发明解决了现有技术中存在人羊膜采集污染率高、采集后的细胞活性差，直接影响了后续的细胞分离及培养的问题。是对从人羊膜中分离干细胞的方法进行改良和创新，形成了一套标准化的分离方案，能够更稳定，充分利用羊膜的干细胞资源，无污染，纯度高，细胞数量更多，在保持细胞活性的同时，保证了干细胞的原始特性。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞分离技术，尤其涉及一种羊膜中分离上皮细胞和间充质干细胞方法。
背景技术
羊膜是胚胎期发育的产物，羊膜细胞具有干细胞特性，且不表达人类白细胞抗原HLA-I及HLA-，无异体免疫排斥反应，因此适合用于细胞治疗，羊膜中的干细胞主要有上皮细胞和间充质干细胞。
羊膜上皮细胞具有亚全能干细胞特性，其分化能力强，可向三个胚层分化，并且无致瘤性及伦理学问题，是组织工程和细胞治疗的理想种子细胞。羊膜间充质干细胞有一定多向分化潜能，但相对羊膜上皮细胞其特点主要在于其具有免疫调节及促进造血恢复的功能。这两种细胞各有特点且在羊膜中含量丰富，因此探索有效可行的从羊膜中分离这两种细胞的方法，具有十分重要的意义。 目前广泛使用的酶解法利用胰蛋白酶及胶原酶将羊膜进行消化，并将消化产物接种培养，从而获得羊膜中的干细胞。但是使用胰蛋白酶对细胞损伤过大、消化时间长，导致消化下来的细胞不易贴壁生长，细胞成活率低，而消化时间短又不能得到足够的细胞。另外，分步多次消化会增加操作污染的几率，并使得分离步骤繁琐，且得到的细胞不纯，成功率低。
发明内容
本发明公开了一种从人羊膜中制取干细胞的方法，用以解决现有技术中羊膜采集污染率高、采集后的细胞活性差，直接影响了后续的细胞分离及培养的问题。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，包括采集，分离，培养，冻存，检测；其中，分离过程中，羊膜上皮细胞采用酶消化法，继而羊膜间充质干细胞采用组织爬片法，两者分步连续完成。
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，所述采集包括：
将采集的胎盘，放入含有0.2克/升链霉素和0.12克/升青霉素的D-Hanks液胎盘保护液的无菌袋内，将无菌袋进行密封并放入采集盒，将采集盒放入恒温采集箱，在24小时内将恒温采集箱送至干细胞库。
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，所述恒温采集箱具体温度为2℃～8℃；所述采集胎盘至送入干细胞库的时间为12小时内。
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，所述羊膜上皮细胞的分离具体包括：
将胎盘平铺在面积为400cm²圆盘内，用生理盐水将血丝冲洗干净；
用手术剪剪取整个正面的羊膜；
将羊膜放入面积为200cm²的圆盘中，使之铺展开，用止血钳除去羊膜上的血丝后，放入烧杯中，用生理盐水冲洗5~6次，每次使用100毫升~150毫升生理盐水；
之后通过酶消化法对羊膜进行处理，所述酶消化法具体包括：
将经生理盐水冲洗后的羊膜放入第一血浆瓶中，向其中加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶30毫升；
37℃恒温静止消化，使整块羊膜完全与胰蛋白酶充分接触后，经37℃恒温静止消化8分钟~12分钟；
将羊膜取出，弃消化液，将羊膜置于第二血浆瓶中，加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶30毫升，使整块羊膜完全与胰蛋白酶液充分接触后，经37℃恒温静止消化10分钟~20分钟；
消化结束后，用药勺在第二血浆瓶中将羊膜均匀搅拌0.5分钟~2分钟至消化液变为乳白色浑浊液体，再向其中加入2毫升胎牛血清终止消化；
用止血钳夹起羊膜，用100毫升生理盐水冲洗一遍后，收集消化液和冲洗液，并用100目细胞筛过滤；
将所得细胞悬液进行细胞计数，取50微升细胞悬液与50微升0.4%台盼蓝混匀后，用移液器打入血球计数板中，静置1分钟后，显微镜下观察计数；
过滤后的液体分装于50毫升离心管中，经300G~800G离心机工作5分钟；
将离心所得细胞用含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培养液15毫升吹打混匀后接种于第一个培养瓶中进行培养，或使用DMSO直接冻存。
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，计数过程中对细胞数进行判断，如果细胞数大于2.0×107则直接冻存；否则进行培养，培养至细胞数达到大于2.0×107的标准后进行冻存。
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，所述冻存的具体包括：
取DMSO1.35毫升于15毫升离心管中，再向其中加入3.15毫升的胎牛血清后制成混合液，于4℃环境下静止30分钟以上；
向离心后的细胞中加入全部的混合液（共4.5毫升），再向其中加入9毫升的胎牛血清混匀后，平均加入9个冻存管中，每管1.5毫升；
将所述冻存管置于4℃中10分钟后，放入液氮罐长期保存。
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，在第一血浆瓶中最佳恒温静止消化的消化时间为10分钟；在第二血浆瓶中最佳恒温静止消化的时间为15分钟；消化结束后，最佳搅拌时间为1分钟。
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，对获得的羊膜上皮细胞进行检测，如果发现羊膜上皮细胞中混有羊膜间充质干细胞，则进行如下处理：
去除第一培养瓶中的培养液，用10毫升生理盐水冲洗2遍；
在第一培养瓶中加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶2毫升，经37℃恒温静止消化0.5分钟~1.5分钟；
在显微镜下观察羊膜间充质干细胞，当细胞全部消化下来后，加入0.5毫升胎牛血清终止消化；
向第一培养瓶中加入10毫升生理盐水，混匀后收集培养瓶中的细胞悬液，
将收集到的液体经200G离心工作5分钟；
收集到的羊膜间充质干细胞经计数，接种于培养瓶中，若细胞数在6×106以下接种于T25的培养瓶中，细胞数在6×106及以上接种于T75的培养瓶中，加入培养液继续培养；
第一培养瓶中的羊膜上皮细胞加入含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培养液继续培养；
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，所述羊膜间充质干细胞的分离方法包括：
采用整块组织爬片法，将消化剩余的羊膜放入第一烧杯中，用50毫升生理盐水反复冲洗3次，冲洗后的羊膜置于第二烧杯中晾干；
培养：将整块羊膜铺展在T75培养瓶中，如果羊膜块面积大于培养瓶底面积，可以将羊膜块剪成2-3大块，分别铺展在另外培养瓶中，经37℃培养箱中恒温放置3小时后，缓慢加入5毫升的DMEM/F12（含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF）培养液将羊膜块组织润湿培养；
6天后，全量换液，待细胞爬出至细胞长满培养瓶底面积的30%及以上后，进行传代操作，传代后细胞可进行冻存或用于实验研究。
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，
采用碎块组织爬片法，将消化剩余的羊膜放入第一烧杯中，用50毫升生理盐水反复冲洗3次，冲洗后的羊膜置于第二烧杯中用手术剪将其剪碎至1毫米3的小块；
培养：用药勺将剪好的羊膜块均匀地铺展在T75培养瓶中，羊膜块中间的间隔在0.2cm左右，每个T75培养瓶接种200块羊膜组织，经37℃培养箱中恒温放置3小时后，缓慢加入10毫升的DMEM/F12，DMEM/F12含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF，培养液将所有羊膜组织润湿培养。
6天后，全量换液，待细胞爬出至细胞长满培养瓶底面积的30%及以上后，进行传代操作，传代后细胞可进行冻存或用于实验研究。
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，对羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞的微生物进行检测，具体包括：
需氧厌氧菌检测：将打入细胞培养液的需氧厌氧菌培养瓶一对的条码扫入血培养仪并且编好号码，上入到血培养仪内观察，检测7天，7天后如果结果为阴性即出具细菌检测合格报告，如果检测结果为阳性，则出具阳性报告；
支原体检测：配置两种培养基，支原体肺炎培养基和半流体培养基，将配置好的培养基121.0℃灭菌15分钟，然后进行分装，每份样品接种每种培养基两管，共四管放入36.0℃培养7天，7天以后取每种培养基一管再转种两管，与前面的四管加起来共八管培养21天，每三天观察一次结果；从接种后起28天内如果结果为阴性出具支原体检测阴性报告，如果为阳性则出具支原体阳性检测报告；
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，对羊膜上皮细胞进行验证，具体包括：
通过流式细胞仪进行以下检测：
CD45检测：准备两支流式管，对两支流式管进行编号，一支为质控管一支为样品管，将CD45的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将CD45试剂摇匀，向样品管中加入20微升CD45试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
HLA-DR检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将HLA-DR的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将HLA-DR试剂摇匀，向样品管中加入20微升HLA-DR试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
SSEA-4检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将SSEA-4的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将SSEA-4试剂摇匀，向样品管中加入20微升SSEA-4试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，测阳性结果≧80％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
CD29检测：准备两支流式管，对两支流式管进行编号，一支为质控管一支为样品管，将CD29的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将CD29试剂摇匀，向样品管中加入20微升 CD29试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧80％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
荧光定量PCR，具体检测Naneg、Oct4、Kcf4和SOX2基因的表达量，具体包括以下操作步骤：
步骤一：样品RNA的抽提
从-70℃冰箱取出细胞样品后，放于冰上，后转移至操净台，在细胞样品管中迅速加入1毫升 Trizol试剂，将此样品管标为1号管；待1号管中细胞融化后，用1毫升移液枪反复吹打直至看不见任何不溶物，吸取1毫升细胞样品转移至2号干净无RNA酶的EP离心管中，对样品进行对应编号；
两相分离：将已混合均匀的样品放在掌上离心机离心3s,使管盖的Trizol试剂进入管内；每1毫升的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2毫升的氯仿，盖紧管盖；将已盖紧的2号EP管手动剧烈震荡15s，在15到30℃静置5分钟；4℃下12000r/m离心15分钟；离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层；RNA全部被分配于水相中；水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%；
RNA沉淀：小心地从离心机中拿出已离心好的样品，放在超净台上；将2号管倾斜45º角，将水相上层转移到3号干净无RNA酶的离心管中，切勿碰到管壁和吸到中间层；加入等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，盖紧管盖，写好与之对应的编号；轻轻颠倒5次，使之混匀；混匀后在15到30℃静置10分钟后，于4℃下12000r/m 离心10分钟；此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块；
RNA清洗：移去3号管中的上清液，每1毫升TRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1毫升的75%乙醇（75%乙醇用DEPC水配制），清洗RNA沉淀；盖紧管盖，反复颠倒数次，使沉淀漂浮起来；室温静置5分钟；然后将3号管4℃下7500r/m离心5分钟；
RNA干燥：尽可能的小心吸去3号管中所有乙醇溶液，切勿吸走沉淀；开风机，风干5-10分钟左右；然后使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟；
溶解RNA沉淀：加入适量的RNase-free H2O，静置5分钟；在58℃的的水浴锅中水浴8分钟；从水浴锅中取出溶解好的RNA，在漩涡振荡器上震荡10秒；获得的3号管的RNA溶液保存于-80℃待用；
步骤二：RNA质量检测，采用紫外吸收法测定，具体包括：先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零，然后取少量RNA溶液用TE稀释，稀释的比例为1:100，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液的浓度和纯度；
浓度测定：A260下读值为1表示40 ug RNA/毫升；样品RNA浓度(ug/毫升)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ug/毫升；具体计算如下：
RNA溶于40微克DEPC水中，取5微克，1:100稀释至495微克的TE中，测得A260 =0.21；
RNA浓度= 0.21 ×100 ×40 ug/毫升 = 840 ug/毫升或0.84 ug/微升；
取5微升用来测量以后，剩余样品RNA为35微升，剩余RNA总量为：
35微升×0.84 ug/微升=29.4 ug；
纯度检测：RNA溶液的的比值即为RNA纯度，质量合格的RNA溶液的A260/A280比值范围应为1.8到2.1；
还包括：变性琼脂糖凝胶电泳测定，具体包括：
制胶：取0.3g琼脂糖溶于25.5 毫升MOPS电泳缓冲液中，冷却至60℃，加入2微升荧光染料及5.4毫升的37%甲醛溶液12.3 M。灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 微升溶液；胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1X MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米；10X MOPS电泳缓冲液具体为：MOPS 0.4M pH 7.0，乙酸钠0.1M，EDTA0.01M；
准备RNA样品：取0.2~1.0 µg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加热至70°C孵育5分钟使样品变性；
电泳：上样前凝胶须预电泳5分钟，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm；
紫外透射光下观察并拍照：28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍；还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA组成，低分子量的RNA具体包括tRNA和5S核糖体RNA；在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成；RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带；RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散；用数码照相机拍下电泳结果；
步骤三：样品cDNA合成，具体包括：
反应体系：
将2微升逆转录buffer、0.2微升上游引物、0.2微升下游引物、0.1微升 dNTP、0.5微升 逆转录酶M毫升V、5微升 DEPC水、2微升 RNA模版等反应物于1号离心管内，轻弹管底将溶液充分混合，6000r/m短暂离心30秒；
在1号离心管中加入逆转录酶M毫升V 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即插于冰上，然后加逆转录酶0.5微升，37℃水浴60分钟；
取出1号管后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用；
步骤四：梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因β-actin实时定量PCR；
β-actin阳性模板的标准梯度制备 β-actin阳性模板的浓度为1011，反应前取β-actin阳性模板3微升按10倍稀释，加水27微升并充分混匀，为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用；
反应体系如下：
标准品反应体系：10微升SYBRGreen1染料、0.5微升阳性模板上游引物F、0.5微升阳性模板下游引物R、0.5微升dNTP、1微升 Taq酶、5微升阳性模板DNA、32.5微升ddH2O混合于阳性标准对照管1，轻弹管底将溶液充分混合，6000r/m短暂离心30秒；
管家基因反应体系：10微升SYBR Green 1 染料、0.5微升内参照上游引物F、0.5微升内参照下游引物R、0.5微升 dNTP、1微升 Taq酶、5微升待测样品cDNA、32.5微升 ddH2O混合于检测样本管2，轻弹管底将溶液充分混合，6000r/m短暂离心30秒；
制备好的阳性标准对照管1和检测样本管2同时上机，反应条件为：40个循环，具体为：93℃ 2分钟，93℃ 1分钟，55℃ 2分钟；
步骤五：制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应；
反应体系：2.5微升10× PCR缓冲液、1.5微升MgCl2 溶液、0.5微升上游引物F、0.5微升下游引物R、3微升dNTP混合液、1微升Taq聚合酶、1微升cDNA混合上述反应物于离心管1，轻弹管底将溶液充分混合，6000r/m短暂离心30秒；
反应条件：35个PCR循环，94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟；72℃延伸5分钟；
PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带；
将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度；
步骤六：待测样品的待测基因实时定量PCR
所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系；
体系配置如下：
10微升SYBRGreen1染料、1微升上游引物、1微升下游引物、1微升dNTP、2微升Taq聚合酶、5微升待测样品cDNA、30微升ddH2O混合上述反应物于离心管1，轻弹管底将溶液充分混合，6000r/m短暂离心30秒；
将配制好的离心管1反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应，反应条件为：93℃2分钟预变性，然后40个循环：93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，最后72℃7分钟延伸；
PCR完成后，程序分析结果，查看扩增曲线和表达量变化。
如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，对羊膜间充质干细胞进行验证，具体包括：
流式细胞仪检测：
CD73检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD73的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将CD73试剂摇匀，向样品管中加入20微升CD73试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
CD90检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD90的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将CD90试剂摇匀，向样品管中加入10微升CD90试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
CD105检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD105的control试剂摇匀，向质控管中加入10微升，再将CD105试剂摇匀，向样品管中加入5微克CD105试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
CD45检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD45的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将CD45试剂摇匀，向样品管中加入20微升CD45试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
HLA-DR检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将HLA-DR的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将HLA-DR试剂摇匀，向样品管中加入20微升HLA-DR试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明解决了现有技术中羊膜采集污染率高、采集后的细胞活性差，直接影响了后续的细胞分离及培养的问题，通过自制的无菌、高效、稳定的胎盘保护液对胎盘进行采集，之后利用消化法和爬片法的组合，将羊膜上皮细胞与羊膜间充质干细胞分离开来，分别得到高纯度的羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞，本发明从人羊膜中分离干细胞的方法进行了改良和创新，形成了一套标准化的分离方案，相比现有的技术，此法能够更稳定地从羊膜中先后分离得到人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞，充分利用了羊膜的干细胞资源，且无污染，细胞数量更多，纯度高，在保持细胞活性的同时，保证了干细胞的原始特性。
附图说明
图1是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞验证的第一流式图；
图2是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞验证的第二流式图；
图3是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞验证的第三流式图；
图4是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞验证的第四流式图；
图5是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Naneg的第一示意图；
图6是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Naneg的第二示意图；
图7是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Oct4的第一示意图；
图8是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Oct4的第二示意图；
图9是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Kcf4的第一示意图；
图10是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Kcf4的第二示意图；
图11是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因SOX2的第一示意图；
图12是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因SOX2的第二示意图；
图13是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的流式细胞仪检测间充质干细胞特异性表面抗原的阴性对照流式图；
图14是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的流式细胞仪检测间充质干细胞特异性表面抗原CD73流式图；
图15是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的流式细胞仪检测间充质干细胞特异性表面抗原CD90流式图；
图16是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的流式细胞仪检测间充质干细胞特异性表面抗原CD105流式图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步描述：
一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，包括采集，分离，培养，冻存，检测；其中，分离过程中，羊膜上皮细胞采用酶消化法，继而羊膜间充质干细胞采用组织爬片法，两者分步连续完成。
本发明的采集具体包括：将采集的胎盘，放入含有0.2克/升链霉素和0.12克/升青霉素的D-Hanks液胎盘保护液的无菌袋内，将无菌袋进行密封并放入采集盒，将采集盒放入恒温采集箱，在24小时内用恒温采集箱送至干细胞。
本发明中的胎盘采集一般是在医院中进行的，从医院中采集胎盘样本，将胎盘的样本放入含有保护液的无菌袋内，之后放入采集盒，并对采集盒进行登记；将采集盒运输至干细胞库，并进行登记。
进一步的说明：恒温采集箱具体温度为2℃～8℃，其温度控制在2℃～8℃保存效果最佳；采集胎盘至送入干细胞库的时间为12小时内，将胎盘从采集至入库的时间控制在12小时内效果最佳。
本发明的羊膜上皮细胞的分离具体包括：
将胎盘平铺在面积为400cm²圆盘内，用生理盐水将胎盘上的血丝冲洗干净；
用手术剪剪取整个正面的羊膜；
将羊膜放入面积为200cm²的圆盘中，或者也可以将羊膜放入肾形盘中，使之铺展开，也就是说将羊膜铺展开，用止血钳除去羊膜上的血丝后，放入烧杯中，用生理盐水冲洗5~6次，每次使用100毫升~150毫升生理盐水，上述步骤中去除了血丝，保证了后续酶消化的有效性；
完成羊膜的冲洗之后通过酶消化法对羊膜进行处理，酶消化法具体包括：
预消化工艺：经生理盐水冲洗后的羊膜放入第一血浆瓶中，向其中加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶30毫升；
37℃恒温静止消化：使整块羊膜完全与胰蛋白酶充分接触后，经37℃恒温静止消化8分钟~12分钟，通过对预消化工艺的预消化时间和温度的控制有效去除羊膜表面的杂质，对后续的进一步消化同样具有有益的技术效果；
对羊膜进行再次的消化：将羊膜取出，弃消化液，将羊膜置于第二血浆瓶中，加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶30毫升，使整块羊膜完全与胰蛋白酶液充分接触后，经37℃恒温静止消化10分钟~20分钟，通过对消化时间和温度的控制，使得在保证细胞分离效率的同时可以保持细胞的活性；
进一步的说明：本发明中在第一血浆瓶中恒温静止消化的最优消化时间为十分钟；在第二血浆瓶中恒温静止消化的最优消化时间为15分钟。
本发明中在消化结束后，用药勺在第二血浆瓶中将羊膜均匀搅拌0.5分钟~2分钟至消化液变为乳白色浑浊液体，再向其中加入2毫升胎牛血清终止消化，其中，用药勺进行搅拌的最佳时间是为1分钟，对搅拌时间进行控制能缩短胰酶消化时间的同时提高细胞得率和细胞活性；
完成搅拌操作后，用止血钳夹起羊膜，用100毫升生理盐水冲洗一遍后，收集消化液和冲洗液，并用100目细胞筛过滤，细胞筛过滤可去除剩余组织块及大颗粒杂质，保证细胞纯净均一；
将所得细胞悬液进行细胞计数，取50微升细胞悬液与50微升0.4%台盼蓝混匀后，用移液器打入血球计数板中，静置1分钟后，显微镜下观察计数；
过滤后的液体分装于50毫升离心管中，经300G~800G下离心5分钟；
将离心所得细胞用含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培养液15毫升吹打混匀后接种于第一个培养瓶中进行培养，或使用DMSO加胎牛血清直接冻存。
进一步说明：在计数过程中对细胞数进行判断，如果细胞数大于2.0×107则直接冻存；否则进行培养，培养至细胞数达到大于2.0×107的标准后进行冻存。
本发明冻存具体包括：
取DMSO1.35毫升于15毫升离心管中，再向其中加入3.15毫升的胎牛血清后制成混合液，于4℃环境下静止30分钟以上；
向离心后的细胞中加入全部的混合液（共4.5毫升），再向其中加入9毫升的胎牛血清混匀后，平均加入9个冻存管中，每管1.5毫升；
将冻存管置于4℃中10分钟后，放入液氮罐长期保存。
在本发明的一个实施例中，对获得的羊膜上皮细胞进行检测，如果发现羊膜上皮细胞中混有间充质干细胞，则进行如下处理：
去除第一培养瓶中的培养液，用10毫升生理盐水冲洗2遍；
在第一培养瓶中加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶2毫升，经37℃恒温静止消化0.5分钟~1.5分钟；
最优的，在37℃恒温静止消化1分钟。
在显微镜下观察间充质干细胞，当细胞全部消化下来后，加入0.5毫升胎牛血清终止消化；
向第一培养瓶中加入10毫升生理盐水，混匀后收集培养瓶中的细胞悬液，
将收集到的液体经200G离心工作5分钟，
收集到的羊膜间充质干细胞经计数，接种于培养瓶中（若细胞数在6×106以下接种于T25的培养瓶中，细胞数在6×106及以上接种于T75的培养瓶中），加入培养液继续培养；
第一个培养瓶中的羊膜上皮细胞加入含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培养液继续培养；
本实施例利用了羊膜上皮细胞与羊膜间充质干细胞贴壁强度的差异，使用胰蛋白酶把容易消化的羊膜间充质干细胞消化下来，而将贴壁牢固的羊膜上皮细胞留在培养瓶中，从而纯化了羊膜上皮细胞，又得到了少量间充质干细胞。
本发明中的羊膜间充质干细胞的分离方法包括：
采用整块组织爬片法进行羊膜间充质干细胞的分离：采用整块组织爬片法，将消化剩余的羊膜放入第一烧杯中，用50毫升生理盐水反复冲洗3次，冲洗后的羊膜置于第二烧杯中晾干；
培养：将整块羊膜铺展在T75培养瓶中，如果羊膜块面积大于培养瓶底面积，可以将羊膜块剪成2-3大块，分别铺展在另外培养瓶中，经37℃培养箱中恒温放置3小时后，缓慢加入5毫升的DMEM/F12（含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF）培养液将羊膜块组织润湿培养；
6天后，全量换液，待细胞爬出至细胞长满培养瓶底面积的30%及以上后，进行传代操作，传代后细胞可进行冻存或用于实验研究。
本发明还可以采用碎块组织爬片法，采用碎块组织爬片法，将消化剩余的羊膜放入第一烧杯中，用50毫升生理盐水反复冲洗3次，生理盐水可以洗去残留在羊膜上的胰酶，从而避免其对间充质干细胞的影响，冲洗后的羊膜置于第二烧杯中用手术剪将其剪碎至1毫米3的小块，组织块大小的控制可以保证后续细胞的爬出效率；
培养：用药勺将剪好的羊膜块均匀地铺展在T75培养瓶中，羊膜块中间的间隔在0.2cm左右，间隔距离的控制既保证了间充质干细胞的爬出的空间，又保证细胞密度与数量，每个T75培养瓶接种200块羊膜组织，经37℃培养箱中恒温放置3小时后，缓慢加入10毫升的DMEM/F12，DMEM/F12含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF，培养液将所有羊膜组织润湿培养。
6天后，全量换液，待细胞爬出至细胞长满培养瓶底面积的30%及以上后，进行传代操作，传代后细胞可进行冻存或用于实验研究。
根据本发明的技术方案，一张完整羊膜可以得到超过1×108个羊膜上皮细胞，经流式检测羊膜上皮细胞细胞表面标识物SSEA-4百分率可高达90%以上，完全能够满足用于科研或细胞治疗，从而解决了因羊膜上皮细胞不易培养扩增带来的细胞数量不够的问题。另外，爬片法得到的间充质干细胞，细胞数量多，活性强，可以经传代扩增后用于临床及科研，是组织工程种子细胞的理想来源。
该实验方法在对羊膜进行分离处理时能够很好控制胰蛋白酶对羊膜上皮细胞的作用，减少对细胞损伤的同时，最大限度的增加了分离所得细胞的数量。根据我们上百例羊膜的分离情况统计，此方法成功率在95%以上，使得羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞的分离达到标准化要求且更易于产业化。
在本发明中可以对羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞进行微生物检测，具体包括：
一、羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞的微生物检测
需氧厌氧菌检测：
将打入细胞培养液的需氧厌氧菌培养瓶一对的条码扫入血培养仪并且编好号码，然后上入到血培养仪内观察，检测7天，七天后如果结果为阴性即出具细菌检测合格报告，如果检测结果为阳性，则出具阳性报告。
支原体检测：
配置两种培养基，支原体肺炎培养基和半流体培养基，将配置好的培养基121.0℃灭菌15分钟，然后进行分装，每份样品接种每种培养基两管，共四管放入36.0℃培养七天，七天以后取每种培养基一管再转种两管，与前面的四管加起来共八管培养21天，每三天观察一次结果。从接种后起28天内如果结果为阴性出具支原体检测阴性报告，如果为阳性则出具支原体阳性检测报告。
二、羊膜上皮细胞的验证：
（一）、流式细胞仪
CD45检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD45的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将CD45试剂摇匀，向样品管中加入20ul CD45试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和样品管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
HLA-DR检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将HLA-DR的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将HLA-DR试剂摇匀，向样品管中加入20ulHLA-DR试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后质控管和样品管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
SSEA-4检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将SSEA-4的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将SSEA-4试剂摇匀，向样品管中加入20ulSSEA-4试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后质控管和样品管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧80％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
（二）、荧光定量PCR（检测Naneg、Oct4、Kcf4和SOX2基因的表达量，引物由专业基因公司合成）以下为操作步骤：
1．样品RNA的抽提
①从-70℃冰箱取出细胞样品后，放于冰上，后转移至操净台，在细胞样品管中迅速加入1毫升 Trizol试剂。将此样品管标为1号管。待1号管中细胞融化后，用1毫升移液枪反复吹打直至看不见任何不溶物，吸取1毫升细胞样品转移至2号干净无RNA酶的EP离心管中，写好与样品对应的编号。
②两相分离 将已混合均匀的样品放在掌上离心机离心3s,使管盖的Trizol试剂进入管内。每1毫升的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2毫升的氯仿，盖紧管盖。将已盖紧的2号EP管手动剧烈震荡15s，在15到30℃静置5分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 小心地从离心机中拿出已离心好的样品，放在超净台上。将2号管倾斜45º角，将水相上层转移到3号干净无RNA酶的离心管中，切勿碰到管壁和吸到中间层。加入等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，盖紧管盖，写好与之对应的编号。轻轻颠倒5次，使之混匀。混匀后在15到30℃静置10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去3号管中的上清液，每1毫升TRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1毫升的75%乙醇（75%乙醇用DEPC水配制），清洗RNA沉淀。盖紧管盖，反复颠倒数次，使沉淀漂浮起来。室温静置5分钟。然后将3号管4℃下7500rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 尽可能的小心吸去3号管中所有乙醇溶液，切勿吸走沉淀。开风机，风干5-10分钟左右。然后使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 加入适量的RNase-free H2O，静置5分钟。在58℃的的水浴锅中水浴8分钟。从水浴锅中取出溶解好的RNA，在漩涡振荡器上震荡10秒。获得的3号管的RNA溶液保存于-80℃待用。
2．RNA质量检测
1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液的浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 ug RNA/毫升。样品RNA浓度(ug/毫升)计算公式为：A260×稀释倍数× 40 ug/毫升。具体计算如下：
RNA溶于40ul DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495ul的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ug/毫升 = 840 ug/毫升 或 0.84 ug/微升
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为：
35 ul × 0.84 ug/ul = 29.4 ug
②纯度检测
RNA溶液的的比值即为RNA纯度，质量合格的RNA溶液的A260/A280比值范围应为1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
取0.3g琼脂糖溶于25.5 毫升MOPS电泳缓冲液中，冷却至60℃，加入2ul荧光染料及5.4毫升的37% 甲醛溶液(12.3 M)。灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 微升溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1X MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。{注：10X MOPS电泳缓冲液（MOPS 0.4M pH 7.0，乙酸钠0.1M，EDTA0.01M）}
②准备RNA样品
取0.2~1.0 µg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加热至70°C孵育5分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5分钟，随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带。RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
3．样品cDNA合成
①反应体系
混合上述反应物于1号离心管内，轻弹管底将溶液充分混合，6000rpm短暂离心30秒。
②在1号离心管中加入逆转录酶M毫升V 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即插于冰上，然后加逆转录酶0.5微升，37℃水浴60分钟。
③取出1号管后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
4．梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 β-actin阳性模板的浓度为1011，反应前取β-actin阳性模板3微升按10倍稀释（加水27微升并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系
混合上述反应物于阳性标准对照管1，轻弹管底将溶液充分混合，6000rpm短暂离心30秒。管家基因反应体系：
混合上述反应物于检测样本管2，轻弹管底将溶液充分混合，6000rpm短暂离心30秒。
③制备好的阳性标准对照管1和检测样本管2同时上机，反应条件为：40个循环（93℃ 2分钟，93℃ 1分钟，55℃ 2分钟）。
5．制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系：
混合上述反应物于离心管1，轻弹管底将溶液充分混合，6000rpm短暂离心30秒。
反应条件：35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72℃延伸5分钟。
②PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
6．待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下：
混合上述反应物于离心管1，轻弹管底将溶液充分混合，6000rpm短暂离心30秒。
②将配制好的离心管1反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后40个循环（93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟），最后72℃7分钟延伸。
PCR完成后，程序分析结果，查看扩增曲线和表达量变化。
三、羊膜间充质干细胞的验证
（一）、流式细胞仪
1.CD73检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD73的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将CD73试剂摇匀，向样品管中加入20ul CD73试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和流式管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
2.CD90检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD90的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将CD90试剂摇匀，向样品管中加入10ul CD90试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和流式管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
3.CD105检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD105的control试剂摇匀，向质控管中加入10ul，再将CD105试剂摇匀，向样品管中加入5ulCD105试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和流式管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
备注：所有细胞表型检测所用试剂的量均为经过实验可行后确定的使用量。
CD45检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD45的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将CD45试剂摇匀，向样品管中加入20ul CD45试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和流式管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
HLA-DR检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将HLA-DR的control试剂摇匀，向质控管中加入20ul，再将HLA-DR试剂摇匀，向样品管中加入20ulHLA-DR试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600ul样品，然后混匀，置于4℃左右避光孵育30分钟，然后向质控管和流式管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240ul的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
本发明还包括羊膜上皮细胞的验证及羊膜间充质干细胞的验证，具体包括：
羊膜上皮细胞的验证
采用本发明的技术方案所取得的效果可以通过一下实验进行验证：
（1）、通过观察可知，培养的羊膜上皮细胞形态：为典型的上皮细胞形态，与现有技术（论文，报道）中的细胞形态完全相同。
（2）、图1是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞验证的第一流式图，为阴性对照；图2是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞验证的第二流式图，为SSEA-4阳性表达，图3是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞验证的第三流式图，为HLA-DR阴性表达，图4是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞验证的第四流式图，为CD45阴性表达。
请参见图1、图2、图3、图4，分离得到的羊膜上皮细胞活性在95%以上，流式细胞仪检测羊膜上皮细胞特异性表面抗原SSEA-4、CD29阳性率在90%左右，CD45、HLAS-DR阴性标记阳性率在0.2%以下。
（3）、图5是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Naneg的第一示意图；图6是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Naneg的第二示意图，图7是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Oct4的第一示意图，图8是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Oct4的第二示意图，图9是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Kcf4的第一示意图，图10是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Kcf4的第二示意图，图11是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因SOX2的第一示意图，图12是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因SOX2的第二示意图，请参见图5~图12，荧光定量PCR检测羊膜上皮细胞表达的胚胎干细胞特异性基因Naneg、Oct4、Kcf4和SOX2，均为高表达。
以上的实验结果可以证明，我们得到的是较纯的羊膜上皮细胞，且细胞保持了较高的原始活性，未产生分化。
3、羊膜间充质干细胞的验证
（1）、培养的羊膜间充质干细胞形态：为典型的间充质干细胞形态，与文献报道完全一致。
（2）、图13是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的流式细胞仪检测间充质干细胞特异性表面抗原的阴性对照流式图，图14是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的流式细胞仪检测间充质干细胞特异性表面抗原CD73流式图，图15是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的流式细胞仪检测间充质干细胞特异性表面抗原CD90流式图，图16是本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法的流式细胞仪检测间充质干细胞特异性表面抗原CD105流式图，请参见13~16，分离得到的羊膜间充质干细胞的细胞活性在95%以上，流式细胞仪检测间充质干细胞特异性表面抗原CD73、CD90和CD105阳性率在均99%以上。
（3）、羊膜间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化：
1）碱性磷酸酶染色：成骨细胞会产生大量碱性磷酸酶，蓝紫色染色为碱性磷酸酶阳性。
2）钙盐沉积染色：成骨细胞会产生钙盐的沉积，橙红色着色为阳性
（4）、羊膜间充质干细胞向肝样细胞的诱导分化：
甲胎蛋白免疫组化，紫色着色为甲胎蛋白阳性细胞。
以上实验结果可以证明，得到的是较纯的羊膜间充质干细胞，且细胞具有较强的多向分化能力。
Claims (8)
1.一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，包括采集，分离，培养，冻存，检测；其中，分离过程中，羊膜上皮细胞采用酶消化法，继而羊膜间充质干细胞采用组织爬片法，两者分步连续完成；
所述采集包括：
将采集的胎盘，放入含有0.2克/升链霉素和0.12克/升青霉素的D-Hanks液胎盘保护液的无菌袋内，将无菌袋进行密封并放入采集盒，将采集盒放入恒温采集箱，在24小时内将恒温采集箱送至干细胞库，所述恒温采集箱具体温度为2℃～8℃；所述羊膜上皮细胞的分离方法包括：
将胎盘平铺在面积为400cm²圆盘内，用生理盐水将血丝冲洗干净；
用手术剪剪取整个正面的羊膜；
将羊膜放入面积为200cm²的圆盘中，使之铺展开，用止血钳除去羊膜上的血丝后，放入烧杯中，用生理盐水冲洗5~6次，每次使用100毫升~150毫升生理盐水；
之后通过酶消化法对羊膜进行处理，所述酶消化法具体包括：
将经生理盐水冲洗后的羊膜放入第一血浆瓶中，向其中加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶30毫升；
37℃恒温静止消化，使整块羊膜完全与胰蛋白酶充分接触后，经37℃恒温静止消化8分钟~12分钟；
将羊膜取出，弃消化液，将羊膜置于第二血浆瓶中，加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶30毫升，使整块羊膜完全与胰蛋白酶液充分接触后，经37℃恒温静止消化10分钟~20分钟；
消化结束后，用药勺在第二血浆瓶中将羊膜均匀搅拌0.5分钟~2分钟至消化液变为乳白色浑浊液体，再向其中加入2毫升胎牛血清终止消化；
用止血钳夹起羊膜，用100毫升生理盐水冲洗一遍后，收集消化液和冲洗液，并用100目细胞筛过滤；
将所得细胞悬液进行细胞计数，取50微升细胞悬液与50微升0.4%台盼蓝混匀后，用移液器打入血球计数板中，静置1分钟后，显微镜下观察计数；
过滤后的液体分装于50毫升离心管中，经300G~800G离心机工作5分钟；
将离心所得细胞用含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培养液15毫升吹打混匀后接种于第一个培养瓶中进行培养，或使用DMSO加胎牛血清直接冻存；
所述羊膜间充质干细胞的分离方法包括：
其中一，采用整块组织爬片法，将消化剩余的羊膜放入第一烧杯中，用50毫升生理盐水反复冲洗3次，冲洗后的羊膜置于第二烧杯中晾干；
培养：将整块羊膜铺展在T75培养瓶中，若羊膜块面积大于培养瓶底面积，将羊膜块剪成2-3大块，分别铺展在另外培养瓶中，经37℃培养箱中恒温放置3小时后，缓慢加入5毫升的DMEM/F12含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF培养液将羊膜块组织润湿培养；
6天后，全量换液，待细胞爬出至细胞长满培养瓶底面积的30%及以上后，进行传代操作，传代后细胞可进行冻存或用于实验研究；
其中二，采用碎块组织爬片法，将消化剩余的羊膜放入第一烧杯中，用50毫升生理盐水反复冲洗3次，冲洗后的羊膜置于第二烧杯中用手术剪将其剪碎至1毫米3的小块；
培养：用药勺将剪好的羊膜块均匀地铺展在T75培养瓶中，羊膜块中间的间隔在0.2cm，每个T75培养瓶接种200块羊膜组织，经37℃培养箱中恒温放置3小时后，缓慢加入10毫升的DMEM/F12，DMEM/F12含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF培养液将所有羊膜组织润湿培养；
6天后，全量换液，待细胞爬出至细胞长满培养瓶底面积的30%及以上后，进行传代操作，传代后细胞可进行冻存或用于实验研究。
2.根据权利要求1所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，所述采集胎盘至送入干细胞库的最佳时间为12小时。
3.根据权利要求1所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，计数过程中对细胞数进行判断，若细胞数大于2.0×107则直接冻存；反之进行培养，培养至细胞数达到大于2.0×107的标准后进行冻存；
所述冻存具体包括：
取DMSO1.35毫升于10毫升离心管中，再向其中加入3.15毫升的胎牛血清后制成混合液，于4℃环境下静止30分钟以上；
向离心后的细胞中加入全部的混合液4.5毫升，再向其中加入9毫升的胎牛血清混匀后，平均加入9个冻存管中，每管1.5毫升；
将所述冻存管置于4℃中10分钟后，放入液氮罐长期保存。
4.根据权利要求1所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，在第一血浆瓶中最佳恒温静止消化的消化时间为10分钟；在第二血浆瓶中最佳恒温静止消化的时间为15分钟；消化结束后，搅拌时间为1分钟。
5.根据权利要求1所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，对获得的羊膜上皮细胞进行检测，若发现羊膜上皮细胞中混有羊膜间充质干细胞，则进行如下处理：
去除第一培养瓶中的培养液，用10毫升生理盐水冲洗2遍；
在第一培养瓶中加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶2毫升，经37℃恒温静止消化0.5分钟~1.5分钟；
在显微镜下观察羊膜间充质干细胞，当细胞全部消化下来后，加入0.5毫升胎牛血清终止消化；
向第一培养瓶中加入10毫升生理盐水，混匀后收集培养瓶中的细胞悬液，将收集到的液体经200G离心工作5分钟；
收集到的羊膜间充质干细胞经计数，接种于培养瓶中，若细胞数在6×106以下接种于T25的培养瓶中，细胞数在6×106及以上接种于T75的培养瓶中，加入培养液继续培养；
第一培养瓶中的羊膜上皮细胞加入含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培养液继续培养。
6.根据权利要求1所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，对羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞的微生物进行检测，具体包括：
经氧厌氧菌检测：将打入细胞培养液的需氧厌氧菌培养瓶一对的条码扫入血培养仪并且编好号码，然后上入到血培养仪内观察，检测7天，7天后若结果为阴性即出具细菌检测合格报告，若检测结果为阳性，则出具阳性报告；
支原体检测：配置两种培养基，支原体肺炎培养基和半流体培养基，将配置好的培养基121.0℃灭菌15分钟，然后进行分装，每份样品接种每种培养基两管，共四管放入36.0℃培养7天，7天以后取每种培养基一管再转种两管，与前面的四管加起来共八管培养21天，每三天观察一次结果；从接种后起28天内若结果为阴性出具支原体检测阴性报告，若为阳性则出具支原体阳性检测报告。
7.根据权利要求1所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，对羊膜上皮细胞进行验证，具体包括：
通过流式细胞仪进行以下检测：
CD45检测：准备两支流式管，对两支流式管进行编号，一支为质控管一支为样品管，将CD45的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将CD45试剂摇匀，向样品管中加入20微升 CD45试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
HLA-DR检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将HLA-DR的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将HLA-DR试剂摇匀，向样品管中加入20微升HLA-DR试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
SSEA-4检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将SSEA-4的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将SSEA-4试剂摇匀，向样品管中加入20微升SSEA-4试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧80％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
CD29检测：准备两支流式管，对两支流式管进行编号，一支为质控管一支为样品管，将CD29的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将CD29试剂摇匀，向样品管中加入20微升 CD29试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧80％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
荧光定量PCR，具体检测Naneg、Oct4、Kcf4和SOX2基因的表达量，具体包括以下操作步骤：
步骤一：样品RNA的抽提
从-70℃冰箱取出细胞样品后，放于冰上，后转移至操净台，在细胞样品管中迅速加入1毫升 Trizol试剂，将此样品管标为1号管；待1号管中细胞融化后，用1毫升移液枪反复吹打直至看不见任何不溶物，吸取1毫升细胞样品转移至2号干净无RNA酶的EP离心管中，对样品进行对应编号；
两相分离：将已混合均匀的样品放在掌上离心机离心3秒,使管盖的Trizol试剂进入管内；每1毫升的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2毫升的氯仿，盖紧管盖；将已盖紧的2号EP管手动剧烈震荡15秒，在15到30℃静置5分钟；4℃下12000转/分钟离心15分钟；离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层；RNA全部被分配于水相中；水相上层的体积是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%；
RNA沉淀：小心地从离心机中拿出已离心好的样品，放在超净台上；将2号管倾斜45º角，将水相上层转移到3号干净无RNA酶的离心管中，切勿碰到管壁和吸到中间层；加入等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，盖紧管盖，写好与之对应的编号；轻轻颠倒5次，使之混匀；混匀后在15到30℃静置10分钟后，于4℃下12000转/分钟 离心10分钟；此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块；
RNA清洗：移去3号管中的上清液，每1毫升TRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1毫升的75%乙醇即75%乙醇用DEPC水配制，清洗RNA沉淀；盖紧管盖，反复颠倒数次，使沉淀漂浮起来；室温静置5分钟；然后将3号管4℃下7500转/分钟离心5分钟；
RNA干燥：尽可能的小心吸去3号管中所有乙醇溶液，切勿吸走沉淀；开风机，风干5-10分钟；然后使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟；
溶解RNA沉淀：加入适量的RNase-free H2O，静置5分钟；在58℃的水浴锅中水浴8分钟；从水浴锅中取出溶解好的RNA，在漩涡振荡器上震荡10秒；获得的3号管的RNA溶液保存于-80℃待用；
步骤二：RNA质量检测，采用紫外吸收法测定，具体包括：先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零，然后取少量RNA溶液用TE稀释，稀释的比例为1:100，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液的浓度和纯度；
浓度测定：A260下读值为1表示40 ug RNA/毫升；样品RNA浓度ug/毫升的计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ug/毫升；
具体计算如下：
RNA溶于40微升DEPC水中，取5微升，1:100稀释至495微升的TE中，测得A260 = 0.21；
RNA浓度= 0.21 ×100 ×40 ug/毫升 = 840 ug/毫升或0.84 ug/微升；
取5微升用来测量以后，剩余样品RNA为35 微升，剩余RNA总量为：
35微升×0.84 ug/微升=29.4 ug；
纯度检测：RNA溶液的比值即为RNA纯度，质量合格的RNA溶液的A260/A280比值范围应为1.8到2.1；
还包括变性琼脂糖凝胶电泳测定，具体包括：
制胶：取0.3g琼脂糖溶于25.5 毫升MOPS电泳缓冲液中，冷却至60℃，加入2微升荧光染料及5.4毫升的37%甲醛溶液12.3 M；
灌制凝胶板，预留加样孔至少加入25 微升溶液；
胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1X MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米；10X MOPS电泳缓冲液具体为：
MOPS 0.4M pH 7.0，乙酸钠0.1M，EDTA0.01M；
准备RNA样品：取0.2~1.0 µg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加热至70°C孵育5分钟使样品变性；
电泳：上样前凝胶须预电泳5分钟，随后将样品加入上样孔；5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm；
紫外透射光下观察并拍照：28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓，上面一条带的密度是下面一条带的2倍；还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA组成，低分子量的RNA具体包括tRNA和5S核糖体RNA；
在18S和28S核糖体带之间一般能看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成；
RNA制备过程中若出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散；
用数码照相机拍下电泳结果；
步骤三：样品cDNA合成，具体包括：
反应体系：
将2微升逆转录buffer、0.2微升上游引物、0.2微升下游引物、0.1微升 dNTP、0.5微升逆转录酶M毫升V、5微升 DEPC水、2微升 RNA模版反应物于1号离心管内，轻弹管底将溶液充分混合，6000转/分钟短暂离心30秒；
在1号离心管中加入逆转录酶M毫升V 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即插于冰上，然后加逆转录酶0.5微升，37℃水浴60分钟；
取出1号管后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用；
步骤四：梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因β-actin实时定量PCR；
β-actin阳性模板的标准梯度制备 β-actin阳性模板的浓度为1011，反应前取β-actin阳性模板3微升按10倍稀释，加水27微升并充分混匀，为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用；
反应体系如下：
标准品反应体系：10微升SYBRGreen1染料、0.5微升阳性模板上游引物F、0.5微升阳性模板下游引物R、0.5微升dNTP、1微升 Taq酶、5微升阳性模板DNA、32.5微升ddH2O混合于阳性标准对照管1，轻弹管底将溶液充分混合，6000转/分钟短暂离心30秒；
管家基因反应体系：10微升SYBR Green 1 染料、0.5微升内参照上游引物F、0.5微升内参照下游引物R、0.5微升 dNTP、1微升 Taq酶、5微升待测样品cDNA、32.5微升 ddH2O混合于检测样本管2，轻弹管底将溶液充分混合，6000转/分钟短暂离心30秒；
制备好的阳性标准对照管1和检测样本管2同时上机，反应条件为：40个循环，具体为：93℃ 2分钟，93℃ 1分钟，55℃ 2分钟；
步骤五：制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应；
反应体系：2.5 微升 10× PCR缓冲液、1.5微升 MgCl2 溶液、0.5 微升上游引物F、0.5微升下游引物R、3 微克 dNTP混合液、1 微升 Taq聚合酶、1 微升 cDNA混合上述反应物于离心管1，轻弹管底将溶液充分混合，6000转/分钟短暂离心30秒；
反应条件：35个PCR循环，94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟；72℃延伸5分钟；
PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带；
将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度；
步骤六：待测样品的待测基因实时定量PCR
所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系；
体系配置如下：
10微升SYBRGreen1染料、1微升上游引物、1微升下游引物、1微升 dNTP、2微升Taq聚合酶、5微升待测样品cDNA、30微升 ddH2O混合上述反应物于离心管1，轻弹管底将溶液充分混合，6000转/分钟短暂离心30秒；
将配制好的离心管1反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应，反应条件为：93℃2分钟预变性，然后40个循环：93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，最后72℃7分钟延伸；
PCR完成后，程序分析结果，查看扩增曲线和表达量变化。
8.根据权利要求1所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，对羊膜间充质干细胞进行验证，具体包括：
流式细胞仪检测：
CD73检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD73的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将CD73试剂摇匀，向样品管中加入20微升CD73试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
CD90检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD90的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将CD90试剂摇匀，向样品管中加入10微升 CD90试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
CD105检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD105的control试剂摇匀，向质控管中加入10微升，再将CD105试剂摇匀，向样品管中加入5微升CD105试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≧95％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
CD45检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将CD45的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将CD45试剂摇匀，向样品管中加入20微升 CD45试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告；
HLA-DR检测：准备两支流式管，编号，其中一支为质控管一支为样品管，将HLA-DR的control试剂摇匀，向质控管中加入20微升，再将HLA-DR试剂摇匀，向样品管中加入20微升HLA-DR试剂，然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品，然后混匀，置于4℃避光孵育30分钟，然后向样品管和质控管中分别加入1毫升 PBS，混匀后1500转/分钟离心5分钟，后弃去上清，加入240微升的PBS后混匀上机，检测阳性结果≦2％则为合格，出具细胞表面标记物检测合格报告。
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- 2013-12-06 CN CN201310650384.7A patent/CN103642751B/zh active Active
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