CN114480251A - 羊膜上皮细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种羊膜上皮细胞培养方法，包括以下步骤：S1、羊膜组织提取；S2、用镊子去掉羊膜组织上的血块和杂物，清理干净的羊膜放入一个新的50mL离心管、加入胰酶，没过羊膜，上下颠倒消化清洗；S3、第一次胰酶消化；S4、第二次胰酶消化；S5、原代培养：①去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(0.93×108cells)，接种浓度为2×106个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数5％CO2的饱和湿度的培养箱中进行原代培养；②培养到第3天换液，随后每隔2天换液1次，直至细胞密度达到80％‑90％。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种羊膜上皮细胞培养方法。
背景技术
人羊膜上皮细胞是来源于胎盘的羊膜组织的上皮层，人羊膜上皮细胞具有未分化的胚胎干细胞特性，能表达所有胚胎干细胞的分子标志物，具有向三个胚层组织分化潜能。且因其缺乏端粒酶，而规避了移植后的致瘤风险。人羊膜上皮细胞还不表达HLA抗原，移植后无免疫排斥反应，具有优良的移植免疫耐受特点，且能分泌多种免疫抑制因子和炎症抑制因子，抑制宿主T细胞免疫应答和炎性反应，避免了移植后的免疫排斥与炎症发生。因此，人羊膜上皮细胞是干细胞与再生医学领域的理想种子细胞新资源。
发明内容
本发明的目的，是为了解决背景技术中的问题，提供羊膜上皮细胞培养方法。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
羊膜上皮细胞培养方法，包括以下步骤：
S1、羊膜组织提取；
S2、用镊子去掉羊膜组织上的血块和杂物，清理干净的羊膜放入一个新的 50mL离心管、加入胰酶，没过羊膜，上下颠倒消化清洗；
S3、第一次胰酶消化：①用长镊子捞出羊膜放入玻璃烧杯，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃搅拌消化10min；②长镊子捞出羊膜放入另一玻璃烧杯，弃掉上步骤中的剩余液体，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃搅拌消化30min；③长镊子捞出羊膜放入另一玻璃烧杯，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃继续搅拌消化30min；剩余液体平均分装入6个离心管中，每管加入终止液，细胞筛过滤后4℃，200×g，离心10min；④去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(1.3× 108cells)，接种浓度为2×106个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数 5％CO2的饱和湿度的培养箱中进行原代培养；
S4、第二次胰酶消化：①从步骤S6中捞出的羊膜加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃继续搅拌消化30min，捞出并弃掉羊膜；②剩余液体平均分装入6个离心管中，每管加入终止液至45mL，细胞筛过滤后4℃，200×g，离心10min；
S5、原代培养：①去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(0.93×108cells)，接种浓度为2×106个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数5％CO2的饱和湿度的培养箱中进行原代培养；②培养到第3天换液，随后每隔2天换液1 次，直至细胞密度达到80％-90％。
作为优选，所述步骤S1中羊膜组织提取的具体步骤为：1、点燃酒精灯，准备好无菌的镊子剪刀、托盘、手套；2、往2个玻璃烧杯中分别倒入生理盐水，带上无菌手套，从采集袋中取出胎盘；3、用一把镊子和剪刀辅助，从胎盘上撕下羊膜；4、放入装有生理盐水的玻璃烧杯中清洗，捞出，放入另一装有生理盐水的玻璃烧杯中再次清洗；5、用长镊子将羊膜拎起，用剪刀剪成5cm左右的小段，放入培养皿中。
作为优选，所述步骤S2-S4中胰酶浓度为0.05％。
综上所述，本发明通过羊膜组织获得羊膜上皮细胞，并将其成功分离培养，培养过程相对容易操作，细胞存活率高。
附图说明
图1是本发明羊膜上皮细胞原代分离流程图；
图2是本发明羊膜上皮细胞原代分离及培养图；
图3是本发明羊膜上皮细胞流式细胞术检测表面标志物图。
具体实施方式
以下具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
下面结合附图以实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
羊膜上皮细胞培养方法，包括以下步骤：
1、点燃酒精灯，准备好无菌的镊子剪刀、托盘、手套(如图1A所示)。
2、往2个玻璃烧杯中分别倒入约200mL生理盐水，带上无菌手套，从采集袋中取出胎盘(如图1B所示)。
3、用一把镊子和剪刀辅助，从胎盘上撕下羊膜(如图1C所示)。
4、放入装有生理盐水的玻璃烧杯中清洗，捞出，放入另一装有生理盐水的玻璃烧杯中再次清洗(如图1D所示)。
5、用长镊子将羊膜拎起，用剪刀剪成5cm左右的小段，放入培养皿中(如图1E所示)。
6、用镊子去掉羊膜组织上的血块和杂物，清理干净的羊膜放入一个新的50mL 离心管(如图1F所示)。
7、加入0.05％胰酶，没过羊膜，上下颠倒消化清洗15s(如图1G所示)。
8、用长镊子捞出羊膜放入玻璃烧杯，加入约100mL 0.05％胰酶，置于磁力搅拌器上37℃搅拌消化10min。
9、长镊子捞出羊膜放入另一玻璃烧杯，弃掉步骤8中的剩余液体，加入约 150mL0.05％胰酶，置于磁力搅拌器上37℃搅拌消化30min(如图1H、图1I所示)。
10、长镊子捞出羊膜放入另一玻璃烧杯，加入约150mL 0.05％胰酶，置于磁力搅拌器上37℃继续搅拌消化30min；剩余液体平均分装入6个离心管中，每管加入终止液至45mL，细胞筛过滤后4℃，200×g，离心10min。
11、去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(1.3×108cells)，接种浓度为 2×106个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数5％CO2的饱和湿度的培养箱中进行原代培养。
12、从步骤10中捞出的羊膜加入150mL的0.05％胰酶，置于磁力搅拌器上 37℃继续搅拌消化30min，捞出并弃掉羊膜。
13、剩余液体平均分装入6个离心管中，每管加入终止液至45mL，细胞筛过滤后4℃，200×g，离心10min。
14、去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(0.93×108cells)，接种浓度为2×106个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数5％CO2的饱和湿度的培养箱中进行原代培养。
15、培养到第3天换液，随后每隔2天换液1次，直至细胞密度达到80％-90％。
Claims (3)
1.羊膜上皮细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、羊膜组织提取；
S2、用镊子去掉羊膜组织上的血块和杂物，清理干净的羊膜放入一个新的50mL离心管、加入胰酶，没过羊膜，上下颠倒消化清洗；
S3、第一次胰酶消化：①用长镊子捞出羊膜放入玻璃烧杯，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃搅拌消化10min；②长镊子捞出羊膜放入另一玻璃烧杯，弃掉上步骤中的剩余液体，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃搅拌消化30min；③长镊子捞出羊膜放入另一玻璃烧杯，加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃继续搅拌消化30min；剩余液体平均分装入6个离心管中，每管加入终止液，细胞筛过滤后4℃，200×g，离心10min；④去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(1.3×108cells)，接种浓度为2×106个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数5％CO2的饱和湿度的培养箱中进行原代培养；
S4、第二次胰酶消化：①从步骤S6中捞出的羊膜加入胰酶，置于磁力搅拌器上37℃继续搅拌消化30min，捞出并弃掉羊膜；②剩余液体平均分装入6个离心管中，每管加入终止液至45mL，细胞筛过滤后4℃，200×g，离心10min；
S5、原代培养：①去掉上清，原代培养液重悬细胞，计数(0.93×108cells)，接种浓度为2×106个细胞接种1个100mm培养皿，37℃，体积分数5％CO2的饱和湿度的培养箱中进行原代培养；②培养到第3天换液，随后每隔2天换液1次，直至细胞密度达到80％-90％。
2.根据权利要求1所述的羊膜上皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S1中羊膜组织提取的具体步骤为：1、点燃酒精灯，准备好无菌的镊子剪刀、托盘、手套；2、往2个玻璃烧杯中分别倒入生理盐水，带上无菌手套，从采集袋中取出胎盘；3、用一把镊子和剪刀辅助，从胎盘上撕下羊膜；4、放入装有生理盐水的玻璃烧杯中清洗，捞出，放入另一装有生理盐水的玻璃烧杯中再次清洗；5、用长镊子将羊膜拎起，用剪刀剪成5cm左右的小段，放入培养皿中。
3.根据权利要求1所述的羊膜上皮细胞培养方法，其特征在于，所述步骤S2-S4中胰酶浓度为0.05％。
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