CN106834219A

CN106834219A - 一种子宫内膜干细胞的提取及其构建干细胞库的方法

Info

Publication number: CN106834219A
Application number: CN201710109658.XA
Authority: CN
Inventors: 汪娟
Original assignee: LANHE (SHANGHAI) BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: LANHE (SHANGHAI) BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2017-02-27
Publication date: 2017-06-13

Abstract

本发明提供了一种子宫内膜干细胞的提取及其构建干细胞库的方法，具体得本发明提供了一种子宫内膜干细胞的提取方法，在无菌条件下，对获得的子宫内膜组织材料，进行剪碎处理放入冰浴DMEM/F12培养基中；加入约1‑4倍体积的消化液，37℃消化30‑90min，获得单细胞悬液；离心后，基质细胞和上皮细胞存于上清液中；对分离的细胞悬液进行培养，即获得所述子宫内膜干细胞。使用本发明提供的子宫内膜干细胞的提取方法，获得的子宫内膜干细胞存活率高而且在培养过程中具有较高的增殖能力。

Description

一种子宫内膜干细胞的提取及其构建干细胞库的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种子宫内膜干细胞的提取及其构建干细胞库的方法。

背景技术

干细胞(Stemcell，SC)是一种未分化细胞，这些细胞保持着高度增殖、自我更新和分化潜能的特性。干细胞可以定向分化为血液、骨骼、大脑及皮肤等其他组织。可能作为修复系统修复受损细胞。干细胞又可分为胚胎干细胞，脐血干细胞，成体干细胞及生殖干细胞等类型。干细胞在成体组织中调控成体细胞增殖、分化、凋亡及保持细胞数目的平衡中起到十分重要的作用。

人的子宫内膜是一个高度再生组织，在育龄期妇女中要经历400多次的增殖、分化和脱落。人子宫内膜由腺上皮细胞、间质细胞和血管组成，近年越来越多的研究表明，子宫内膜组织中存在一小群具有强大增殖和多向分化潜能的干细胞，可不断分裂增殖，及时补充脱落的终末分化细胞，使子宫内膜始终保持自我更新和再生能力。在月经周期的不同时期，内膜上皮和间质细胞的集落形成活性无明显差别。进一步的研究发现，内膜间质细胞在增生期的集落形成能力超过分泌期，而上皮细胞在分泌期的集落形成能力更强。因此可以推断，子宫内膜上皮和基质细胞具有子宫内膜干细胞的特性，在子宫内膜周期性脱落，增长中起到关键作用。现代妇产科学研究向细胞、亚细胞及分子水平发展，在体外成功的培养子宫内膜干细胞可为研究细胞的生长分化、代谢以及激素作用机制提供一个理想的实验模型。

由于子宫内膜组织中干细胞存量较少，因此，本领域技术人员致力于开发高效地子宫内膜干细胞提取方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种子宫内膜干细胞的提取及其构建干细胞库的方法。

本发明的第一方面提供了一种子宫内膜干细胞的提取方法，所述方法包括步骤：

1)预处理

在无菌条件下，对获得的子宫内膜组织材料，进行剪碎处理放入冰浴DMEM/F12培养基中；

2)消化

加入约1-4倍体积的消化液，消化液中含胶原酶I(50U/ml)和胶原酶IV(50U/ml)，37℃消化30-90min，获得单细胞悬液；将消化好的单细胞悬液移入离心管，静置几分钟去除剩余的大块组织；离心后，基质细胞和上皮细胞存于上清液中；

3)原代培养

将步骤2)分离的细胞悬液接种于培养瓶中，培养基为DMEM/F12培养基，含5-20％(v/v)胎牛血清、1％(w/v)青/链霉素，37℃、5％C0₂培养箱孵育，即获得所述子宫内膜干细胞。

进一步地，步骤1)中，将子宫内膜组织材料剪碎至0.5-2mm³。

进一步地，步骤2)中，加入约2-3倍体积的消化液。

进一步地，步骤2)中，所述消化液中还包括亚硫酸氢钠。

优选地，所述亚硫酸氢钠的浓度为5-20mg/ml，更优选为10mg/ml。

进一步地，步骤2)中，37℃消化50-60min。

进一步地，步骤2)中，离心条件为1000-1800rpm离心2-5min。

进一步地，步骤2)中，离心条件为1500rpm离心3min。

进一步地，步骤2)中，加入约2-3倍体积的消化液。

进一步地，步骤3)中，细胞接种密度为3×10⁴-3×10⁵个/ml。

进一步地，步骤3)中，细胞接种密度为2×10⁵个/ml。

进一步地，步骤3)中，培养基为DMEM/F12培养基，含10％(v/v)胎牛血清。

本发明的第二方面提供了一种构建子宫内膜干细胞库的方法，所述方法包括步骤:

a)根据本发明第一方面的方法提供子宫内膜干细胞；

b)对步骤a)中获得的子宫内膜干细胞进行传代培养。

使用本发明提供的子宫内膜干细胞的提取方法，获得的子宫内膜干细胞存活率高而且在培养过程中具有较高的增殖能力

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为P8子宫内膜干细胞的显微照片。

图2显示了Nestin染色情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1子宫内膜干细胞的原代培养

因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者(手术前3个月未服用激素类药物)，组织学诊断未发现子宫内膜有病理性改变。与患者签署知情同意书，并本着对患者尊重、保密及公正的原则进行取材，并保证患者的隐私不受伤害。

1)预处理

在无菌条件下取内膜全层+子宫肌层5mm，取材远离病变部位，缓冲液(PBS)冲洗干净后，移入无菌的培养皿中，剪至lmm³大小放入冰浴DMEM/F12培养基(美国Hyclone)中。

2)消化

实验组1：在培养皿中加入约2倍体积的胶原酶I(100U/ml)，37℃消化50-60min，获得单细胞悬液。将消化好的单细胞悬液移入离心管，静置几分钟去除剩余的大块组织。1500rpm离心3min，基质细胞和上皮细胞存于上清液中。

实验组2：在培养皿中加入约2倍体积的消化液，消化液中含胶原酶I(50U/ml)和胶原酶IV(50U/ml)，37℃消化50-60min，获得单细胞悬液。将消化好的单细胞悬液移入离心管，静置几分钟去除剩余的大块组织。1500rpm离心3min，基质细胞和上皮细胞存于上清液中。

实验组3：在培养皿中加入约2倍体积的消化液，消化液中含胶原酶I(50U/ml)、胶原酶IV(50U/ml)和亚硫酸氢钠(10mg/ml)，37℃消化50-60min，获得单细胞悬液。将消化好的单细胞悬液移入离心管，静置几分钟去除剩余的大块组织。1500rpm离心3min，基质细胞和上皮细胞存于上清液中。

3)原代培养

用台盼兰染色计数活细胞。

按照2×10⁵个/ml的细胞密度分别接种于75cm²的培养瓶中，DMEM/F12培养基中包含10％胎牛血清、青链霉素溶液，37℃、5％C0₂培养箱孵育，72h后更换培养液，弃去未贴壁的细胞，以后每2-3天换液一次，并观察细胞生长情况。各组三个平行。

实验组3培养的原代细胞如图1所示。原代细胞呈梭形，胞浆丰富透明，呈现中间稍宽两端尖的形态，细胞核呈卵圆形。

各实验组分离的干细胞活细胞数如表1所示。

表1

实验结果表明，实验组3的提取的活细胞数显著高于实验组1和实验组2，并且实验组3提取获得干细胞，细胞增殖能力显著更强，原代培养7天后的活细胞数达到了实验组1的5倍以上。

实施例2子宫内膜干细胞贴壁细胞的形态及传代

原代培养的子宫内膜细胞多呈长梭形和纺锤形，贴壁细胞增殖迅速，细胞集落明显增大、增多。将当原代细胞长至80％-90％进行传代：去除培养液，加消化液(0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA液)消化，用等量血清终止消化，1300r/min10min离心，去上清，加入传代培养基，吹打散细胞，按5×10³个/ml传代，37℃、5％C0₂培养箱孵育，72h后更换培养液，以后每2-3天换液一次。传代培养依次标记为P1、P2至P10。

传代培养基为DMEM/F12培养基含15％(v/v)的胎牛血清、1％(w/v)两性霉素、1％(w/v)青/链霉素。

实施例3传代过程中进行细胞克隆增殖能力的检测。

调整细胞悬液细胞密度后，分别以300个基质细胞/cm²接种于6孔培养板中37℃、5％C0₂进行培养。对照组和实验组的传代培养基如实施例2中所用。观察细胞生长情况，每2-3d换液1次，并每天观察细胞集落形成情况。在培养的第15d，出现肉眼可见的细胞克隆时，终止培养，弃去培养液，洗涤2次干燥后，结晶紫染色，然后在显微镜下计数细胞大于50的克隆数。各组设置三个平行。

克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100％。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状，实验结果表明，实验组3的干细胞的增殖能力显著强于实验组1。

表1

实施例4.流式细胞术和免疫细胞化学检测鉴定干细胞表面标记

选取生长状态良好的实验组各传代的细胞集落，离心收集细胞，弃上清洗涤细胞两次，制成浓度为1x10⁶L^-1细胞悬液，分别加入10微升CD29、CD45、CD90、CD34、CD73和CD133抗体(BD公司)，4℃避光孵育30分钟。孵育完成后液洗涤细胞两次以去除未结合的抗体，重悬细胞后，用流式细胞仪检测CD29、CD45、CD90、CD34、CD73和CDl33的表达率。

经流式细胞术鉴定，扩增传代的各代细胞均具有预期的干细胞特性。说明各传代细胞仍然保持了干细胞特性。

免疫细胞化学检测

将实验组3的P8子宫内膜干细胞培养至对数生长期，待细胞长满瓶底后消化，调节细胞浓度为10⁸/L接种于12孔培养板，每孔1.5mL，贴壁48h后40g/L多聚甲醛固定，进行nestin免疫细胞化学染色，DAB显色，检测Nestin阳性细胞表达面积。

图2显示了Nestin染色情况。

实施例5.子宫内膜干细胞成脂、成骨诱导分化

1)成脂分化

取实验组3第8代细胞，2×10⁴细胞/孔接种于12孔板中。细胞达到70％-80％融合时，吸去培养基，加入成脂分化培养基，成脂分化培养基在IMDM培养基中补充10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10mmol/LL-谷氨酰胺、10μmol/L胰岛素(Sigma公司)、200μmol/L吲哚美辛(Sigma公司)、1μmol/L地塞米松和0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，Sigma公司)。每隔2-3d更换新鲜的培养基。分化诱导21天后，进行油红O油滴染色。

成脂诱导分化21天，油红O染色后在倒置显微镜下观察，细胞质中充满红色的油滴，提示细胞已经分化呈脂肪细胞。

2)成骨分化

取实验组3第8代细胞，2×10⁴细胞/孔接种于12孔板中。细胞达到70％-80％融合时，吸去培养基，加入成骨分化培养基，成骨分化培养基在低糖IMDM培养基中补充有10％胎牛血清、100μmol/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸盐和100mmol/L地塞米松(Sigma公司)。每隔2-3d换液新鲜的成脂分化培养基。分化诱导21天后，用茜素红进行油滴染色。

成骨诱导分化21天后，运用茜素红进行钙化结节染色，致密生长的细胞中散现大小不一的橘红色矿化结节。染色结果显示扩增的子宫内膜干细胞均有成骨分化能力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种子宫内膜干细胞的提取方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

1)预处理

2)消化

3)原代培养

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，将子宫内膜组织材料剪碎至0.5-2mm³。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，加入约2-3倍体积的消化液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述消化液中还包括亚硫酸氢钠。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述亚硫酸氢钠的浓度为5-20mg/ml，更优选为10mg/ml。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，37℃消化50-60min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，离心条件为1000-1800rpm离心2-5min。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，离心条件为1500rpm离心3min。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，加入约2-3倍体积的消化液。

10.一种构建子宫内膜干细胞库的方法，其特征在于，所述方法包括步骤:

a)根据权利要求1所述的方法提供子宫内膜干细胞；

b)对步骤a)中获得的子宫内膜干细胞进行传代培养。