CN114164178A - 可示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可示踪脐带间充质干细胞，所述可示踪脐带间充质干细胞过表达LMP‑1蛋白，其制备方法包括以下步骤：1)提供脐带间充质干细胞；2)构建慢病毒表达载体pLVX‑LMP‑1‑T2A；3)慢病毒包装；4)用重组慢病毒感染脐带间充质干细胞，得到修饰有LMP‑1基因的脐带间充质干细胞。本发明通过脐带间充质干细胞过表达LMP‑1基因，能显著上调蛋白聚糖基因、成骨蛋白基因，从而可以增加透明样基质的合成，维持椎间盘细胞的软骨样形态，再结合间充质干细胞可分化为成体细胞的优点，能持续补充椎间盘各个组织凋亡的细胞类型，从而能够著减缓或逆转椎间盘细胞的退化，可以为治疗椎间盘退行性疾病提供可靠的新方案。

Description

可示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种可示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用。

背景技术

下腰痛(Low Back Pain，LBP)是一种常见的脊柱健康问题。在一项全球系统性的调查中，在特定的时间内，一般人群中下腰痛的平均患病率约为18％，一年患病率约为38％。因此，减少下腰痛相关的致残率，降低与下腰痛相关的医疗开支，可以带来显著的社会和经济效益。

下腰痛的病因复杂，虽然没有直接证据，但椎间盘退行性病变被认为是主要原因[Urits I,Burshtein A,Sharma M,et al.Low Back Pain,a Comprehensive Review:Pathophysiology,Diagnosis,and Treatment[J].Curr Pain Headache Rep 2019,23:23.]。椎间盘(Intervertebral Disc，IVD)是人体中最大的无血管、无神经的结构，包含许多相互支撑及相互作用的组织。椎间盘是脊柱椎体之间的软组织，允许椎体之间进行有限的相对运动，从而实现通过脊柱传输多方向的负荷。椎间盘由三个主要组织组成：纤维环、髓核、终板软骨。每个组织都具有特征性的成分和结构，使得它们提供独特的机械性能。纤维环位于椎间盘的外层，呈密闭的环状多层结构将凝胶状的髓核包裹在中间；髓核位于纤维环中间，由纤维网状结构的软骨细胞和蛋白多糖粘液样的基质构成，含水量大；薄片状的终板软骨位于椎间盘上下两面将纤维环和髓核夹在中间。这些组织之间的相互作用使推间盘实现其功能。椎间盘细胞种类较多，但不同部位细胞含量不一致，其中纤维环含量最少，但细胞表型较为稳定；髓核含量较多，但细胞表型不稳定且容易老化。固体-流体相互作用在介导生物组织的粘弹性功能中有重要作用。在椎间盘中,水的含量是由若干因素影响的，包括年龄、疾病和机械负荷等。

椎间盘退行性病变(Disc Degenerative Diseases，DDD)是当今社会上一种比较常见的腰背腿疼疾病，这种疾病发病率高，危害大，是造成很多人运动障碍的首要原因。在美国大约有75％-85％的人一生中至少有过一次因为椎间盘病变而引起的腰背疼痛，随着国内人口老龄化的加剧，以及生活方式的改变，椎间盘疾病的发病率也是与日俱增，而且患病人群朝着年轻化发展，这些无不严重影响正常生活，同时对此病的治疗也带来了巨大的挑战。椎间盘退变的明确原因尚不清楚，但是就目前的研究来看，这种疾病的发生与遗传，椎间盘的老化，超负荷工作，炎症，椎间盘营养物质代谢失衡等因素密切相关。但究其根本原因椎间盘退变主要表现在髓核细胞活力降低，细胞数量减少和细胞外基质合成减少(合成减少和降解增加)，纤维环老化和软骨终板钙化。对于椎间盘退行性疾病的治疗手段主要有药物治疗和手术治疗，但是这些治疗方法不能从根本上抑制椎间盘的病变，而且手术治疗还可能破坏椎间盘的结构，从而加速了病变过程。因此，迫切需要找到一种直接保留和/或恢复椎间盘结构和机械功能来治疗椎间盘退行性疾病的新方案。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)也称为间充质基质细胞，最早在1966年被发现于人类骨髓中。MSCs的鉴定主要有以下几点：一、具有黏附性；二、表面特异抗原(包括CD105、CD73、CD90)的表达；三、缺乏造血抗原(例如，对于人：CD45、CD34、CD14、CD90)；四、具有多向分化潜能(主要来源于中胚层)[Celikkan F T,Mungan C,Sucu M,etal.Optimizing the transport and storage conditions of current GoodManufacturing Practice-grade human umbilical cord mesenchymal stromal cellsfor transplantation(HUC-HEART Trial)[J].Cytotherapy,2019,21:64–75.]。MSCs的来源包括：骨髓、脂肪组织、脐带、牙髓和其他组织。越来越多的证据表明，MSC有益的作用主要与它们的旁分泌活性有关。在几种释放的可溶性分子中，MSCs还产生被磷脂双层包围并携带多种生物活性成分的小圆形囊泡，称为细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)。外泌体(exosomes)是细胞外囊泡的一类，越来越多的研究表明，源自间充质干细胞的外泌体在恢复组织稳态和促进组织再生方面发挥着重要作用。在大鼠股骨不连模型中，来自骨髓的间充质干细胞的外泌体可以显著增强骨再生，促进血管再生，并加速骨折愈合[Zhang L,Jiao G,Ren S,et al.Exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells enhancefracture healing through the promotion of osteogenesis and angiogenesis in arat model of nonunion[J].Stem Cell Res Ther.2020,11:38.]；来自脂肪干细胞的外泌体可以促进内皮细胞的血管化[An Y,Zhao J,Nie F,et al.Exosomes from Adipose-Derived Stem Cells(ADSCs)Overexpressing miR-21Promote Vascularization ofEndothelial Cells[J].Sci Rep.2019,9:12861.]；人脐带间充质干细胞分泌的外泌体可促进血管生成和皮肤二度烧伤创面的修复[Zhang B,Wu X,Zhang X,et al.Humanumbilical cord mesenchymal stem cell exosomes enhance angiogenesis throughthe Wnt4/β-catenin pathway[J].Stem Cells Transl Med.2015,4:513-522.]。除了向周围环境分泌外泌体促进细胞生长、繁殖，脐带间充质干细胞还具有多向分化的潜能，可定向分化为椎间盘的组成细胞，从而起到组织修复的作用。

LMP-1是一种细胞内信号分子，主要表达在骨骼中，可以促进骨细胞的增殖分化，1998年科学家成功克隆并测序了LMP-1基因[Boden,S.D.Liu,Y.Hair,G.A.LMP-1,a LIM-domain protein,mediates BMP-6effects on bone formation[J].Endocrinology,1998；139(12).]，LMP基因主要包含两个结构域，C端的LIM域和N端的PDZ域。LIM主要由三个同源蛋白构成，分别是Lin-11、Isl-1、Mec-3。PDZ域也是由三种同源蛋白构成，分别是ZO-1，突触后密集区和Drosophila，相对于其他物种来说PDZ域和LIM域是高度保守的。

间充质干细胞较易获取且具有一定的干性，在一定条件下可以分化成软骨细胞系，从而产生椎间盘细胞外基质成分，进而起到治疗作用。所以利用间充质干细胞与LMP-1基因有望为椎间盘退行性病变的治疗提供新的思路，但现在缺少可靠的方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种可示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种可示踪脐带间充质干细胞，所述可示踪脐带间充质干细胞过表达LMP-1蛋白。

本发明还提供一种如上所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)提供脐带间充质干细胞；

2)将目的基因LMP-1连接到慢病毒载体pLVX上，构建得到慢病毒表达载体pLVX-LMP-1-T2A；

3)慢病毒包装，获得含有LMP-1基因的重组慢病毒；

4)用重组慢病毒感染脐带间充质干细胞，得到修饰有LMP-1基因的脐带间充质干细胞，即为过表达LMP-1蛋白的所述可示踪脐带间充质干细胞。

优选的是，所述步骤2)中，所述慢病毒载体pLVX上还连接有EGFP报告基因，从而构建得到慢病毒表达载体pLVX-LMP-1-T2A-EGFP，最终得到的可示踪脐带间充质干细胞中还修饰有EGFP报告基因。

优选的是，所述步骤1)具体包括：

1-1)洗净脐带，在PBS溶液中分离去除脐动脉、脐静脉以及脐带表面的外膜，再切割成组织块，然后将组织块平铺在培养皿中，加入培养基；以上操作于冰台上进行；

1-2)将培养基置于37℃下培养；

1-3)细胞培养至80％-90％融合率时，消化传代；

1-4)向含有组织块的培养皿中加入PBS缓冲液使多数组织块自然飘起，吸除旧的培养基及漂浮的组织块，并用PBS溶液清洗；

1-5)加入0.25％的Trypsin，37℃恒温箱消化1-2min；

1-6)吸去Trypsin，加培养基终止消化并将细胞吹打均匀；

1-7)将细胞悬液转移到离心管中，离心，吸去上清，留沉淀；

1-8)向沉淀中加入培养基使沉淀重悬，在新的培养皿中加入新鲜培养基，并将细胞悬液均匀滴入，晃匀，37℃培养箱中培养，获得用于感染的脐带间充质干细胞。

优选的是，所述步骤1)具体包括：

1-1)洗净脐带，在PBS溶液中分离去除脐动脉、脐静脉以及脐带表面的外膜，再切割成组织块，然后将组织块平铺在10cm的培养皿中，加入培养基；以上操作于冰台上进行；

1-2)将培养基置于37℃下培养；

1-3)细胞长至80％-90％融合率时，消化传代；

1-4)向含有组织块的培养皿中加入PBS缓冲液使多数组织块自然的飘起，吸除旧的培养基及漂浮的组织块，并用PBS溶液清洗两次；

1-5)加入2ml 0.25％的Trypsin,37℃恒温箱消化1-2min；

1-6)吸去Trypsin，加2ml培养基终止消化并将细胞吹打均匀；

1-7)将细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min下离心5min，吸去上清，留沉淀；

1-8)向沉淀中加入1ml培养基使沉淀重悬，在新的培养皿中加入8-10ml新鲜培养基，并将细胞悬液均匀滴入，晃匀，37℃培养箱中培养，获得用于感染的脐带间充质干细胞。

优选的是，所述步骤2)中，得到慢病毒表达载体pLVX-LMP-1-T2A-EGFP后，通过EcoRI和BamHI对pLVX-LMP-1-T2A-EGFP进行双酶切验证，酶切结果正确后再进行后续处理。

优选的是，所述步骤3)具体包括：

1)将293T细胞铺到培养皿中培养；

2)分别配置质粒转染体系A、体系B：

体系A包括OPTI和PEI，体系B包括OPTI和混合质粒，所述混合质粒包括PMDL、REV、VSVG以及步骤2)得到的pLVX-LMP-1-T2A-EGFP；

3)体系A、体系B配置好后分别静置，然后把B体系逐滴加到A体系中，吹吸数次，静置得到AB混合液；

4)弃去293T细胞上方培养基，然后将AB混合液沿着培养皿侧壁加入，培养；

5)弃去293T细胞上方AB混合液，然后沿着侧壁加入完全培养基，培养；

6)收集病毒上清；

7)将收集的病毒上清放入离心机中，离心去沉淀，留下上清；

8)按照病毒上清：病毒浓缩液的体积比为3:1，向病毒上清中加入病毒浓缩液，然后混匀，孵育过夜；

9)将病毒上清与病毒浓缩液的混合液放入离心机中，离心弃去上清，留下病毒沉淀，然后用PBS重悬得到病毒溶液，存储备用。

优选的是，所述步骤3)具体包括：

1)将293T细胞铺到10厘米的培养皿中培养，使细胞融合度在75-85％；

2)分别配置质粒转染体系A、B：

体系A包括2mL OPTI和50μL PEI，体系B包括2mL OPTI和混合质粒，所述混合质粒包括6.5μg PMDL、3.5μg REV、2.5μg VSVG以及10μg步骤2)得到的pLVX-LMP-1-T2A-EGFP；

3)体系A、体系B配置好后分别静置5分钟，然后把B体系逐滴加到A体系中，吹吸数次，静置10分钟得到AB混合液；

4)弃去293T细胞上方培养基，然后将AB混合液沿着培养皿侧壁加入，培养；

5)8小时后弃去293T细胞上方AB混合液，然后沿着侧壁加入完全培养基，培养；

6)40个小时后收集病毒上清；

7)将收集的病毒上清放入离心机中，4℃下，1000g离心10分钟去沉淀，留下上清；

8)按照病毒上清：病毒浓缩液的体积比为3:1，向病毒上清中加入病毒浓缩液，然后混匀，4℃下孵育过夜；

9)将病毒上清与病毒浓缩液的混合液放入离心机中，4℃下，1500g离心45分钟弃去上清，留下病毒沉淀，然后用100μL PBS重悬得到病毒溶液，存储备用。

优选的是，所述步骤4)具体包括：

4-1)将无血清培养基加入EP管，并将步骤3)得到的病毒加入EP管中，将病毒加入无血清培养基中，混合好后将培养基吹打均匀；

4-2)步骤1)提供的脐带间充质干细胞在培养基中培养24h后，弃掉原始培养基转移到培养板中，将步骤4-1)得到的混合好的病毒液加入培养板中与脐带间充质干细胞混合，且使病毒液充分没过脐带间充质干细胞；

4-3)在病毒感染细胞6-8h后，补充完全培养基，培养得到修饰LMP-1基因的脐带间充质干细胞。

本发明还提供根如上所述的可示踪脐带间充质干细胞或如上所述的方法制得的可示踪脐带间充质干细胞在制备治疗椎间盘退行性病的药物中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明脐带间充质干细胞过表达LMP-1基因，能显著上调蛋白聚糖基因(Agg)、成骨蛋白基因7(BMP-7)，在这些基因的相互作用下，可以增加透明样基质的合成，维持椎间盘细胞的软骨样形态，再结合间充质干细胞可分化为成体细胞的优点，能持续补充椎间盘各个组织凋亡的细胞类型，从而能够著减缓或逆转椎间盘细胞的退化，可以为治疗椎间盘退行性疾病提供可靠的新方案。

附图说明

图1为本发明的pLVX-LMP-1-T2A-EGFP载体构建及酶切鉴定结果；

图2为本发明的慢病毒包装结果；

图3为本发明的LMP-1蛋白表达的鉴定结果；

图4为本发明的脐带间充质干细胞成骨基因qPCR检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1脐带间充质干细胞分离培养

1)取材：选择足月妊娠剖宫产孕妇，孕妇及新生胎儿身体健康，无妊娠合并症。在手术台上将脐带中的血液用生理盐水冲洗干净，随后剪成约两厘米的小段，完全浸泡于“PBS+双抗”保存液中，4℃保存运输。需要理解的是，产妇产后的脐带组织，通常情况下是作为医疗废物丢弃的，从脐带组织中分离提取干细胞不存在伦理道德争议，脐带还可以通过科研来源或其他来源获得。

2)脐带处理：

2-1)准备冰台，高压灭菌的手术器械等物品，本步骤全程冰上操作；

2-2)取出一段脐带，其余立即放回4℃保存液中；用PBS+双抗溶液冲洗脐带表面的消毒液及血液，至少三次；

2-3)在冰台上的PBS溶液中分离去除脐动脉、脐静脉以及脐带表面的外膜(分离时间尽可能短，PBS缓冲液尽可能多，勿使脐带组织干掉)；

2-4)调整仪器切割距离至约0.5cm，一次切割完成后将底盘旋转90度，再次切割；

2-5)将切好的组织块均匀的平铺在10cm培养皿中，加入约4ml培养基(DMEM+10％澳洲FBS，原代培养无需添加双抗)，具体的量以使组织块无法移动为宜，封口膜封住培养皿约3/4的周长，置于37℃培养箱中培养；

2-6)第二日酌情加入培养基2～3ml，封口膜封闭3/4周长后置于37℃培养箱中培养；

2-7)第七天时换液，吸去旧的培养基，加入8-10ml新鲜培养基，此后每三天换一次液。

3)消化传代：

3-1)细胞长至80％-90％融合率时，消化传代；

3-2)向含有组织块的培养皿中加入PBS缓冲液使多数组织块自然的飘起，吸除旧的培养基及漂浮的组织块，PBS溶液清洗两次；

3-3)加入2ml 0.25％Trypsin，37℃恒温箱消化1-2min，具体时间以看到细胞突触消失为宜；

3-4)吸去Trypsin，加2ml培养基终止消化并将细胞吹打均匀；

3-5)将细胞悬液转移到10ml离心管中，1000r/min，离心5min，吸去上清，留沉淀；

3-6)向沉淀中加入1ml培养基使沉淀重悬，在新的培养皿中加入8-10ml新鲜培养基，并将细胞悬液均匀滴入，轻轻晃匀，37℃培养箱中培养，获得用于感染的脐带间充质干细胞。

实施例2构建慢病毒表达载体pLVX-LMP-1-T2A-EGFP

本实施例中选用慢病毒载体作为LMP-1的过表达载体，通过酶切酶连的方法将目的基因LMP-1克隆到了pLVX载体上，同时为了能够方便之后对病毒的表达效率的判断，在载体上融合表达了EGFP报告基因，得到了慢病毒表达载体pLVX-LMP-1-T2A-EGFP；随后又通过EcoRI和BamHI限制性核酸内切酶对pLVX-LMP-1-T2A-EGFP进行双酶切验证，酶切结果正确后再进行后续处理。参照图1，为pLVX-LMP-1-T2A-EGFP载体构建及酶切鉴定结果。

本实施例中，基因LMP-1的序列如SEQ ID No.1所示。

实施例3慢病毒包装

1)在病毒包装前一天将293T细胞铺到10厘米的培养皿中培养，使细胞融合度在80％左右；

2)分别配置质粒转染体系A、B：

体系A包括2mL OPTI和50μL PEI，体系B包括2mL OPTI和混合质粒，所述混合质粒包括6.5μg PMDL、3.5μg REV、2.5μg VSVG以及10μg步骤2)得到的pLVX-LMP-1-T2A-EGFP；

3)体系A、体系B配置好后分别静置5分钟，然后把B体系逐滴加到A体系中，再吹吸数次，静置10分钟得到AB混合液；

4)弃去293T细胞上方培养基，然后将AB混合液沿着培养皿侧壁缓缓加入，培养；

5)8小时后弃去293T细胞上方AB混合液，然后沿着侧壁缓缓加入完全培养基，培养；

6)40个小时后收集病毒上清；

7)将收集的病毒上清放入离心机中，4℃下，1000g离心10分钟去沉淀，留下上清；

8)按照病毒上清：病毒浓缩液的体积比为3:1，向病毒上清中加入病毒浓缩液，然后混匀，4℃下孵育过夜；

9)将病毒上清与病毒浓缩液的混合液放入离心机中，4℃下，1500g离心45分钟弃去上清，留下病毒沉淀，然后用100μL PBS重悬得到病毒溶液，负80℃存储备用。

参照图2，上排为对照组病毒(pLVX-EGFP)包装照片，下排为实验组病毒包装照片(pLVX-LMP-1-T2A-EGFP)，对照组中未修饰LMP-1；可以看出，293T细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光，说明慢病毒所携带的外源基因(pLVX-EGFP和pLVX-LMP-1-T2A-EGFP)成功整合到293T细胞基因组，已经有慢病毒颗粒包装完成并且从细胞中释放。

实施例4用重组慢病毒感染脐带间充质干细胞

1)将无血清培养基以每孔200μL的体积加入EP管中，并将实施例3得到的病毒加入EP管中；病毒以感染复数(MOI)＝1的体积加入培养基中，MOI值的计算公式＝病毒滴度TU/mL×(病毒体积/细胞个数)，根据病毒滴度和细胞个数计算病毒体积，将病毒按计算得到的体积量加入无血清培养基中，混合好后将培养基轻轻吹打均匀；

2)实施例1提供的脐带间充质干细胞在培养基中培养24h后，弃掉原始培养基并转移到培养板中，将步骤4-1)得到的混合好的病毒液以每孔200μL的体积加入培养板中与脐带间充质干细胞混合，且使病毒液充分没过脐带间充质干细胞；

3)在病毒感染细胞6-8h后，培养板每孔补充300μL的完全培养基，培养得到修饰LMP-1基因的脐带间充质干细胞。

LMP-1是一种细胞内信号蛋白，他的过表达会促进一系列的成骨相关因子的表达，这些成骨因子的表达和其他相关基因的相互作用可以起到减缓椎间盘退变的作用。本实施例中进一步通过用LVX-LMP-1-T2A-EGFP慢病毒使脐带间充质干细胞过表达LMP-1基因，然后用Western Blot鉴定LMP-1基因的表达蛋白产物(如图3，证实了LMP-1蛋白的成功表达)，实时荧光定量PCR的方法测量相关基因的表达情况(如图4)，可以看出，在LVX-LMP-1-T2A-EGFP病毒作用下，脐带间充质干细胞的蛋白聚糖基因(Agg)、LMP-1和成骨蛋白7(BMP-7)基因的表达量有了显著的增高，在这些基因的相互作用下，将可能显著减缓或逆转椎间盘细胞的退化，从而能够说明过表达LMP-1的脐带间充质干细胞具有治疗椎间盘退行性病变的潜在价值。

由于椎间盘结构的特殊性，传统的药物治疗难以在椎间盘组织形成有效的药物浓度，手术治疗存在破坏原有组织结构的风险，两者都不能精准地、微创地对椎间盘退行性疾病进行根治。而本发明提供的方案能够克服以上问题，本发明结合基因工程上调相关基因的表达，再结合间充质干细胞可分化为成体细胞的优点，能持续补充椎间盘各个组织凋亡的细胞类型，修复已发生退化的椎间盘组织，从而可为治疗椎间盘退行性疾病提供可靠的方案。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

序列表

<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

<120> 可示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atggattcct tcaaagtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 60

ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg 120

caggccggag tggccgtggg tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 180

ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 240

ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac 300

cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg 360

gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcag cagaatggac agccgctccg accgctggtc 420

ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 480

acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa 540

gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 600

ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 660

cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgccccgga caaaacgagc 720

acagtgctga cccggcacag ccagccggcc acgcccacgc cgctgcagag ccgcacctcc 780

attgtgcagg cagctgccgg aggggtgcca ggagggggca gcaacaacgg caagactccc 840

gtgtgtcacc agtgccacaa ggtcatccgg ggccgctacc tggtggcgct gggccacgcg 900

taccacccgg aggagtttgt gtgtagccag tgtgggaagg tcctggaaga gggtggcttc 960

tttgaggaga agggcgccat cttctgccca ccatgctatg acgtgcgcta tgcacccagc 1020

tgtgccaagt gcaagaagaa gattacaggc gagatcatgc acgccctgaa gatgacctgg 1080

cacgtgcact gctttacctg tgctgcctgc aagacgccca tccggaacag ggccttctac 1140

atggaggagg gcgtgcccta ttgcgagcga gactatgaga agatgtttgg cacgaaatgc 1200

catggctgtg acttcaagat cgacgctggg gaccgcttcc tggaggccct gggcttcagc 1260

tggcatgaca cctgcttcgt ctgtgcgata tgtcagatca acctggaagg aaagaccttc 1320

tactccaaga aggacaggcc tctctgcaag agccatgcct tctctcatgt g 1371

Claims (10)

1.一种可示踪脐带间充质干细胞，其特征在于，所述可示踪脐带间充质干细胞过表达LMP-1蛋白。

2.一种如权利要求1所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提供脐带间充质干细胞；

2)将目的基因LMP-1连接到慢病毒载体pLVX上，构建得到慢病毒表达载体pLVX-LMP-1-T2A；

3)慢病毒包装，获得含有LMP-1基因的重组慢病毒；

4)用重组慢病毒感染脐带间充质干细胞，得到修饰有LMP-1基因的脐带间充质干细胞，即为过表达LMP-1蛋白的所述可示踪脐带间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述慢病毒载体pLVX上还连接有EGFP报告基因，从而构建得到慢病毒表达载体pLVX-LMP-1-T2A-EGFP，最终得到的可示踪脐带间充质干细胞中还修饰有EGFP报告基因。

4.根据权利要求3所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：

1-1)洗净脐带，在PBS溶液中分离去除脐动脉、脐静脉以及脐带表面的外膜，再切割成组织块，然后将组织块平铺在培养皿中，加入培养基；以上操作于冰台上进行；

1-2)将培养基置于37℃下培养；

1-3)细胞培养至80％-90％融合率时，消化传代；

1-4)向含有组织块的培养皿中加入PBS缓冲液使多数组织块自然飘起，吸除旧的培养基及漂浮的组织块，并用PBS溶液清洗；

1-5)加入0.25％的Trypsin，37℃恒温箱消化1-2min；

1-6)吸去Trypsin，加培养基终止消化并将细胞吹打均匀；

1-7)将细胞悬液转移到离心管中，离心，吸去上清，留沉淀；

1-8)向沉淀中加入培养基使沉淀重悬，在新的培养皿中加入新鲜培养基，并将细胞悬液均匀滴入，晃匀，37℃培养箱中培养，获得用于感染的脐带间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：

1-1)洗净脐带，在PBS溶液中分离去除脐动脉、脐静脉以及脐带表面的外膜，再切割成组织块，然后将组织块平铺在10cm的培养皿中，加入培养基；以上操作于冰台上进行；

1-2)将培养基置于37℃下培养；

1-3)细胞长至80％-90％融合率时，消化传代；

1-4)向含有组织块的培养皿中加入PBS缓冲液使多数组织块自然的飘起，吸除旧的培养基及漂浮的组织块，并用PBS溶液清洗两次；

1-5)加入2ml 0.25％的Trypsin,37℃恒温箱消化1-2min；

1-6)吸去Trypsin，加2ml培养基终止消化并将细胞吹打均匀；

1-7)将细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min下离心5min，吸去上清，留沉淀；

1-8)向沉淀中加入1ml培养基使沉淀重悬，在新的培养皿中加入8-10ml新鲜培养基，并将细胞悬液均匀滴入，晃匀，37℃培养箱中培养，获得用于感染的脐带间充质干细胞。

6.根据权利要求4或5所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，得到慢病毒表达载体pLVX-LMP-1-T2A-EGFP后，通过EcoRI和BamHI对pLVX-LMP-1-T2A-EGFP进行双酶切验证，酶切结果正确后再进行后续处理。

7.根据权利要求6所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括：

1)将293T细胞铺到培养皿中培养；

2)分别配置质粒转染体系A、体系B：

体系A包括OPTI和PEI，体系B包括OPTI和混合质粒，所述混合质粒包括PMDL、REV、VSVG以及步骤2)得到的pLVX-LMP-1-T2A-EGFP；

3)体系A、体系B配置好后分别静置，然后把B体系逐滴加到A体系中，吹吸数次，静置得到AB混合液；

4)弃去293T细胞上方培养基，然后将AB混合液沿着培养皿侧壁加入，培养；

5)弃去293T细胞上方AB混合液，然后沿着侧壁加入完全培养基，培养；

6)收集病毒上清；

7)将收集的病毒上清放入离心机中，离心去沉淀，留下上清；

8)按照病毒上清：病毒浓缩液的体积比为3:1，向病毒上清中加入病毒浓缩液，然后混匀，孵育过夜；

9)将病毒上清与病毒浓缩液的混合液放入离心机中，离心弃去上清，留下病毒沉淀，然后用PBS重悬得到病毒溶液，存储备用。

8.根据权利要求7所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括：

1)将293T细胞铺到10厘米的培养皿中培养，使细胞融合度在75-85％；

2)分别配置质粒转染体系A、B：

体系A包括2mL OPTI和50μL PEI，体系B包括2mL OPTI和混合质粒，所述混合质粒包括6.5μg PMDL、3.5μg REV、2.5μg VSVG以及10μg步骤2)得到的pLVX-LMP-1-T2A-EGFP；

3)体系A、体系B配置好后分别静置5分钟，然后把B体系逐滴加到A体系中，吹吸数次，静置10分钟得到AB混合液；

4)弃去293T细胞上方培养基，然后将AB混合液沿着培养皿侧壁加入，培养；

5)8小时后弃去293T细胞上方AB混合液，然后沿着侧壁加入完全培养基，培养；

6)40个小时后收集病毒上清；

7)将收集的病毒上清放入离心机中，4℃下，1000g离心10分钟去沉淀，留下上清；

8)按照病毒上清：病毒浓缩液的体积比为3:1，向病毒上清中加入病毒浓缩液，然后混匀，4℃下孵育过夜；

9)将病毒上清与病毒浓缩液的混合液放入离心机中，4℃下，1500g离心45分钟弃去上清，留下病毒沉淀，然后用100μL PBS重悬得到病毒溶液，存储备用。

9.根据权利要求7或8所述的可示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤4)具体包括：

4-1)将无血清培养基加入EP管，并将步骤3)得到的病毒加入EP管中，将病毒加入无血清培养基中，混合好后将培养基吹打均匀；

4-2)步骤1)提供的脐带间充质干细胞在培养基中培养24h后，弃掉原始培养基转移到培养板中，将步骤4-1)得到的混合好的病毒液加入培养板中与脐带间充质干细胞混合，且使病毒液充分没过脐带间充质干细胞；

4-3)在病毒感染细胞6-8h后，补充完全培养基，培养得到修饰LMP-1基因的脐带间充质干细胞。

10.根据权利要求1所述的可示踪脐带间充质干细胞或权利要求2-9中任意一项所述的方法制得的可示踪脐带间充质干细胞在制备治疗椎间盘退行性病的药物中的应用。

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