CN113398249A - 过表达趋化因子ccl14在制备免疫系统参与下治疗肿瘤的药物中的应用 - Google Patents
过表达趋化因子ccl14在制备免疫系统参与下治疗肿瘤的药物中的应用 Download PDFInfo
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本发明属于肿瘤药物研究领域，具体公开一种过表达趋化因子CCL14在制备免疫系统参与下治疗肿瘤的药物中的应用。在免疫系统的协助下，在肿瘤中和肝脏微环境中过表达趋化因子CCL14可以显著抑制肝癌的进展；且本发明通过腺相关病毒AAV8的方法，首次将CCL14转入HCC的治疗过程中，在免疫力正常的小鼠模型中显著地抑制肝癌的进展。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤药物研究领域，具体公开一种过表达趋化因子CCL14在制备免疫系统参与下治疗肿瘤的药物中的应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一，在临床上，有80％-90％的原发性肝癌病例被诊断为肝细胞癌，我国每年约有11万人因肝癌死亡。长期过量饮酒、肝病毒的感染和不健康的饮食习惯是肝癌的主要诱因。肝癌的预防以及治疗一直是世界性的难题，传统手术治疗和化疗对晚期肝癌的疗效有限，很多化疗药物对患者的毒性过强，使得针对肝癌的治疗难以令人满意，目前仍旧没有广谱性良好且临床副作用小的药物投入临床使用，因此探寻新的肝癌治疗途径是很有必要的。
相较于传统治疗方法，肿瘤的免疫治疗是近年来兴起的针对肿瘤的有效治疗手段，比如通过靶向免疫检查点PD-1(programmed cell death protein-1，程序性细胞死亡蛋白-1)作为治疗策略对肿瘤进行治疗，取得了显著的进展。但是由于肝脏微环境具有特殊性——肝脏微环境是免疫抑制微环境——所以常规的免疫检查点治疗对于肝癌疗效有限。
趋化因子是可以引起肿瘤微环境改变的一类重要细胞因子，同时也是细胞因子中最庞大的亚族，因为其具备的定向趋化细胞的能力，所以成为了调节肿瘤微环境的关键因子。肿瘤微环境是肿瘤细胞和宿主免疫系统相互作用的主要场所，多种免疫细胞通过趋化因子和趋化因子受体之间的相互作用迁移到肿瘤微环境中，这些免疫细胞和趋化因子在肿瘤微环境中发挥的作用对肿瘤的发生发展和治疗结果有重要的影响。针对趋化因子展开的肿瘤免疫治疗已经取得较大进展，具有光明的发展前景。
CCL14的全称是趋化因子(C-C)基序配体14(C-C motif chemokine ligand 14)，是一种CC家族的趋化因子配体，在多种肿瘤数据库中它的高表达与肿瘤患者预后良好有关，这提示了CCL14可能具有抑癌功能。虽然CCL14被认为具有抑癌功能，但关于CCL14在免疫系统参与下发挥抑癌作用的研究尚未见报道。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了过表达趋化因子CCL14在制备免疫系统参与下治疗肿瘤的药物中的应用。
优选地，在免疫系统参与下，过表达趋化因子CCL14能够抑制肿瘤细胞生长。
优选地，所述肿瘤细胞是B16F10、Hepa1-6或BGC-803细胞。
本发明提供一种用于在免疫环境下治疗肿瘤的药物制剂，其包括上述过表达趋化因子CCL14，并辅以药学上可接受的辅料或载体。
本发明还提供了过表达CCL14的腺相关病毒AAV8在制备免疫系统参与下治疗肝原位癌的药物中的应用。
优选地，所述过表达CCL14的腺相关病毒AAV8能够抑制Hepa1-6细胞肝原位荷瘤的生长。
本发明还提供一种用于在免疫环境下治疗肝原位癌的药物制剂，其包括上述过表达CCL14的腺相关病毒AAV8，并辅以药学上可接受的辅料或载体。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明实验证实，在免疫系统的协助下，在肿瘤中和肝脏微环境中过表达趋化因子CCL14可以显著抑制肝癌的发展。
2、本发明通过腺相关病毒AAV8的方法，首次将CCL14转入HCC的治疗过程中，在免疫力正常的小鼠模型中显著的抑制了肝癌的发展。
附图说明
图1是实时定量PCR结果证实CCL14在多种肿瘤细胞系中成功过表达；A.鼠源B16细胞系；B.人源BGC-803胃癌细胞系；C.鼠源Hepa1-6胃癌细胞系；**P＜0.01；
图2是CCL14在体外对肿瘤细胞系增殖的影响；A、B16细胞系；B、BGC-803细胞系；C、Hepa1-6细胞系；
图3是C57BL/6小鼠皮下荷瘤B16 Control和B16 CCL14OE的生长结果；
图4是C57BL/6小鼠皮下荷瘤B16 Control和B16 CCL14OE肿瘤重量统计学分析(P<0.05)；
图5是C57BL/6小鼠皮下荷瘤B16 Control和B16 CCL14OE的HE染色结果；
图6是裸鼠皮下荷瘤BGC-803 Control和BGC-803 CCL14OE的生长结果；
图7是裸鼠皮下荷瘤BGC-803 Control和BGC-803 CCL14OE肿瘤重量统计学分析(P>0.05)；
图8是裸鼠皮下荷瘤BGC-803 Control和BGC-803 CCL14OE的HE染色结果；
图9是裸鼠皮下荷瘤B16 Control和B16 CCL14OE的生长结果；
图10是裸鼠皮下荷瘤B16 Control和B16 CCL14OE肿瘤重量统计学分析(P>0.05)；
图11是裸鼠皮下荷瘤B16 Control和B16 CCL14OE的HE染色结果；
图12是C57BL/6小鼠肝原位荷瘤Hepa1-6 Control和Hepa1-6 CCL14OE后第20天和第27天的动物活体成像数据；
图13是C57BL/6小鼠肝原位荷瘤Hepa1-6 CCL14-Control和Hepa1-6 CCL14OE后小鼠肝脏的最终形态；
图14是C57BL/6小鼠肝原位荷瘤Hepa1-6后尾静脉注射AAV8-Control/AAV8-CCL14OE干预的动物活体成像数据，此处仅展示注射腺相关病毒AAV8后前一天(荷瘤后第七天)和实验接近终点的荷瘤后第三十天的图像；
图15是C57BL/6小鼠肝原位荷瘤Hepa1-6后尾静脉注射AAV8-Control/AAV8-CCL14OE干预后小鼠肝脏的最终形态。
具体实施方式
下面通过实施例进一步描述本发明，但是本发明不受这些实施例的限制。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明提供了过表达趋化因子CCL14在制备免疫系统参与下治疗肿瘤的药物中的应用，该过表达趋化因子CCL14在免疫系统参与下能够抑制肿瘤细胞的生长，肿瘤细胞是B16、Hepa1-6或BGC-803细胞。
上述过表达趋化因子CCL14可以用于制备在免疫环境下治疗肿瘤的药物制剂，该药物制剂中辅以药学上可接受的辅料或载体。
本发明还提供了过表达CCL14的腺相关病毒AAV8在制备免疫系统参与下治疗肝原位癌的药物中的应用，该过表达趋化因子CCL14的腺相关病毒AAV8能够抑制Hepa1-6细胞肝原位荷瘤的生长。
该过表达趋化因子CCL14的腺相关病毒AAV8能够进一步制备成在免疫环境下治疗肝原位癌的药物制剂，该药物制剂中可以加入药学上可接受的辅料或载体。
1通过慢病毒系统构建多种过表达CCL14的肿瘤细胞系
1.1细胞培养
本发明所需的细胞系有HEK293T人胚肾细胞系、C57BL/6小鼠黑色素瘤B16F10细胞系、C57BL/6小鼠肝癌Hepa1-6细胞系以及人源性胃癌BGC-803细胞系。
HEK293T细胞、B16F10细胞和Hepa1-6细胞使用含有100mL/L胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)的DMEM培养基培养；BGC-803细胞使用含有100mL/LFBS的RPMI1640培养液培养。
所有细胞均置于37℃、5％二氧化碳的条件下培养。视细胞密度，每间隔1-2天使用25g/L的猪胰蛋白酶消化后传代。
1.2慢病毒包装与感染
通过NCBI中人源性CCL14基因的编码序列(coding sequence，CDS)区段设计引物并合成CCL14的过表达质粒pCDH-CCL14。
以cDNA为模板，通过常规的PCR和DNA重组得到CCL14的过表达质粒pCDH-CCL14。
得到目的质粒后，着手进行慢病毒的包装：首先将HEK293T细胞接种在6cm皿内，待细胞汇合率达到50％左右，撤去培养液，加入3mL无血清的DMEM培养液，之后分别将4μg目的质粒pCDH-CCL14以及对照组质粒pCDH，加上3μg的辅助质粒psPAX2、1μg的辅助质粒pMD2.G与250μL无血清的DMEM混合。同时，将8μL脂质体LipofectamineTM2000与250μL无血清的DMEM混合，静置5min；随后将质粒和脂质体混匀，再静置20min，缓缓加入HEK293T细胞中转染。6h后，将转染体系撤掉，加入含有100mL/LFBS的DMEM培养基的DMEM培养液。在转染后48h收集所有上清，将上清液置于4℃保存，重新加入含100mL/LFBS的DMEM培养液。再经过24h，再次收集上清，与48h收集的上清混匀，经0.45μm滤器过滤后得到病毒液，病毒液可置于-80℃保存。
感染流程的介绍使用B16F10(简称B16)细胞系为例(Hepa1-6细胞系以及BGC-803细胞系的感染流程与此流程相同)，感染B16细胞系时，将病毒液与含有100mL/L FBS的DMEM培养液1：1混合。同时加入1/1000的polybrene混匀，24h后换含有100mL/L FBS的DMEM培养液，完成感染。在感染后，使用含4mg/L的嘌呤霉素培养液筛选感染后的B16细胞系与没有进行感染的B16对照组细胞系，72h后，待99％的没有感染慢病毒的空白对照组细胞死亡后，得到可以稳定感染并表达目的质粒的细胞系B16-pCDH和B16-CCL14OE。
1.3通过实时定量PCR实验验证CCL14在多种肿瘤细胞系中的过表达
将上述得到的稳定感染并表达目的质粒的细胞系B16-pCDH和B16-CCL14OE分别使用TRIzol试剂吹匀，转移到无RNA酶的1.5mL离心管中，一般6cm皿的细胞加入1mL的TRIzol试剂。其中，贴壁培养的细胞直接吹下并转移。接着，每个样本加入200μL三氯甲烷，剧烈摇匀，在低温离心机中，4℃，12000r/min离心15min，将上清转移到新的无RNA酶的1.5mL离心管中，每个样本大约400～500μL。之后加入500μL异丙醇，颠倒混匀，在低温离心机中，4℃，12000r/min离心10min，吸弃上清，再加入1mL750mL/L酒精，轻轻摇晃，在低温离心机中，4℃，12000r/min离心5min，吸弃酒精，在超净工作台内待酒精充分挥发后，加入无RNA酶的双蒸水，并在55℃的水浴锅中放置5min，使RNA充分溶解。在分光光度计下定量，每个样本取500ng或1μg进行反转录和实时定量PCR。反转录和实时定量PCR的过程参考TaKaRa公司试剂说明书。
1.4 CCK8法检测肿瘤细胞系的增殖能力
再次使用B16细胞系举例：首先将B16-pCDH和B16-CCL14OE细胞铺在96孔板中，每细胞三个孔，每个孔内1000个细胞，肿瘤细胞周围的孔内每个空加入200μL的无菌水防止培养液较快蒸发。一共准备5个96孔板。在之后的五天内，选择同一时刻，每天取一个96孔板，弃去上清，每个孔加入100μL的完全培养基和10μL的CCK8试剂。之后96孔板置于细胞培养箱中继续培养。其中在一个没有细胞的孔内也加入试剂，用作空白对照。分别在加入CCK8试剂后的1小时、2小时和4小时将96孔板取出，在酶标仪下检测450nm下的吸光度。每个孔的最终数值为读出的数值减去空白对照孔的吸光度值。统计五天的结果，作图，并使用Prism8进行分析。
2构建小鼠皮下荷瘤模型
2.1实验动物
6-8周龄的C57BL/6小鼠购自中国人民解放军空军军医大学实验动物中心、6-8周龄的BALB/c背景的裸鼠购自北京科奥生物公司。以上小鼠购入后，按体重对其进行平均分笼，每笼一般不超过6只，转入本实验室的小鼠培养房内。每周1-2次更换食物、水以及垫料。
2.2细胞处理
将汇合率达到80％～90％的肿瘤细胞使用胰蛋白酶消化到离心管中，离心弃去上清，离心管置于冰上。使用无菌PBS洗涤两次。吸取部分细胞悬液与血球计数板上，光学显微镜下计数，根据算出的浓度，使用PBS调整细胞悬液浓度为1×107个/mL。
2.3小鼠皮下荷瘤
使用1mL的一次性注射器，在C57BL/6小鼠背部-臀部之间的表皮下注射200μL混匀的B16 Control与B16 CCL14OE细胞悬液，每只小鼠皮下注射2×106个肿瘤细胞。每组4～6只小鼠。视肿瘤生长的速度以及观察到的肿瘤大小，在荷瘤后12天～20天，处死小鼠，取得皮下肿瘤，经过PBS简单清洗后，在滤纸上清除大部分水分，称重并拍照，并对肿瘤重量进行统计学分析，肿瘤样本置于4％多聚甲醛之中长期保存。此外，将多聚甲醛中的样本送至西安谷歌生物公司进行切片和HE染色，得到扫描结果。
在裸鼠体内进行BGC-803 Control/BGC-803 CCL14OE皮下和B16 Control/B16CCL14OE的过程与C57BL/6小鼠荷瘤结果相似，在此不再赘述。
3小鼠肝原位荷瘤
3.1细胞处理
将汇合率达到80％～90％的Hepa1-6 Control/Hepa1-6 CCL14OE细胞使用胰蛋白酶消化到离心管中，离心弃去上清，离心管置于冰上。使用无菌预冷的PBS洗涤离心两次，尽量吸弃上清。吸取少量细胞沉淀，PBS稀释并使用血球计数板计数，根据浓度对肿瘤细胞悬液进行微调，使Hepa1-6 Control/Hepa1-6 CCL14OE细胞浓度完全相等。因为本实验中，上清已经基本弃去，所谓的肿瘤细胞悬液基本上只有Hepa1-6细胞沉淀和少量的PBS，因此浓度调整较为困难。最终浓度在1×108～2×108个/mL均可，但务必使Hepa1-6 Control与Hepa1-6 CCL14OE细胞的浓度都保持一致。在调整好的细胞悬液中，以体积比1：1的比例加入在冰上融化的基质胶，将基质胶与细胞混合。
3.2小鼠肝原位荷瘤模型的建立
使用PBS配制0.05g/mL的水合氯醛，使用孔径0.22μm滤器过滤除去杂质和杂菌。根据体重，以10μL/g体重的剂量，给C57BL/6小鼠注射0.05g/mL水合氯醛，注射后10分钟左右小鼠成功麻醉。在动物房的超净工作台内，使用手术器械打开小鼠腹腔，开口大约1.5cm，轻轻挤压小鼠腹部，将部分肝脏挤出腹腔。使用微量注射器注射20μL的Hepa1-6细胞与基质胶的混合液在小鼠的肝脏叶片下，缓慢注射，注射完毕后保持1分钟，再拔出针头，防止过多的肿瘤细胞流出肝脏。使用手术镊将肝脏放回腹腔内，用手术缝合针线将小鼠的腹膜和表皮缝合起来，一般来说每只小鼠腹膜缝2针，表皮缝2针。此外，整个手术过程需要注意无菌操作。荷瘤后每隔七天左右，在小动物成像仪中通过底物成像，观察Hepa1-6在小鼠体内发出的荧光。通过荧光强度判断肿瘤的生长情况。经过4～5次底物成像，大约5～6周时处死小鼠，打开腹腔，取出整个肝脏，观察肿瘤的生长结果。对肝脏进行清洗、擦干、摆放、观察并拍照留影。将肝脏和肿瘤一起保存在4％多聚甲醛中。
4使用腺相关病毒AAV8对肝原位荷瘤的C57BL/6小鼠进行CCL14过表达干预
4.1建立小鼠肝原位荷瘤模型
使用上述操作建立的C57BL/6小鼠肝原位荷瘤模型。手术之后第7天，通过动物成像仪底物活体成像的方式，观察小鼠肝原位肿瘤的生长情况。根据小鼠肿瘤的荧光值和荧光范围的大小综合分析评估，将成功荷瘤的小鼠分成两组，每组4只。
4.2构建过表达CCL14的腺相关病毒AAV8并调整浓度
将空军军医大学陈宏莉教授实验组提供的AAV8载体与上述得到的CCL14的片段，通过酶切，连接，转化的方式将CCL14基因亚克隆进入AAV8载体上。之后将AAV8-CCL14质粒和对照组质粒AAV8-con，以及需用酚氯仿提取的辅助质粒转入HEK293T细胞，转染流程和上述慢病毒转染方法相同。转染后24小时时，将无血清的DMEM培养液换为含100mL/LFBS的DMEM培养液。再经过48小时，在培养液中吹下细胞并离心，分别收获培养基上清与细胞沉淀。用PEG8000沉淀培养基上清中的病毒，沉淀过夜后收集病毒沉淀。将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化，并使用超滤管进行浓缩。之后进行病毒滴度检验，将5μL病毒液+1μL蛋白酶k+4μL无菌水体系在37℃孵育30分钟，破坏病毒的蛋白质外壳，再在95℃加热5分钟使蛋白酶失活。离心12000rpm，2分钟，取上清。标准品的拷贝数，7个梯度稀释浓度分别：7.2E+8V.G./μL，7.2E+7V.G./μL，7.2E+6V.G./μL，7.2E+5V.G./μL，7.2E+4V.G./μL，7.2E+3V.G./μL，7.2E+2V.G./μL，并将无菌水作为阴性对照。通过实时定量PCR，将标准品浓度和标准品的Cq值制成浓度函数，并将样品的Cq值带入函数，得到样品的浓度。最终通过PBS将目的腺相关病毒的核酸拷贝数浓度调整为1×1012v.g./mL。
4.3通过尾静脉注射的方法将腺相关病毒转入荷瘤小鼠肝脏
将过表达CCL14的腺相关病毒AAV8-CCL14和对照病毒AAV8-con通过尾静脉注射的方式分别注射到两组小鼠体内。得到的腺相关病毒AAV8的核酸拷贝数浓度为1×1012v.g./mL，作为参考，每只小鼠取100μL病毒液，与100μL无菌预冷的PBS混匀后通过尾静脉注射。其中，腺相关病毒AAV8-CCL14由空军军医大学陈宏莉教授实验组提供。通过活体成像来追踪观察注射腺相关病毒的小鼠原位肝癌的发展情况。每隔7天成像一次。术后5周，终止实验，处死小鼠，取出肝脏，并进行清洗和拍照工作。将肝脏和肿瘤一起保存在4％多聚甲醛中。
5统计学分析
本发明中所有可统计的数据均使用Graphpad Prism8软件进行统计学分析，组间差异采用非配对t检验法进行分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
6结果
6.1通过慢病毒系统构建多种过表达CCL14的肿瘤细胞系
如图1所示，qRTPCR结果显示本发明实验通过慢病毒系统构建了多种稳定过表达CCL14的肿瘤细胞系。
如图2所示，本发明使用CCK8试验在体外证明CCL14的过表达对肿瘤细胞的增殖无明显影响。
6.2对免疫力正常小鼠皮下荷瘤及肝原位荷瘤的影响
如图3-4所示，在小鼠皮下荷瘤模型中证实CCL14在免疫力正常的C57BL/6体内发挥了抑癌作用，肿瘤重量差异显著(P<0.05)。
如图5所示，过表达CCL14的B16细胞系在皮下荷瘤的HE染色结果中核质比小于对照组，这是过表达CCL14的B16细胞系在该模型中增殖不如对照组活跃的表现。
6.3免疫力缺陷裸鼠体内皮下荷瘤实验
如图6-7及图9-10所示，在免疫力缺陷小鼠中，CCL14的过表达无法显著抑制肿瘤生长，肿瘤重量差异不显著(P>0.05)。
如图8及图11所示，在免疫力缺陷小鼠中，CCL14的过表达对肿瘤细胞核质比无明显影响。
结合图6-11说明CCL14抑癌功能的发挥离不开完整的免疫系统的参与。
6.4 CCL14在原位肝癌模型中发挥抑癌作用
如图12-13所示，过表达CCL14后，原位肝癌的肿瘤发展受到抑制，说明在原位肝癌模型中，肿瘤细胞过表达CCL14可以发挥抑癌作用。
6.5使用腺相关病毒AAV8对肝原位荷瘤的C57BL/6小鼠进行CCL14过表达干预
如图14-15所示，通过尾静脉注射过表达CCL14的腺相关病毒AAV8-CCL14在原位肝癌小鼠模型肝脏中过表达CCL14后，与尾静脉注射了对照组病毒AAV8-Control的小鼠相比，注射了过表达CCL14的腺相关病毒AAV8-CCL14的小鼠原位肝癌的生长明显减慢，病情显著减轻。说明通过腺相关病毒AAV8将CCL14在肝脏中过表达可以对原位肝癌产生治疗效果。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (7)
1.过表达趋化因子CCL14在制备免疫系统参与下治疗肿瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在免疫系统参与下，过表达趋化因子CCL14能够抑制肿瘤细胞生长。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞是B16F10、Hepa1-6或BGC-803细胞。
4.一种用于在免疫环境下治疗肿瘤的药物制剂，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的过表达趋化因子CCL14，并辅以药学上可接受的辅料或载体。
5.过表达CCL14的腺相关病毒AAV8在制备免疫系统参与下治疗肝原位癌的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述过表达CCL14的腺相关病毒AAV8能够抑制Hepa1-6细胞肝原位荷瘤的生长。
7.一种用于在免疫环境下治疗肝原位癌的药物制剂，其特征在于，其包括权利要求5所述的过表达CCL14的腺相关病毒AAV8，并辅以药学上可接受的辅料或载体。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210917 |