CN111172165B

CN111172165B - siRNA和透膜肽联合治疗肝癌的用途

Info

Publication number: CN111172165B
Application number: CN202010287402.XA
Authority: CN
Inventors: 王阳; 曹帅
Original assignee: Guoke Rongan Biotechnology Beijing Co ltd
Current assignee: GUOKE RONGAN BIOTECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd.
Priority date: 2020-04-13
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-04-13
Also published as: CN111172165A

Abstract

本发明涉及siRNA和透膜肽联合治疗肝癌的用途。其中siRNA具有极高的抑制效率。透膜肽与siRNA一起能够显著提高转染效率，二者联合使用能够使得癌症抑制效果得到大大增强，具有较好的应用前景。

Description

siRNA和透膜肽联合治疗肝癌的用途

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的涉及癌症相关领域，更具体的涉及siRNA和透膜肽联合治疗肝癌的用途。

背景技术

肝细胞肝癌（HCC）是肝癌中最常见的病理类型。在世界范围内，肝癌患者死亡率在所有癌症总死亡率中排第２位。特别是在东亚、东南亚、非洲及欧洲南部，肝癌的发病率、死亡率仍呈上升趋势。中国每年肝癌发病和死亡患者约占全球的一半。传统手术治疗对于部分HCC患者的病情改善有明显效，但相当数量的患者对治疗不耐受，远期复发进展。因此，作为未来精准治疗的关键，HCC相关调控因子成为目前研究的重点。

lncRNA 是一类长度超过200ｎt的内源性RNA，在表观遗传水平、转录过程中发挥了重要的调控作用。根据与邻近编码RNA的位置关系， lncRNA可分为５类：正义lncRNA、反义lncRNA、双向 lncRNA、内含子源性lncRNA、基因间lncRNA。lncRNA空间和组织形式上的多样性使其有多种功能。在细胞核内，lncRNA 可以参与染色质的相互作用、转录调控与RNA加工过程；在细胞质内， lncRNA在转录产物的修饰、翻译过程的调节与信号通路的调控中扮演重要角色。由于lncRNA长度大于200nt，可以折叠为复杂的高级结构，其作用模式在多种情况下脱离了作为核苷酸序列的一级结构基础（与同源RNA 序列直接结合），而偏向了二级或更高级结构。目前，已有多篇文献报道，HCC相关的lncRNA以多种形式参与HCC进展调控。

HCC的发生与发展的病理生理过程十分复杂，受机体多种因素调节。基于现有的数据显示，多种lncRNA的异常表达在其中扮演十分重要的角色，研究较多的lncRNA包括ＭＡＬＡＴ１、ＵＣＡ１、ＨＯＳＴ２、ＨＯＴＴＩＰ等。近来的一些较新的研究，也筛选了一些新的指标，并对相关的调控功能进行探讨。如 Yang等完成的一项最新重要研究中，筛查了来自20名HCC患者的60份临床样本，匹配阵列分析显示，有235种lncRNA的表达异常与拷贝数变异及DNA甲基化有关，而这些表达异常的lncRNA主要调控靶点集中于与细胞粘附、免疫应答及细胞代谢相关的基因。

陈思思等采用荧光定量PCR检测检测96例肝癌癌灶组织及癌旁组织中 lncRNACCAT1 的表达情况，并分析与各临床病理因素以及患者预后的相关性。结果lncRNA CCAT1在肝癌癌灶组织表达升高;肝癌癌灶组织中lncRNA CCAT1 表达量和门静脉癌栓、 TNM 分期等因素相关。进一步生存分析发现 lnc RNA CCAT1 表达阳性者术后平均生存时间(32.1 个月， 95% CI:26.3 ～ 38.0 个月) 明显短于阴性患者( 47.2 个月， 95% CI:42.5 ～52.0 个月) ，差异有统计学意义(χ2 =7.607， P =0.006) 。并且lncRNA CCAT1 表达是肝癌患者总体生存的独立危险因素。结论 lncRNA CCAT1 表达在肝癌发生、发展中发挥重要作用; lncRNA CCAT1 表达是肝癌患者的独立预后因素。

许绍林运用 RT-PCR 技术检测 45 例原发性肝细胞癌新鲜组织中 PCAT-14 的表达水平；运用原位杂交技术检测 130 例原发性肝细胞癌患者组织切片中PCAT-14 的表达水平，并运用卡方检验、COX 回归模型、Kaplan-Meier 生存曲线分析PCAT-14表达水平与原发性肝细胞癌患者临床病理因素及长期预后的关系，结果发现45 对原发性肝细胞癌新鲜组织标本中 35 对癌组织表达水平较高，且癌组织中平均表达水平明显高于癌旁组织；130例原发性肝细胞癌患者切片中98 例高表达，结果显示 PCAT-14 的表达水平与肝癌 TMN分期、肿瘤大小以及转移呈正相关性，肝癌组织切片 PCAT-14 较高表达的患者预后相对较差，总体生存率明显低于 PCAT-14 较低表达的患者。

CN107213471A中研究发现了长链非编码lncRNA-MUF在肝癌细胞中的上调表达非常显著。通过干涉肝癌细胞中lncRNA-MUF的表达后，发现干涉lncRNA-MUF的表达能够显著抑制体外肝癌干细胞球的形成和体内肝癌肿瘤的形成。但是该效果还有改进的空间。

发明内容

本发明提供一种能够抑制lncRNA-MUF的siRNA，其序列如TGGATTCCACACCCTTCTA所示（SEQ ID NO:1）。

研究发现，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列沉默lncRNA-MUF的效率比CN107213471A中提供的沉默效率最高的GCCCTCGAGAAGTGTCTAA (SEQ ID NO: 2)效率还要高。

此外，本发明还提供一种增强siRNA干扰效率的方法，其中包括在所述siRNA的5’端还添加透膜肽序列以及增强子序列，该序列不仅能够增强siRNA的表达效率，同时还能够提高所述siRNA序列的透过细胞膜的效率进而提高抑制效率。

所述透膜肽的氨基酸序列的长度总计为5-50个氨基酸，优选总计为10-45个氨基酸，更优选总计为15-45个氨基酸；其中，任选地，1，2，3，4或5个氨基酸被取代，缺失和/或添加而不丧失所述肽的细胞穿透能力，或这种片段的变体包括或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO: 3，或其序列变体而不丧失所述肽的细胞穿透能力，优选具有0，1，2，3，4或5个氨基酸取代，缺失和/或添加而不丧失所述肽的细胞穿透能力的序列变体。

更具体的，所述透膜肽的序列为TRF-1：RRWKACRRWVADRKSRARRWPLPQHYRERRW（SEQID NO: 3），其中所述透膜肽采用C端巯基乙胺化和N端乙酰化修饰。本发明的透膜肽是发明人通过研究发现的，该透膜肽富含R和W氨基酸，可自发地与带电情况不同的细胞膜单层磷脂结合，透膜肽与siRNA复合物不需要特定的膜电位，即可与细胞膜上的磷脂直接相互作用，改变细胞膜的稳定性，当复合物进入细胞后细胞膜则迅速封闭，并不改变膜的完整性和生物活性。

本发明提供的透膜肽能够大幅度的提高siRNA的转染效率，作为载体工具，在基因治疗中具有较大的应用价值。

本发明进一步的提供siRNA转染的方法，将TRF-1透膜肽与siRNA按照质量比22:1（μg：μg）用培养基混合均匀静止20min后加入到细胞培养板中，4h后吸去转染培养基，用PBS洗二遍，每孔加入500ul完全培养基后置于5% CO2、37℃的细胞培养箱培养后即得到转染后的细胞。

本发明另外提供一种组合物，其含有siRNA和TRF-1透膜肽。

更具体的，所述组合物中还包括药物辅料。药物辅料为现有技术，比如缓冲液、生理盐水等。

本发明还提供一种药物组合物用于制备治疗肝癌的药物中的用途，其中所述组合物含有SEQ ID NO：1所示的siRNA和SEQ ID NO:3所示的透膜肽。

在某些实施例中，所述核酸可被制成单位剂量的可注射形式，例如溶液、悬液或乳液。适于注射的药物制剂通常为无菌水性溶液和分散体系。用于可注射制剂的载体可为溶剂或分散介质，含例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的合适混合物。本领域技术人员可容易地确定将在本发明方法中给予的组合物中的细胞和可选添加剂、媒介(vehicle)和/或载体的量。通常，任何添加剂(除所述细胞以外)都以0.001wt％-50wt％的量存在于溶液例如磷酸缓冲盐水中。所述活性组分以微克至毫克量级存在，例如约0.0001wt％到约5wt％，优选约0.0001wt％到约1wt％，最优选约0.0001wt％到约0.05wt％，或者约0.001wt％到约20wt％，优选约0.01wt％到约10wt％，最优选0.05wt％到约5wt％。

在各种实施例中，核酸可以一个初始剂量给药，然后通过再次给药保持。核酸可在开始通过一种方法给药，然后通过相同方法或者一种或多种不同方法给药。水平可通过继续给予所述核酸而保持。各种实施例通过静脉注射在开始时给予所述核酸和/或保持它们在受试者中的水平。在多种实施例中，可根据患者的病情和本文其他地方讨论的其他因素使用其他给药形式。应注意，人类受试者接受治疗的时间通常长于实验动物，然而，治疗的长度通常与疾病过程和治疗效果的长度成比例。本领域技术人员会考虑使用在人和/或动物(诸如大鼠、小鼠、非人灵长类等)中实行的其他方法的结果，以确定用于人的合适剂量。基于这些考虑并根据本公开内容和现有技术所提供的指导的，这种确定可使技术人员不需过度实验而确定剂量。初始给药和再次给药或连续给药的合适方案可以都相同或者可以是变化的。合适方案可由技术人员根据本公开内容、本文引用的文献以及本领域的知识，不需过度实验而得出。治疗的剂量、频率和持续时间取决于许多因素，包括疾病的性质、受试者以及可能给予的其他疗法。因此，多种方案可用于给予所述核酸的受体细胞/培养基。在某些实施例中，将所述核酸以一个剂量给予受试者。在其他一些实施例中，将所述核酸以一系列的两个剂量或多个剂量连续给予受试者。在其中以一个剂量、两个剂量和/或多于两个的剂量给予细胞的其他一些实施例中，剂量可相同或不同，并且给药之间的间隔可相同或不同。核酸可在各种不同时间内以多种频率给药。在某些实施例中，核酸在小于1天的时间内给药。在其他实施例中，它们在2、3、4、5或6天的时间内给药。在某些实施例中，核酸在数周的时间内以每周一次或多次给药。在其他实施例中，核酸在数周的时间内给药持续一到数月。在多种实施例中，核酸可在数月的时间内给药。在其他实施例中，核酸可在一或数年的时间内给药。通常治疗长度是与疾病过程的长度、所用疗法的效果以及要治疗的受试者的情况和反应成比例的。

有益效果

本发明通过针对siRNA的设计改进，获得了SEQ ID NO：1所示的siRNA，该siRNA具有改进的得到了大大提高的抑制效率，通过通过联合使用本发明研究的透膜肽，能够协同提高转染效率，二者联合使用能够使得抑制效果得到大大增强，具有较好的应用前景。

附图说明

图1 siRNA与穿膜肽的结合方式图

图2 细胞毒性结果图

图3 RNA抑制效果图

图4 肿瘤球数目抑制效果图

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1 细胞培养

293T细胞使用DMEM-F12培养基（添加10%的胎牛血清和1%的青链霉素）置于5%CO₂37℃的细胞培养箱内培养，于转染前1d，胰酶消化293T细胞并计数，每孔1*10⁵接种于24孔培养板中，置于细胞培养箱中培养，使其在转染日细胞密度为55%左右。

实施例2 细胞转染及转染效率测定

将实施例1得到的细胞去完全培养基，用PBS洗二遍，Opti-MEM培养基（invitrogen）125ul稀释SEQ ID NO：1的siRNA（标记FAM）和SEQ ID NO：3的透膜肽（上海生工合成），二者混合均匀后静止20min后加入到细胞培养板中，4h后吸去转染培养基，用PBS洗二遍，每孔加入500ul完全培养基后置于5% CO₂、37℃的细胞培养箱培养后即得到转染后的细胞。以LipofectamineTM RNAiMAX转染试剂作为对照，相同条件进行转染，转染试剂与siRNA的比例分别采用1:1、10:1、20:1、25:1。

转染24h，倒置荧光显微镜检测FAM显色并拍照，倒置荧光显微镜计算转染效率：每孔寻找3个代表性视野，各观察100个细胞，计算阳性细胞率，普通视野下计算细胞数为N，相同视野换荧光下计算荧光细胞数为n，转染效率=n/N×100%。采用SPSS13.0统计软件，计算资料以均数±标准差表示，采用方差分析F检验对相关数据资料进行统计处理，多样本均数间的两两比较采用LSD-t检验。结果如表1所示。

表1 透膜肽和LipofectamineTM RNAiMAX转染293T的转染效率

从表1的结果可以看出，随着透膜肽和Lipo剂量增加转染效率增高，而且本发明的透膜肽在1:1的比例下即可达到接近90%的转染效率，具有较好的效果，而当比例达到25:1时，达到了最大转染效率，本发明的透膜肽效率接近100%，这充分说明本发明的透膜肽具有较好的转染效率。

实施例3 细胞毒性检测

按照实施例2方法只加透膜肽转染人H9细胞，转染后24h的各孔细胞胰酶消化后分别吸出，每孔按1×10⁴个细胞接种至96孔培养板置于5%CO2 37摄氏度的细胞培养箱内培养24h，去除96孔细胞板去旧培养，用新鲜DMEM培养基清洗2次，加入10微升CCK-8溶液，继续孵育4h，以未转染细胞为对照孔，酶标仪检测波长为450nm的吸光度，并计算细胞存活率（转染组细胞OD/对照组细胞OD*100%），结果如图2所示，转染24h后，透膜肽对人H9细胞无明显细胞毒性，而Lipo对细胞具有一定毒性，随剂量增加细胞存活率明显下降。

实施例4 肝癌干细胞球的抑制实验

取生长状态良好的Huh7细胞，采用实施例2的转染方法以透膜肽和siRNA（SEQ IDNO：1和2分别进行）按照25:1的比例进行转染。转染后进一步观察了上述转染了携带沉默lncRNA-MUF的核酸的肝癌细胞的肝癌干细胞球的形成情况，同时检测了lncRNA-MUF的抑制情况，从图3可以看出，SEQ ID NO：1比SEQ ID NO：2的抑制效果更好。如图4所示沉默lncRNA-MUF能够显著抑制肝癌干细胞肿瘤球的形成，而且SEQ ID NO：1比SEQ ID NO：2的抑制效果更好。

实施例5 肿瘤抑制实验

1)常规培养所用的对照细胞(转染空白的肝癌细胞)或转染了携带有沉默lncRNA-MUF的核酸的肝癌细胞，扩增足够数量，准备接种。

2)胰酶消化细胞，离心收集后进行细胞计数，用含有20％Matrigel的PBS重悬细胞。一般接种量是0.2ml/只，其中含有4×10⁶个肿瘤细胞。将准备注射的细胞置于冰上。

3)待注射的裸鼠用乙醚进行短暂昏迷，用1ml注射器将细胞悬液打到侧腹部皮下，或者肩背部皮下。每只裸鼠左右两侧分别为对照组和实验组（实验组中透膜肽：siRNA为25:1）。

4)实验裸鼠继续饲养约一个月，定时观察肿瘤变化，如用游标卡尺测量肿瘤体积并记录数值，取出瘤体后测量重量并记录数值，进行统计学分析。

实验结果表明，与对照相比，本发明的SEQ ID NO：1的siRNA沉默lncRNA-MUF能够使得肝癌体内肿瘤形成体积减少95.3%，SEQ ID NO：2的siRNA沉默lncRNA-MUF能够使得肝癌体内肿瘤形成体积减少80.4%，这说明本发明改进的siRNA具有提高的干扰效率。

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。

这样，本领域技术人员将了解在基于本公开时的概念可容易用作设计用于执行本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是权利要求书应被认为是包括此类等效结构至它们不背离本发明的精神和范围的程度。

序列表

<110> 北京瀚梅生物科技有限公司

<120> siRNA和透膜肽联合治疗肝癌的用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

tggattccac acccttcta 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

gccctcgaga agtgtctaa 19

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

Arg Arg Trp Lys Ala Cys Arg Arg Trp Val Ala Asp Arg Lys Ser Arg

1 5 10 15

Ala Arg Arg Trp Pro Leu Pro Gln His Tyr Arg Glu Arg Arg Trp

20 25 30

Claims

1.siRNA以及SEQ ID NO：3所示的透膜肽的组合在用于制备药物中的用途，其特征在于：所述药物用于预防或治疗肝癌，所述siRNA其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于siRNA以及SEQ ID NO：3所示的透膜肽使用时按照25:1重量比来使用。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述药物以注射、口服或灌肠原位给药的方式给药。

4.一种试剂，其特征在于由SEQ ID NO：1所示的siRNA以及SEQ ID NO：3所示的透膜肽组成，使用时二者按照25:1重量比来使用。

5.权利要求4所述的试剂在制备药物试剂盒中的用途，所述试剂盒用于预防或治疗肝癌。