CN114426573B

CN114426573B - 一种Nur77磷酸化衍生肽及其在制备促进胚胎植入的药物中的应用

Info

Publication number: CN114426573B
Application number: CN202011184381.5A
Authority: CN
Inventors: 颜桂军; 孙海翔; 姜瑞伟; 王海滨
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2020-10-29
Filing date: 2020-10-29
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2040-10-29
Also published as: CN114426573A

Abstract

本发明公开了一种Nur77磷酸化衍生肽及其在制备促进胚胎植入的药物中的应用，本发明公开的磷酸化衍生肽序列如SEQ ID NO.1所示，通过小鼠体外胚胎黏附试验和延迟植入小鼠模型中的体内上皮‑胚胎粘附试验，以及分子细胞水平的相关研究，证明此Nur77磷酸化衍生肽可通过促进β3整合素介导的细胞黏附作用，增强子宫上皮‑胚胎黏附作用，从而促进胚胎植入；利用此磷酸化衍生肽制备的药物，可改善妇女不明原因的反复植入失败(RIF)。

Description

一种Nur77磷酸化衍生肽及其在制备促进胚胎植入的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种Nur77磷酸化衍生肽及其在制备促进胚胎植入的药物中的应用。

背景技术

将胚胎成功植入母体子宫内膜是哺乳动物繁殖的关键步骤，成功的胚胎植入需要胚胎附着在子宫内膜上皮上，随后侵入蜕膜化的子宫内膜。在人类中，一个月经周期的自然受孕率约为30％，而胚胎植入失败约占妊娠损失的75％。在人类辅助生殖技术(ART)的治疗中，反复植入失败(RIF)的发生率也达到10％,因此对可促进胚胎植入，预防和治疗不明原因的反复植入失败(RIF)的有效药物有较大需求^[1]。

在卵巢激素作用下，子宫内膜在一段时间内对胚胎具有容受性，称为“植入窗口期”。子宫内膜接受阶段伴有由整合素亚基α1，β1，α4，αv和β3组成的整合素异二聚体的表达在子宫内膜上皮细胞中增加。整合素是广泛表达的细胞表面受体家族，介导细胞与细胞间或细胞与胞外基质的粘附，并且能够在细胞膜上传导双向信号，不明原因的不育症与αvβ3的缺乏有关^[2]。

Nur77(孤儿核受体NR4A1)又称为神经生长因子诱导的基因B(nerve growthfactor-induced gene B，NGFI-B)，是一种细胞核孤儿受体，在多种刺激(包括生长因子)下激活靶基因。我们的前期研究已经证明^[3]，基质细胞中Nur77的缺乏会损害小鼠的子宫内膜蜕膜化，并刺激子宫内膜异位症小鼠的基质细胞纤维化。另外，已有研究证实Nur77通过结合β3-整联蛋白基因的富含GC的近端区域来调节β3-整联蛋白的表达^[4]。在多种细胞类型中发现了Nur77的磷酸化，并且磷酸化调节Nur77的功能，但是尚未确定子宫内膜上皮细胞中的Nur77表达或磷酸化状态是否对上皮-胚胎粘附有影响。

发明内容

本发明涉及一种Nur77磷酸化衍生肽及其在制备促进胚胎植入的药物中的应用，所述磷酸化衍生肽由Nur77的第362～371位氨基酸和一段具有穿透细胞膜功能的氨基酸共同组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其磷酸化位点位于Nur77的第366位苏氨酸，其中，Nur77的第362～371位氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具有穿透细胞膜功能的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，所述磷酸化衍生肽可促进β3整合素介导的细胞黏附作用。

另一方面，本发明还描述了该Nur77磷酸化衍生肽在制备促进胚胎植入的药物中的应用，所述药物还含有药学上可接受的辅料。

进一步的，所述药物可有效改善不明原因的胚胎植入失败(RIF)。

进一步的，所述药物的剂型为注射剂，

进一步的，所述药物可以是速释制剂、缓释制剂、控释制剂的任意一种。

优选的，所述药物的用药方式选择子宫腔内注射。

有益效果

在本发明中，我们公开了Nur77的磷酸化衍生肽以及利用此肽制备的促进胚胎植入的药物，此磷酸化衍生肽可通过促进β3整合素介导的细胞黏附作用，增强子宫上皮-胚胎黏附作用，从而促进胚胎植入；在妇女不明原因的反复植入失败(RIF)等领域有较好应用潜力。

附图说明

图1是Nur77磷酸化衍生肽和非磷酸化衍生肽的序列，其序列中的^p是指在相应氨基酸位置的磷酸化。

图2是利用延迟植入小鼠模型验证Nur77磷酸化衍生肽对上皮-胚胎粘附的促进作用结果，以及对β3-整合素的上调作用。图中A描述了不同处理组小鼠的子宫上皮-胚胎黏附结果，图中B描述了Nur77磷酸化衍生肽对子宫上皮细胞中β3整合素的表达及对“整合素介导的信号传导”基因集的影响。

具体实施方式

通过解释以下本申请的优选实施方案，本发明的其他目的和优点将变得清楚。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限值和下限值之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述的范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限值和下限值可独立地包括或排除在范围内。

实施例1：Nur77磷酸化衍生肽和非磷酸化衍生肽的制备

采用化学合成法中的固相多肽合成法在体外人工合成一段Nur77的第362～371位氨基酸(即Nur77短肽)，其序列如SEQ ID NO.2所示，Nur77短肽的衍生肽则是将366位苏氨酸进行磷酸化修饰得到。为了促进短肽进入细胞内发挥生物学作用，一段具有穿透细胞膜功能的氨基酸(序列如SEQ ID NO.2所示)被融合到Nur77短肽的氨基端，最终产生的Nur77磷酸化衍生肽(简称磷酸化肽)和Nur77非磷酸化衍生肽(简称非磷酸化肽)的序列如图1所示。

实施例2：实施例1的Nur77磷酸化衍生肽体外促进Ishikawa细胞对BeWo细胞球的粘附作用

利用滋养层细胞系BeWo细胞悬浮培养形成BeWo细胞球，直径大小150-200um。利用子宫内膜上皮细胞系Ishikawa细胞贴壁培养形成单层细胞，向细胞培养液中分别加入不同浓度的Nur77磷酸化肽和非磷酸化肽共同孵育24小时后，将100个BeWo细胞球与经衍生肽处理后的各组单层Ishikawa细胞共培养1.5小时，换液弃掉未黏附的BeWo细胞球，显微镜下计数黏附的BeWo细胞数量。

结果如表1所示，与空白对照组相比，磷酸化肽处理后的Ishikawa细胞对BeWo细胞球的黏附百分数显著提高(P<0.05)，并且黏附百分数随磷酸化肽的剂量提高而增加，而非磷酸化肽处理后的Ishikawa细胞对BeWo细胞球的黏附作用无明显影响。

表1：各处理组Ishikawa细胞对BeWo细胞球的粘附百分数(以平均值±标准差表示)

注：黏附分数(％)＝(黏附的BeWo细胞数量/BeWo细胞总数)×100，P值是将磷酸化肽处理组与空白对照组对比计算得出。

实施例3：利用小鼠胚胎黏附的体外模型评价实施例1的Nur77磷酸化衍生肽的促胚胎粘附作用

利用子宫内膜上皮细胞系Ishikawa细胞贴壁培养形成单层细胞，向细胞培养液中分别加入不同浓度的Nur77磷酸化肽和非磷酸化肽共同孵育24小时后，将5个小鼠囊胚与单层Ishikawa细胞共培养24小时，显微镜下评估囊胚与经过不同衍生肽处理的Ishikawa细胞的黏附程度(1-4级)。

结果如表2所示，与空白对照组相比，磷酸化肽处理后的Ishikawa细胞与小鼠囊胚的黏附程度显著提高(P<0.05)，而同样剂量下的非磷酸化肽的处理后的Ishikawa细胞与小鼠囊胚的黏附程度无改善。

表2：各处理组Ishikawa细胞与小鼠囊胚的黏附程度(以中位数表示)

实施例4：利用延迟植入小鼠模型评价实施例1的Nur77磷酸化衍生肽对上皮-胚胎粘附的作用

将8-10周龄的ICR小鼠雌雄合笼，第二天早上8点见阴道栓的雌鼠记为孕1天(D1)，在第4天(D4)上午8点经背侧入路行双侧卵巢摘除术，第5-7天(D5-7)连续3天经皮下给药孕酮(2mg/次)维持胚胎休眠。第7天(D7)孕酮给药后，给予3.75ng雌二醇激活休眠胚胎、启动胚胎植入。给予雌二醇后，经背侧入路行单侧子宫腔注射Nur77磷酸化衍生肽或Nur77非磷酸化衍生肽(每种衍生肽设三个剂量：5、10和20μg/只)，对照组注射生理盐水。宫腔注射12小时后收集双侧子宫进行RNA测序和基因集富集分析(GSEA)，并取小鼠子宫组织进行β3-整合素的免疫组织化学检测；宫腔注射24小时后经尾静脉注射芝加哥蓝染料、检查双侧子宫胚胎植入情况。

结果如图2所示，与生理盐水组相比，Nur77非磷酸化衍生肽的宫腔注射对胚胎植入率仅有轻微促进，没有统计学差异，但是Nur77磷酸化衍生肽的注射显着促进了胚胎植入率(P<0.01)；对各组小鼠子宫基因集富集分析(GSEA)显示，“整合素介导的信号传导”基因集在Nur77磷酸化衍生肽组中明显富集(FDR＝1.43E-4)；免疫组织化学检测结果也显示，Nur77磷酸化衍生肽处理后的子宫上皮细胞中β3-整合素的蛋白表达增加。因此，实施例1中得到的Nur77磷酸化衍生肽可促进小鼠子宫上皮-胚胎黏附作用，此效应可部分归因于其通过促进β3整合素的表达，从而促进β3整合素介导的细胞黏附作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

参考文献

[1]Norwitz,E.R.,Schust,D.J.&Fisher,S.J.Implantation and the survivalof early pregnancy.N.Engl.J.Med.345,1400–1408,2001.

[2]Dey,S.K.et al.Molecular cues to implantation.Endocr.Rev.25,341–373,2004

[3]Jiang,Y.et al.Decreased expression of NR4A nuclear receptors inadenomyosis impairs endometrial decidualization.Mol.Hum.Reprod.22,655–668,2016

[4]Hedrick,E.,Lee,S.-O.,Doddapaneni,R.,Singh,M.&Safe,S.NR4A1Antagonists Inhibitβ1-Integrin-Dependent Breast Cancer CellMigration.Mol.Cell.Biol.36,MCB.00912-15,2016

序列表

<110> 南京大学医学院附属鼓楼医院

<120> 一种Nur77磷酸化衍生肽及其在制备促进胚胎植入的药物中的应用

<130> 2020

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> BINDING

<222> (17)..(17)

<223> Thr被磷酸化修饰

<400> 1

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln Ala Asn Leu Leu

1 5 10 15

Thr Ser Leu Val Arg Ala

20

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 2

Ala Asn Leu Leu Thr Ser Leu Val Arg Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln

1 5 10

Claims

1.一种Nur77磷酸化衍生肽，其特征在于，所述磷酸化衍生肽由Nur77的第362～371位氨基酸和一段具有穿透细胞膜功能的氨基酸共同组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该肽的磷酸化位点位于Nur77的第366位苏氨酸，其中，Nur77的第362～371位氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具有穿透细胞膜功能的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的Nur77磷酸化衍生肽，其特征在于所述磷酸化衍生肽可促进β3整合素介导的细胞黏附作用。

3.根据权利要求1-2任意一项所述的Nur77磷酸化衍生肽在制备促进胚胎植入的药物中的应用，其特征在于所述药物还含有药学上可接受的辅料。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述药物可有效改善不明原因的胚胎植入失败。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述药物的剂型为注射剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述药物是速释制剂、缓释制剂、控释制剂的任意一种。

7.根据权利要求3、4或6所述的应用，其特征在于所述药物的用药方式为子宫腔内给药。